Enzimas

Universidad de los Andes
Facultad de Ciencias
Departamento de Biología
Practica de Biología 10
Luis Manuel Casanova Pino, CI: 23722840
Práctica Nº3 Catálisis enzimática
Introducción
Las enzimas son, en su gran mayoría, catalizadores proteínicos de reacciones químicas; a éstas se le unen los sustratos (compuesto sobre el cual actúa la enzima) en el sitio activo, interaccionan electrostáticamente con los grupo R del sitio activo, reaccionan y salen como productos. Los catalizadores son agentes químicos que modifican la velocidad de las reacciones químicas sin ser consumidos en el proceso, esto lo logran disminuyendo la energía de activación, energía necesaria para romper los enlaces químicos existentes e iniciar la reacción que conducirá a la formación de los nuevos enlaces. Es importante resaltar que existen diversas enzimas, algunas de ellas son las peptidasas (las cuales ''rompen'' enlaces peptídicos) y las oxidorreductasas (oxidan diversos compuestos); todas las enzimas se ven afectadas por factores como temperatura, pH y concentración (Campbell y Reece, 2007; Karp, 2010).
A pesar de que muchas de las reacciones que se llevan a cabo en la célula son exergónicas (es decir que ocurren de forma espontánea y sin aporte de energía) estas tienen la barrera de la energía de activación, la cual debe ser superada. Sin las enzimas las reacciones tardarían años en suceder (y las células requieren la liberación constante de energía para llevar a cabo todas sus funciones) y el calor que sirve como fuente para alcanzar el estado de transición, aceleraría todas las reacciones, hasta las innecesarias y desnaturalizaría muchas de las biomoléculas esenciales para las células. La alternativa a esto es la catálisis, en la cual una reacción química que es energéticamente posible pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinéticamente favorable y sin un aumento drástico de la temperatura. En síntesis, las enzimas son los ''directores'' de las distintas vías metabólicas que usan las células para transformar la energía. (Campbell y Reece, 2007; Karp, 2010).
Objetivo general
Constatar la actividad de diferentes enzimas sobre sus respectivos sustratos
Objetivos específicos
Apreciar el efecto catalítico de la catalasa a diferentes temperaturas y pHs.
Comprobar la capacidad catalítica de la bromelina a diferentes temperaturas .
Observar la capacidad catalítica de la rennina sobre su sustrato.
Materiales y reactivos
Ananas comosus.
Vasos de precipitado.
Peróxido de hidrógeno
Higado de B. primigenius.
Papel de pH
Pinza.
Citrus × limon.
Mechero Bunsen.
Pipetas.
Solanum lycopersicum.
Termómetro.
Propipetas.
Leche y cuajada de B. primigenius
Hidróxido de sodio.
Regla.
Gelatina
Agua destilada.
Vasos de compota
Trípode
Hielo.
Bolsa térmica
Tubos de ensayo.
Bicarbonato de sodio
Mortero.

Métodos
Experimento N°1 Catalasa (peroxidasa)
Parte A (pH)
Se exprime un limón (C. x limón) y se tritura un S. lycopersicum. Después el zumo se filtra y se coloca en frascos de compota separados.
Con la ayuda de una pipeta y una propipeta se extrae 1 ml de cada zumo y se coloca en dos tubos de ensayo.
Se extraen 2 ml de agua destilada y se coloca 1ml en un tubo de ensayo y 1 ml en otro tubo de ensayo. Se extraen 2ml de agua destilada y se vierte en otro tubo de ensayo.
Se coloca 0,09 g de bicarbonato de sodio en un 1 ml de agua destilada y 1.5 g de hidróxido de sodio en 2 ml de agua destilada; el otro tubo de ensayo que sobró con agua destilada no se le agrega ningún soluto.
Se agrega a las cinco soluciones (en sus respectivos tubos de ensayo) pedazos de hígado (de 1 gr) previamente triturados y cortados. En un sexto tubo de ensayo que no contiene ninguna solución, se agrega un trozo de hígado.
Se agrega peróxido de hidrógenos y se mide la columna de burbujas.
Parte B (temperatura)
En un vaso de precipitado de 500 se vierten 200 ml de agua y se colocan a enfriar en hielo por 15 minutos.
Luego en 8 tubos de ensayo se coloca 1 mg de hígado en cada uno. Se ubican 7 de estos en el vaso de precipitado por 5 min, enseguida se extrae un tubo de ensayo, luego se retira el vaso de precipitado junto con los restantes tubos de ensayo y se colocan sobre la llama del mechero en el trípode.
A partir de este momento cada vez que el termómetro indique que la temperatura ha aumentado 10 grados centígrados se extrae un tubo de ensayo. Cada vez que se extraiga un tubo de ensayo, agregar peróxido de hidrógeno y de ser posible medir la columna de burbujas.
Experimento N°2 Bromelina (proteasa)
Se tritura el interior de una A. comosus y se filtra para extraer el zumo. Se toma 2 ml de zumo y se vierte en un tubo de ensayo, el cual es sometido a baño maría por 10 min.
Se mide aproximadamente 1 cucharada de gelatina sin sabor, y se disuelve en 50 ml de agua caliente. 3
Se colocan 3 ml de la solución de gelatina en cada uno de tres (3) tubos de ensayo y a continuación, se agregan los 2 ml de zumo calentado a uno de los tubos, 2 ml de zumo sin calentar en otro y por último, agua destilada en el tercer tubo.
Se posicionan los tres tubos de ensayo en baño de agua-hielo por aproximadamente 15 minutos. Por último se observan los resultados y se interpretan.
Experimento N°3 rennina (peptidasa)
Se agrega cuajo (fuente de rennina) a la leche vertida sobre un vaso de precipitado y se observa el efecto.
Resultados
Acción de la catalasa a diferentes pHs (a cada tubo de ensayo se le agregó H2O2)
Tabla N°1
Tubo de ensayo
Contenido
Solución
pH de la solución
h de las burbujas
N°1
Hígado
Zumo de C. x limon
2-3
1.7 cm
N°2
Hígado
S. lycopersicum
3
5.5 cm
N°3
Hígado
H2O (destilada)
7
6.8 cm
N°4
Hígado
NaCHO3
8
8.2 cm
N°5
Hígado
NaOH
11
0 cm
N°6 (control)
Hígado


3.6 cm

Gráfico N°1: Actvidad de la catalasa:pH en función de la altura de la columna de burbujas.


Acción de la catalasa a diferentes temperaturas (a cada tubo se le colocó H2O2)

Tabla N°2
Tubo de ensayo
Contenido
Tiempo
Grados celsius
h de las burbujas
N°1
Hígado
0 s
1°C
3.5 cm
N°2
Hígado
58 s
11°C
3.9 cm
N°3
Hígado
2 min 5 s
21°C
4.3 cm
N°4
Hígado
4 min 54 s
31°C
4.8 cm
N°5
Hígado
10 min 51 s
51°C
6.3 cm
N°6
Hígado
16 min 2 s
71°C
1cm
N°7
Hígado
26 min 14 s
91°C
1.1 cm
N°8 (control)
Hígado


3.4 cm

Gráfico N°2: Actividad de la catalasa: Temperatura en función de la altura de la columna de burbujas.
Gráfico N°2

Actividad proteolítica de la bromelina
Tabla N°3
Tubo de ensayo
Calentado
Solución
Baño de agua hielo por quince minutos

N°1

Se calentó
Solución de gelatina y zumo de A. comosus

Gelificó completamente

N°2

No se calentó
Solución de gelatina y zumo de A. Comosus

No gelificó del todo

N°3

No se calentó
Solución de gelatina y agua destilada

Gelificó completamente

Actividad proteolítica de la rennina
Al principio cuando se agregó el cuajo sobre la leche no sucedió mucho, sólo unos diminutos grumos. Al cabo de un rato se aumentó la cantidad de cuajo y una buena parte de la leche cuajó.
Discusión de los resultados
Cuando se agregó peróxido de hidrógeno a los tubos de ensayo con hígado y soluciones a distintos pHs, la mayoría hizo efervescencia, es decir, liberaron oxígeno. Esto tiene sentido ya que el hígado es rico en peroxisomas, los cuales a su vez tienen enzimas oxidoreductasas como la catalasa; la catalasa oxida el peróxido de hidrógeno dando como resultado agua y oxígeno molecular (las burbujas de la efervescencia): Catalasa +2H2O2 2 H2O + O2 (Campbell y Reece, 2007; Karp, 2010).

No todas las soluciones (cada una con su fuente de catalasa) liberaron la misma cantidad de oxígeno ya que la altura de columna de burbujas varió en los distintos tubos de ensayo (ver tabla N°1 en la sección de resultados). Relacionando los distintos niveles de pH con las diferentes alturas a la cuales llegó el oxígeno liberado en la reacción de las distintas soluciones, se pudo construir una función, cuyo gráfico de pH en función de altura nos muestra la actividad de la catalasa. En el gráfico N°1 se puede observar la actividad catalítica de la enzima (catalasa) y se observa que la actividad fue alta entre pHs de 7.6 y 8 , estando el máximo de la curva entre esos dos valores, más específicamente en 7.8 (el pH más óptimo); a pHs superiores la curva empezó a decaer paulatinamente hasta que en 11 (pH) sencillamente alcanzó 0 altura el oxígeno, es decir que no hubo actividad enzimática apreciable (probablemente la fuerte alcalinidad desnaturalizó a la enzima); por otro lado a pHs muy ácidos (2) la actividad fue bastante inhibida (debido al poco oxígeno que se liberó). Por último, es lógico que el pH haya afectado a la enzima, ya que este no es más que la presencia en mayor o menor cantidad de iones hidroxilo (OH-) y protones (H+), los cuales si no se encuentran a niveles óptimos para la enzima modifican las cargas de los péptidos que forman el sitio activo de la enzima, eso por supuesto altera su estructura tridimensional (Karp, 2010).

En el caso del hígado (fuente de catalasa) sometido a diferentes temperaturas, a medida que el tiempo fue aumentando y por ende la temperatura (ver tabla N°2 en resultados), la liberación de oxígeno también fue en aumento; según Campbell y Reece (2007) esto se debe a que la energía cinética de los sustratos aumenta y por ende colisionan con mayor frecuencia con el sitio activo. Relacionando la temperatura con la altura del oxígeno liberado, podemos deducir la actividad de la enzima; en el gráfico N°2 se puede observar que la actividad fue alta entre 40 °C y 51°C, alcanzando su máximo valor (temperatura óptima) en 49°C; sin embargo según Fersht (1980) la temperatura óptima de la catalasa está entre los 37°C y los 40°C, siendo probable que el tubo de ensayo que alcanzó los 51°C no presentara esa temperatura en el momento que se le retiró del calor al cual estaba siendo sometido (debido a que pasó mucho tiempo entre el intervalo en el cual fue retirado y medida la altura de las burbujas, de forma que se enfrió) o sencillamente el hígado no tenía la misma temperatura que el tubo de ensayo; otra posibilidad es que los datos obtenidos sean correctos. A temperaturas superiores a los 51°C la actividad empezó a decaer, presentando escasa actividad entre 71°C y 91°C.


En el experimento de la bromelina (ver tabla N°3 en resultados) cuando se sacaron los 3 tubos de ensayo después del baño de hielo y agua, se observó que la gelatina se había gelificado completamente menos en uno de los tubos de ensayo. Se observó que en el tubo de ensayo en el cual la solución de gelatina no se gelificó totalmente, fue el que contenía el zumo de A. comosus sin haber sido calentado previamente. Esto tiene sentido, ya que esta planta es rica en un enzima peptidasa llamada bromelina, la cual escinde enlaces peptídicos de proteínas; la gelatina al estar hecha de colágeno obtenido del tejido conectivo de animales, sufrió hidrólisis en sus péptidos por parte de la bromelina, motivo por el cual algunas de sus proteínas no lograron mantener su estructura nativa (ya que fueron hidrolizadas) haciendo que no gelificara totalmente Por otro lado el tubo que contenía gelatina y zumo de A. comosus previamente calentado gelificó, ya que muy probablemente al ser sometido a altas temperaturas desnaturalizó a la bromelina presente en el zumo, interrumpiendo así su función. Por último se observó que el tubo que contenía la solución de gelatina y el agua destilada estaba totalmente gelificado ya que el agua no tiene ninguna peptidasa que le impida mantener la estructura de gel a la a la gelatina (Campbell y Reece, 2007; Fersht, 1980; Karp, 2010).

El cuajo es una sustancia rica en una enzima peptidasa conocida como rennina o quimiosina y se puede obtener del cuarto estomago de terneros jóvenes (o cualquier mamífero rumiante), aunque también puede ser sintético; su función es cuajar la leche para mejor absorción. Según Campbell y Reece (2007) cuando hay demasiado sustrato puede que la enzima se sature y por consiguiente se ralentice la velocidad de reacción, esto es lo que pudo haber pasado al principio, que se agregó una cantidad insuficiente de enzima a la leche y por ende la rennina se saturó, disminuyendo su capacidad catalítica, sin embargo esto se solucionó agregando más cuajo (mayor cantidad de enzima). Que algunas de las partes de la leche se hayan solidificado (cuajado) se debió a la acción de la rennina, la cual hidroliza enlaces de aminoácidos específicos de la caseína (proteína presente en la leche), separándola en un fragmento soluble (suero de leche) y otro insoluble; el insoluble (paraceseína) precipitó y quedó depositado al fondo del vaso de precipitado (Bernall et al., 2004).

Conclusiones
El pH y la temperatura afectan la actividad enzimática.
La catalasa es óptima a pHs con leve alcalinidad (entre 7,6 y 8).
La capacidad catalítica de la catalasa se ve considerablemente reducida a un nivel de pH de 2.
La catalasa se desnaturaliza y cesa su función a pH de 11 (fuerte alcalinidad).
La catalasa se ve afectada de forma negativa a temperaturas superiores a los 51°C.
La catalasa libera oxígeno cuando se le agrega peróxido de hidrógeno.
El hígado tiene catalasa.
La bromelina se desnaturaliza a temperaturas elevadas y por ende se interrumpe su actividad.
La bromelina sin desnaturalizar hace que la gelatina no gelifique.
La A. comosus tiene bromelina.
El cuajo tiene rennina.
La rennina solidifica parte de la leche (hace que cuaje).
Una cantidad insuficiente de rennina hace que no cuaje buena parte de la leche.

Referencias
Bernall, S.B., Gallegos C.B., Ibarra, I., Torres, T.F., Huerta, R., Madrid, E. & López, A. (2004). Introducción a la tecnología de alimentos (2 ª ed.). México: Limusa Noriega Editores.
Campbell, N.A. & Reece, J.B. (2007). Biología (7 ª ed.). Madrid: Editorial Médica Panamericana.
Fersht, A. (1980). Estructuras Y Mecanismo De Las Enzimas (1 ª ed.). Barcelona: Editorial Reverté S.A.
Karp, H. (2010). Biología celular y molecular (6 ª ed.). México: McGraw- Hill.
























Temperatura [°C]
Altura [cm]
pH
Altura [cm]