El ADN Mitocondrial como Indicador de Relaciones Biológicas entre Poblaciones Antiguas y Actuales del NOA

CAPÍTULO 13 El ADN Mitocondrial como Indicador de Relaciones Biológicas entre Poblaciones Antiguas y Actuales del NOA Josefina M. B. Motti, Virginia Ramallo, Marina Muzzio, Graciela Bailliet y Claudio M. Bravi

INTRODUCCIÓN Los avances en las técnicas de análisis molecular han permitido la extensión de los estudios de ADN a muestras antiguas de carácter arqueológico. La incorporación de esta técnica provee un nuevo tipo de caracteres para comparar la diversidad biológica intra e interpoblacional. La obtención de mayor cantidad y mejor calidad de datos para muestras actuales constituye, en nuestra opinión, un marco de referencia indispensable para los análisis de ADN antiguo. En este trabajo se presentan nuevos datos de haplotipos de ADN mitocondrial (ADNmt) de origen nativo correspondiente a poblaciones actuales del noroeste argentino (NOA) y centro-oeste argentino (COA), y se hace especial énfasis en la comparación con datos ya publicados para muestras antiguas de la misma región. De esta manera, la información actual contribuye a discutir procesos poblacionales prehispánicos e históricos y es orientativa respecto de la dirección de futuros trabajos en ADN antiguo.

Antecedentes

El sitio Las Pirguas de la localidad arqueológica Pampa Grande (PG), ubicado en el sur de la provincia de Salta, Argentina, está formado por una serie de enterratorios en los que fueron recuperados 120 esqueletos. Las asociaciones culturales permiten asignar la ocupación a la cultura Candelaria, con un fechado radiocarbónico en 1310 años AP (Carnese et al. 2010). El estilo Candelaria se caracteriza, entre otros rasgos culturales, por el entierro de adultos y niños en urnas, el uso de pipas y la representación plástica de figuras zoomorfas en la cerámica. La presencia de estos elementos fue interpretada como indicio de vinculación cultural con las florestas tropicales (González 1963) en un esquema Avances Recientes de la Bioarqueología Latinoamericana, 2014. Editado por L. Luna, C. Aranda y J. Suby: 267-283. Buenos Aires, GIB. ISBN XXX-XXX-XXXX-X-X.

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interpretativo que supone el desarrollo cultural del NOA como una sucesión de influencias andinas y amazónicas. Esta visión es criticada por Scattolin (2006) al considerar que constituye un sistema de pensamiento dicotómico que reduce la variabilidad cultural a las categorías de andino/amazónico, alto/bajo, masculino/femenino, superior/inferior, complejo/simple. No es nuestro objetivo ahondar en esta discusión; sin embargo, consideramos pertinente esquematizar las visiones acerca de la cultura Candelaria, en tanto constituyen un marco interpretativo que genera expectativas respecto de las posibles relaciones biológicas que involucran a la población de PG. Los Amarillos (LA) es un sitio arqueológico de 700 años de antigüedad ubicado en la quebrada de Humahuaca, correspondiente al Período de Desarrollos Regionales II (Nielsen 2001). En la quebrada, este lapso se caracteriza por el estilo cerámico Isla, diferente del estilo Yavi encontrado en la Puna, pero que comparte con éste la condición de no haberse visto influenciado por el estilo Aguada, que se extendió en el Período Medio entre las actuales provincias de Salta y San Juan, y que constituyó el mayor momento de integración regional en el NOA. Por ello se supone a Yavi-Isla como una esfera de interacción independiente de las unidades políticas ubicadas más al sur, que estaría indicando una mayor relación entre los habitantes de la quebrada y la Puna (Mandrini 2008). En el presente trabajo tomamos como objeto de estudio tres conjuntos poblacionales que se diferencian por su separación temporal. Las muestras correspondientes a PG tienen una antigüedad de ~1300 años, mientras que las muestras correspondientes a LA tienen ~700 años. Un último conjunto mucho más numeroso y difícil de delimitar espacialmente corresponde a 1108 muestras de doce localidades actuales del NOA y COA que permanecen inéditas (Motti 2012), así como otras de Argentina y del resto de Sudamérica tomadas de la literatura. Para facilitar la lectura de colegas ajenos a la disciplina, procederemos previamente a establecer la definición de ciertos términos específicos del léxico de la genética molecular y a repasar el estado de conocimiento respecto de la variabilidad del ADNmt en América.

Algunos conceptos operativos

La mayoría de los animales diploides de reproducción sexual cruzada heredan aproximadamente la mitad de su material genético de cada uno de sus padres, con la sola excepción del ADNmt, que es transmitido únicamente por las madres. El ADNmt se localiza en el interior de las mitocondrias, tiene un tamaño relativo muy pequeño, y acumula mutaciones con mayor velocidad que el ADN nuclear. El de Homo sapiens fue el primer ADNmt en ser conocido en forma íntegra. Una versión corregida de la primera secuencia completa obtenida

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recibe el nombre de Secuencia de Referencia de Cambridge revisada (SRCr) y es empleada como patrón contra que comparar y anotar las variaciones encontradas en cualquier otra secuencia (Andrews et al. 1999). El ADNmt humano es una doble cadena circular de 16569 pares de bases (pb) en la que es posible distinguir una gran región codificante, que ocupa el 93% de su longitud, de una región control de 1121 pb. Esta última tiene una tasa mutacional más elevada que la región codificante y por ello ha sido preferencialmente analizada en estudios evolutivos, forenses y de genética médica. Es importante resaltar que dentro de la región control se diferencian dos zonas intercaladas ampliamente conservadas que separan a otras tres de mayor tasa mutacional denominadas regiones hipervariables. La región hipervariable I (RHV-I) comprende al menos los sitios entre las posiciones 16024-16365, la RHV-II se expande entre las posiciones 73 y 340 y la RHV-III entre 438 y 576 (Lutz et al. 1998). Más allá de las discusiones en torno a la tasa de mutación (véase por ejemplo Mishmar et al. 2003; Kivisild et al. 2006; Soares et al. 2009), el ADNmt presenta algunas claras ventajas como herramienta de investigación. Una de ellas es el alto número de copias por célula, ya que mientras que para cada gen o segmento del ADN nuclear existen sólo una o dos copias, para el ADNmt se pueden hallar, según el tipo celular de que trate, desde algunas decenas hasta pocos miles. Esta característica convirtió al ADNmt en uno de los pocos materiales genéticos capaces de ser recuperados de restos antiguos o mal preservados, y por lo tanto un locus muy analizado en estudios paleogenéticos durante las últimas dos décadas. Aunque los recientes avances en nuevas tecnologías de secuenciación han abierto el campo de los estudios de ADN antiguo a secuencias nucleares, el ADNmt continúa siendo un marcador muy empleado por diversas razones. La herencia exclusivamente materna, por otra parte, permite la aplicación del método cladístico, que tiene la virtud de construir agrupaciones jerárquicas fundadas en una hipótesis evolutiva en la que los grupos se definen por la presencia de caracteres compartidos que han sido heredados de un ancestro común. En el caso del ADNmt, los caracteres a comparar son los nucleótidos que por su repetición sucesiva determinan una secuencia. Cada individuo posee una única versión de esta secuencia, heredada exclusivamente por vía materna y por lo tanto en condición haploide, de allí que reciba el nombre de haplotipo. Dos haplotipos se consideran distintos si difieren en al menos una posición de su secuencia. Un conjunto de haplotipos que comparten una serie de mutaciones que habrían estado presentes en un ancestro común se denomina haplogrupo (hg). Los hgs se nombran con letras mayúsculas del alfabeto latino, o mediante la combinación de letras y números alternados. Para una versión periódicamente actualizada de la nomenclatura de los clados del árbol mitocondrial humano favor de referirse a www.PhyloTree.org (van Oven y Kayser 2009).

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Del poblamiento continental a los poblamientos regionales

Los estudios iniciales de baja y media resolución en la década de 1990 dejaron en claro que los linajes maternos presentes en poblaciones nativas de América eran asignables a cinco hgs denominados A, B, C, D y X (Torroni et al. 1993; Bailliet et al. 1994; Forster et al. 1996) y que éstos representaban apenas una fracción de la diversidad existente en las poblaciones del nordeste asiático. La cantidad y calidad de información sobre variación en secuencias de ADNmt acumulado desde entonces, especialmente en la forma de genomas mitocondriales completos, permitió refinar la filogenia de los clados mitocondriales americanos. Hay un amplio consenso sobre la existencia de al menos trece linajes fundadores, ocho de los cuales tienen distribución pan-continental (A2, B2, C1b, C1c, C1d, C4c, D1 y D4h3a), mientras que otros cinco (D2a, D3, D4e1c, X2a y X2g) están restringidos a poblaciones de América del Norte (Bandelt et al. 2003; Tamm et al. 2007; Achilli et al. 2008; Perego et al. 2009; Malhi et al. 2010; Perego et al. 2010; Kumar et al. 2011). La comparación de los linajes presentes en América con los clados hermanos disponibles en Asia facilitó la definición de la composición nucleotídica de los haplotipos fundadores a nivel de secuencias mitocondriales completas. Conocer la secuencia fundadora de un clado es una herramienta indispensable a la hora de analizar la variación encontrada en una secuencia determinada. Todo haplotipo mitocondrial, antiguo o actual, se diferenciará del haplotipo fundador por la acumulación secuencial de mutaciones a lo largo del tiempo, cuyo análisis a diferentes escalas geográficas y/o temporales permite recuperar información sobre diferentes procesos evolutivos. La compilación y análisis de los varios miles de secuencias mitocondriales de origen nativo publicadas para poblaciones indígenas, mestizas, cosmopolitas y/o afrodescendientes de diferentes países americanos ha puesto en evidencia la existencia de grupos de secuencias que comparten una o varias mutaciones que permiten considerarlos como grupos presuntamente monofiléticos. Esta presunción se refuerza cuando la distribución de estos clados está geográfica o étnicamente restringida. Para los Andes sud-centrales de Perú, Bolivia y norte de Argentina y Chile, por ejemplo, varios estudios coinciden en señalar la existencia de una serie de linajes del hg B2 con frecuencia relativamente alta en poblaciones locales cuya distribución refleja una herencia biológica regional común (Gayà-Vidal et al. 2011; de Saint Pierre et al. 2012a; Cardoso et al. 2013). Aunque los análisis filogeográficos1 de alta resolución de linajes maternos de origen americano a nivel regional o continental son aún escasos, algunos ejemplos publicados ilustran el potencial que tienen estos estudios. Para América del Norte, por ejemplo, Cui et al. (2013) describen secuencias completas pertenecientes a los sub-hgs A2ag y A2ah presentes tanto en restos de unos 5000

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años de antigüedad como en indígenas actuales de British Columbia, Canadá. Para Sudamérica, por otra parte, se han descripto numerosos sub-hgs de distribución restringida al Cono Sur como B2i2, C1b13, C1d1b, C1d1e, D1g, D1j y D4h3a5 (Perego et al. 2010; Bodner et al. 2012; de Saint Pierre et al. 2012a y b). Algunos de estos clados -como el D1g- están muy diversificados internamente, reflejando su gran antigüedad en el área, en tanto que para otros -como el D1j- la profundidad temporal es además atestiguada por su hallazgo en restos de ~4500 años AP (García et al. 2012).

MATERIAL Y MÉTODOS Los datos de ADN antiguo

Se analizaron las secuencias publicadas para muestras antiguas de PG (N=19, Carnese et al. 2010) y LA (N=18, Mendisco et al. 2011), en ambos casos segmentos de unos 360 pb de la RHV-I. Se consideraron las mutaciones derivadas que se agregan a las nodales para cada clado y en base a éstas se identificaron linajes (tabla 1). Se define a un linaje como un conjunto presuntamente monofilético de haplotipos caracterizado por la presencia compartida de una o más mutaciones. Se utiliza este concepto de carácter preliminar, en vez del de sub-hg, en ausencia de secuenciación completa del genoma mitocondrial o al menos de tipificación de mutaciones específicas. Los linajes son designados mediante una notación que incluye el nombre del hg seguido de un subíndice en que se lista(n) la(s) mutación(es) que lo diferencian respecto del haplotipo fundador. En todos los casos aquí descriptos las mutaciones son transiciones y solo se señala la posición involucrada. Cuando la mutación elimina una variante que es parte de la definición del haplotipo nodal se indica con el símbolo ‘@’.

Las muestras actuales

Se obtuvieron muestras biológicas e información genealógica de 1787 individuos en hospitales y centros de salud de las provincias de Mendoza, San Juan, La Rioja, Catamarca, Salta y Jujuy. Mayores detalles sobre el muestreo y un análisis del origen continental de los linajes maternos hallados pueden encontrarse en Motti et al. (2013). La región control completa entre las posiciones 16024 y 576 del ADNmt fue secuenciada para un total de 1183 individuos, 1108 de los cuales resultaron asignados a hgs americanos y son los que constituyen la muestra actual de NOA y COA del presente trabajo. La ubicación geográfica de

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Figura 1. Ubicación geográfica y número de muestras correspondientes a las localidades discutidas en el texto.

las localidades estudiadas y el número de muestras correspondiente a cada una pueden observarse en la figura 1. Se realizó una búsqueda de cada linaje en una base de datos de secuencias mitocondriales publicadas de origen nativo americano que reúne más de 6000 secuencias, cada una de las cuales está asociada a una localidad y grupo étnico. Esta información fue analizada para establecer el rango de distribución étnico/geográfica de cada linaje definido. En los casos en que se indican porcentajes, éstos son en relación a la totalidad de secuencias A-D para cada localidad, provincia o región. RESULTADOS En los diecinueve individuos de PG se detectaron nueve haplotipos, tres de los cuales estuvieron presentes en seis muestras y fueron portadores de las secuencias nodales para los hgs A2, B2 y D1 (haplotipos 1, 4 y 11 en tabla 1). Los seis haplotipos restantes (haplotipos 6, 7, 8, 9, 12 y 13 en tabla 1) permitieron definir cuatro linajes. En los dieciocho individuos de LA se informaron seis haplotipos, la mitad de los cuales reúnen once muestras y son, al igual que en PG, indistinguibles de las secuencias nodales para A2, B2 y D1. Las siete muestras restantes, repartidas en tres haplotipos, permitieron definir idéntica cantidad de linajes (haplotipos 2, 3 y 10 en tabla 1).

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Los únicos haplotipos compartidos entre las poblaciones antiguas son aquellos que llevan las secuencias nodales para A2, B2 y D1, que reúnen diecisiete individuos, o el 46% del total. Dos de los siete linajes identificados en las muestras antiguas, A216125 y D116287, no fueron hallados en las muestras actuales del NOA y COA ni en el compilado de más de 6000 secuencias de Sudamérica. El linaje D116129, correspondiente a dos individuos de PG, no fue hallado en Argentina pero ha sido descripto en Bolivia y Perú, mientras que los cuatro linajes restantes (A216111@, C1b16189-16311, B2b2 y B216142) fueron identificados en muestras actuales del NOA y COA. A continuación se presentan los resultados referidos a la distribución actual de los linajes hallados en PG y LA y luego se hace una consideración general de la distribución de aquellos que, pese a ser frecuentes en la población actual, no fueron identificados entre las muestras antiguas.

Linajes hallados en Los Amarillos

Con una frecuencia del 28%, el linaje A216111@ representa el segundo haplotipo más frecuente en LA luego de aquel que lleva la secuencia nodal para el hg A2. Es bien conocido que una reversión al alelo SRCr en posición 16111 -la mutación que define este linaje- es homoplásica dentro del hg A2. A modo de ejemplo, basta citar que en una reconstrucción de las relaciones filogenéticas entre 90 secuencias mitocondriales completas esta mutación se infiere como recurrente al menos cinco veces (ver figura 2 en Achilli et al. 2008). En nuestra compilación fue detectada en muestras de Colombia, Brasil, Bolivia y Perú (Alves Silva et al. 2000; Fuselli et al. 2003; Bert et al. 2004; Feio dos Santos et Hg

Haplotipo (+16.000)

PG

LA

A2

1

111 223 290 319 362

2

7

Linaje -

A2

2

223 290 319 362

-

5

A216111@

A2

3

111 125 223 290Y 319 362

-

1

A216125

B2

4

183C 189 217

1

-

-

B2

5

182C 183C 189 217

-

1

-

B2

6

142 182C 183C 189 217

1

-

B216142

B2

7

145 156 157 183C 189 217

2

-

B2b2

B2

8

145 156 157 182C 183C 189 217

1

-

B2b2

B2

9

145 156 157 183C 189 217 278

4

-

B2b2

C1

10

183C 189Y 223 298Y 311 325 327

-

1

C1b16189-16311

D1

11

223 325 362

3

3

-

D1

12

129 223 325 362

2

-

D116129

D1

13

223 287 325 362

3

-

D116287

Tabla 1. Haplotipos y linajes en muestras antiguas del NOA.

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al. 2006; Ribeiro dos Santos et al. 2007; Afonso et al. 2010; Díaz-Matallana y Martínez-Cruzado 2010; Yang et al. 2010; Barbieri et al. 2011; Taboada-Echalar et al. 2013), mientras que para Argentina ha sido descripta para indígenas de Río Negro y Formosa, así como en la población cosmopolita de Jujuy, Tucumán, Santa Fe, y Corrientes (Ginther et al. 1993; Cabana et al. 2006; Tamm et al. 2007; Bobillo et al. 2010; Catelli et al. 2011; Cardoso et al. 2013). Por todo lo dicho, esta mutación no puede ser tomada por sí sola como indicador de ancestralidad común a escalas geográficas amplias. Con respecto a la región que nos interesa, esta mutación fue hallada en La Quiaca (N=4; 2%), en Santa María (N=1;