Efectos locales inducidos por el veneno de la serpiente coral Micrurus nigrocinctus en ratón blanco

Taalcoe . VoL I8, pp. 633-039. Ptea~ Ltd. 1980 . l'tinoed

m

0011-0101/80/1101-0633 502.00/0

in t3teat Hritaia

EFECTOS LOCALES INDUCIDOS POR EL VENENO DE LA SERPIENTE CORAL MICRURUS NIGROCINCNS EN RATbN BLANCO J. M . GLrrL ~Rp? F . CHAVES, ERMILA ROJAS y R. BoLAf~os Instituto Clodomiro Picado, Facultad de Microbiologie, Universided de Conta Rica, Ciudad Univeraitaria Rodrigo Facio, Conta Rica (Aceepttd for publication 27 Juni 1980) J. M . GUTfÉRRPZ, F. CLLAVes, E Rotfis y R. Bo1.~Aos. Local effects induced by Mfcnvus nigrocinctus venom in white mice. Toxicon 18, 633-639, 1980.-The venom of the coral snake, Micrwus nigrocinctus, from Costa Rica produces a myonecrotic effect in the white mouse . Experimental inoculation induces histologitxl necrosis ofthe skeletal muscles, which becomes evident a few min after inoculation. This activity was wnfirmed by high levels of the enzyme creatinephosphokinase (CPK) which reach maximum levels 3 hr after inoculation, descending to near normal values at 24 hr. An infiltrate rich in polymorphonuclear neuttophils was present, reaching a maximum at 24-48 hr. One or two weeks after inoculation, the histologicel picture was of necrotic and regenerative tissue, fibroblasts and exudative cells of a mononuclear type. There were no vascular alterations nor hemorrhagic effects and the Kondo skin test in mice was negative. Furthermore, the venom produced little edema at We inoculation site and a weak proteolytic ~cet on casein.

INTRODUCCION LAS SERIIENTES de cobal constituyen un complejo grupo zooltSgico con m>ls de 50 especies ubicadas en los géneros Micrurus, Leptomicrurus y Micruroides (RozE, 1970 ; HOGI? y RoMANO,1971) . Los venenos de entas serpientes han sido clâsicamente caracterizados por su

efecto neurotôxioo (RosENFEL,q 1971 ; JLMf~vFZ-PORRAS, 1973). También se ha descrito una profunda depresiôn cardiovascular a consecuencia de inoculaciones experimentales de veneno de Micrurus fulvius (RAMSEY et al., 1972) y M. frontalis (BRAZIL et al., 1978) . Los informes clinicos seiïalan, a su vez, que estos venenos no provocan alteraciones en el sitio de la mordedura, tales como edema, hemorragia y necrosis (RUSSELI, 1967 ; ROSENFELD, 1971 ; JIMÉNFZ-PORRAS, 1973), sunque MOUSSATCHÉ ét al . (1976) comunicaron que dos &acciones del veneno de Micrurus nigrocinctus de Costa Rica originan hemorragias a nivel pulmonar e intestinal en ratones. Ademtis WEts y McIsAAC (1971) describieron un efecto de degeneracibn hialina, sin liberaciôn de mioglobina, al incubar in vitro fibres musculares de rata con veneno de Micrurus fulvius. Por otra parte, en un estudo patolbgico, HOMMA y Tu (1971) demostraron que los venenos de tres especies de la familia Elapidae, Naja naja kaouthia, Bungarus fasciatus y Dendrtxtspis jamesoni, originan un cuadro de necrosis de las fibres musculares de ratôn. En el caso de los venenos de cobra, dicho efecto mionect6tico ha sido estudiado con el microscopio electr(3nico (STRINGER et al., 1971). En el presente informe pretendemos estudiar los efectos locales (mionecrosis, hemorragia y edema) provocados por inoculaciones experimentales en raton de veneno de la coral costarricense Micrurus nigrocinctus, asi wmo la actividad proteolitica de este veneno sobre 633

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J. M. GUTIÉRREZ, F. CHAVES, ERMILA RODAS y R. BOLAI30S

la caseina in vitro. MATERIAL Y METODOS Veneno Se trabajdconuna mezcla obtenida de una gran cantidad de ejemphlres procedentesde todo el territorio de Costa Rica, recibidos en el serpenterio del Instituto Clodomiro Picado . Fueren lionfilizadoa ywnservados a - 70°C hasta su uso. Efecto mloaecrôtico Se dectusron inoculacionea intramusculares (i.m.) de 50 pg de vtneno, en 0~ 1 ml de solucien salina, en el muslo de ratones cuyo peso oscild entre 18 y 20 g. Para obtener muestras de tejido muscular, los ratones se sacrificaron a los siguientea intervaba de tiempo : 15 min, 1, 3, 6, 24 y 48 hr, 7 y 14 dias. Todoa los experimentos ac efectuaron por triplicado. Las muestras fueron fijadas en formalina al 10'/ a temperatura ambiente, lavadas, deshidratadas e incluidas en parafina para su posterior corte y coloracien con hematoxilina y eosina. El anâlisis hiatol6gico se wmplement6 oon Ia determinacien de las nivelea aéricos de )a I"^- TTRO creatinafosfoquitlasa (CFQ), inoculéndose lOpg de veneno a un grupo de 5 ratones en hls mismas condiciones anteriormente descritas ; a Io~ aiguientes intervalos de tiempo se obtuvo un capihu de sangre de la cola de cada raten : 1, 3, 6 y 24 hr . La CFQ se determine colorimEtricamente mediante la medicien de )a creatina formada en la reaccien ADP/foafocreatina (Sigma Technical Hulletin No . 520). Los controles fueron inoculadoa con 0~1 ml de solucien salina i.m . cn amboa tipoa de anâlisis . Efecto hemorrrigico Se emplee la técnica de KONDO et al. (1960~ modificada, asi: inowlaciones intradérmicas de 5, 10 y 20pg, auspendidoa en 0~1 ml de solucien ealiaa, iueron dectuadas en grupos de 5 ratones cuyo peso oacile entre 18 y 20 g. Los animaks ec eacriScaron a )as 4 y 24 hr y sc les removie la piel para observar el érea hemorrégica. Efecto edematizante Se emplee la técaica de YAMAKAWA Ct OI. (1976) . Grupos de 5 ratones fueron inoculados con 30 pg de veneno,en 30 pl de solucien, en )a pata derecha y con 30 pl de solucien saline en Ia pata izquierda. Castro y 24 hr deapués ac sacrificaron y sus patas fluron cortadas y pesadaa en bslan7a analltica . El edema se expresecomo el potcentaje de sumento de peso de la pata inoculada con veneno en relacien con la otra. Efecto proteolkico Se emplee como austrato la caseina (BDH Chemicals Co .) de acuerdo al método de FRIEDRICH y Tu (1971), conaistenteen la incubacien de 0~S mg de veneno con 10 mg de caseina por30 mina 37°C, conposteriordetenciende la reaecidn mediante écido tricloroaoético y lectllra de la deneidad dptica del sobrenadante a 280 nm. Para fines comparativoa se determine la actividad proteolitica del veneno de Bothrops podmani, por poseer un alto decto proteolitico de acuerdo a GIJ'IiÉRREZ y CHAVFS (1980). La actividad proteolitica ae ezpresd como el producto del cambio de abaorbancia en 30 min por 100, dividido por los mg de veneno empleados .

llempo,

horns

FIG . 2. SECUENCIA DE LAS VARIACIONES DE LOS VALORES SÉRICOS DE LA ENZIMA CREATINAFOSFOQUINASA (CFQ). La lines continua represents los valorea en los stones inoculados con 10 pg de veneno de M. nigroctnctus y )a lines discontinue los Valorea en los stones control.

FIG. 1. MIONECROSIS, CON FBRAS DE ASPEGTO MiOLtTICO, 6 hi DESPUÉS DE LA iNOCULACI6N DE SQ /1g DE VENENO DE M. Ai81'OCI1ICtG3 EN MiJSCULO DE RATbN.

Ohsérvese la susencia de efecto hemorrâgico. Hematoxilina-eo~ins.

Efecto local de Veneno de Micnaus CÙADRO 1 . EFECTOS LOCALES iNDUCIDOS POR EL VENENO DE

Efecto Mionecrosis` (magaitud) CFQ en suerot (u .i/litro) Exudado in8amatorio$

63 7

Micnrnrs nigrocinctua

EN RATON

15 min

1 hr

3 hr

6 lu

24 hr

7 dias

leve

intense 4319 (11276) love

intense 9860 (12104) moderado

intense 6405 (t2î152) intenso

inteasa 471 (171) intenso

regeneracidn

; ausente

intenso

En torlos Ios tacos la necrosis fue miolitica. t Promedios de 5 determinaciones ( f S .D .). Valores normales = 160 u.i./litro. $ Constituido por polimorfonucleares neutrdfilos en torlos los tacos, excepto a los 7 dies en que et exudado fue de tipp mononuclear. `

RESULTADOS

El veneno de Micrurus nigrceinctus originb un efecto mionecrôtico evidente mediante examen microscdpico, pese a que dicho cuadro no se reconoce al examinar macroscGpicamente el tejido . La morfologia microscôpica de la necrosis observada fue de tipo miolitico, aunque también se presentaron algunas posas fibres de aspecto wagulatico. Quince min después de la inoculaciôn ya se observaron algunas fibres necrôticas ; dicho cuadro fue sumentando y llegG a ser intenso a las 1, 3, 6, 24 y 48 hr (Fig.1). A partir de las tres horas fue evidente un exudado leucocitario rico en polimorfonucleares neutrôfilos, llegando a su m~ximo grado entre las 24 y 48 hr. En ninglin corte observamos indicios de hemorragia ni de alteraciones vasculares en venas y arteries. La ausencia de efecto hemorragico fue corroborada al no observarse extravasaciGn en ninguno de los experimentos efectuados mediante la técnica de KONDO en piel de raten. Una semana después de la inoculacifin se observb, a nivel histolGgico, un proceso de regeneracibn, con rectos de fibres necrôticas, fibroblastos y un exudado de tipo mononuclear. El cuadro regenerativo se hizo ailn mâs evidente dos semanas después del inbculo. Los controles mostraron llna apariencia histolGgica tipica del mlisculo esquelético. Los niveles séricos de la CFQ se elevaron r~pidamente a partir de la inoculaciôn, obteniéndose un nivel m~ximo a las 3 hr con descenso posterior hanta alcanzar valores cercanos a la normalidad a las 24 hr. Los controles no mostraron elevaciones importantes (Fig. 2 y Cuadro 1). En cuanto al efecto edematizante, 4 hr después de la inoculaci6n se apreciô un edema leve del 19'/~, el cual disminuyb hanta alcanzar niveles de 10'/ a las 24 hr. En cuanto al efecto proteolftico, el veneno de M. nigrceinctus presentd una actividad de 20 unidades por mg (U/mg), lo cual corresponde a un 15~7% del efecto proteolftico del veneno de Bothrops godmani, cuya actividad fue de 144 U/mg. DISCUSION

Los anteriores resultados demuestran que el veneno de M. nigrocinctus provoca 1III efecto mionecr6tico en raten, a juzgar tanto por el an~lisis histol6gico como por la elevacibn de los niveles de CFQ en suero. No obstante, la a11seIICla de efecto hemorrégico y el débil efecto edematizante hace que este veneno no provoque un efecto local evidente como el originado porlas serpientes de lafamilia Viperidae (JIMÉNEZ-PoRRAS,1973 ; Gl1TIÉRREZ y CxnvES,1980). Ya en 1971 WEIS y McIsAAC observaron llna degeneraci6n hialina en fibres musculares de rata cuaddo se incubaron in vitro con veneno de M. fulvius, aunque dicho fenbmeno no se acompaiïG de la liberacibn de mioglobina. El cuadro mionecrGtico provocado por M. nigrocinctus coincide con el inducido por otras especies de elapideos como Naja naja lcaouthia, Bungarus fasciatus y Dendroaspis

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jamesoni (HOMO y Tu, 1971) en et sentido de que es uns necrosis no apreciable mediante observacidn macroscbpica del mlisculo afectado, de apariencia histolGgica tipicamente miolitica y en la coal no hay fenômenos hemorrâgicos ni alteraciones vasculares . En et caso de Naja naja, STRINGER et al. (1971), en un ant£lisis ultraestructural, observaron uns complete lisis de las fibres musculares uns hors después de la inoculaciôn . En et calo de M. nigrocinctus et proceso de mionecrosis también se desarrollt5 m~y râpidamente, a juzgar pot las tempranas alteraciones histolôgicas y po~ la elevacitin de la CFQ a nivelas significativos desde la primer hors. La relativamente fuerte actividad mionecrbtica de este veneno contrasta con su débil efecto proteolitico . Lo anteriorcoincide tambit;n con otros venenos elapideos (SUTHERLAND y COULTER, 1977) y de serpientes marinas (REID, 1973 ; 1975), los cuales provocan un cuadro miott5xico sin presenter actividad proteolitica significantiva y constituye un ejemplo mis de que las toxines responsables de los efectos necrbticos no son necesariamente proteasas y de que los efectos proteolitico, hemorrâgico y mionecrbtico de los venenos no muestran uns correlacitin entre sus respectives magnitudes, tel y como se ha descrito para venenos de serpientes asiâticas, (Tu et a1.,1969), norteamericanas (Tu,1977) y de Costa Rica (GuTI~RRez y cHAV~,19so) . Pes~ a que MOUSSATCHÉ et al. (1976) aprecieron actividad hemorrâgica de dos fraociones d~l veneno de M. nigrocinctus procedente de Costa Rica, en et presente trabajo no observamos ningûn indicio de actividad hemorr~gica ni en piel de ratdn, ni a nival histolôgico en tejido muscular. Otros investigadores tampoco han apreciado efecto hemorr~gico en los venenos de Micrurusfuhrius (EMERY y RUSSELL, 1963), ni en otros elapideos oomo Naja naja, Bungarus jasciatus, Dendroaspis jamesoni (NOMMA y Tu, 1971) y Naja melanoleuca (OHSAKA, 1979). Mediante la técnice de KONDO et al. en piel et Iinico de los venenos estudiados de la familier Elapidae que provoca. hemonagia es et de Ophiophagus hanap (OHSAxA,1979). Sin embargo, BONTA et al. (1970) observaron que los venenos de Naja naja y Naja nigricollis, cuando son aplicados en la superficie d~l puhntin, producer sangrado, existiendo la posibilidad de que las toxines responsables de la reaccit5n en piel no seen las mismas que saran en pulmbn . Agradecimlentos-A nuestros compaileros AeeL RoeLes, ALFeeoo V,Uec~s y ALVnRO FwRes por su valiasa ayuda en el trabajo de laboratorio. A la Dra . OLGA Aaeovo, por au colaboraciGn en el trabajo fotogréSco . A la Dra. Et.s~ PORTILLA por Ia elaboracic5n de los cortes histoldgicoa y a la Sra. Hrr.DA HEteRERA de So~eea por el trabajo mecanogr~fioo . Eata investigacidn fue Snanciada por la Univereidad de Calta Rica y por el Consejo Nacional de Investigaciones Cientißcas y Tecnolbgicas (CONICI'I~ de Costa Rica. REFERENCIAS HONTA, I. T., VAROAFTI(3, H. B., BHAROAVA, N . y Vos, C . J. (1970) Method for study of snake venom inducod hemorrhage. Toxicon 8, 3 . HRAZII, O. V ., PELLeoAIM, F . A. y Dus FONTANA, M. (1978) Pathophysiology of the envenomation produood by Micrun4s frontalis venom. In : Toxins : Aalmal, Plant and Microbial, p. 437 (RosENeeeG, P. Ed.) . Oxford : Pergamon Press. EMERY, J . A . y RusseLL, F. E. (1963) Lethal and hemotrhagic properties of some North American snake venoms. In Venomous and Poisonous Animals and Noxious Plants ofthe Pacjfic Region, p. 409 (ICEAGAN, H . L. y MACFARLANE, w. V., Eds.). Oxford : Pergamon Press. FxIEURICr4 C. y Tu, A. T . (1971) Role of metals in snake venoms for hemorrhagc, esterase and proteolytic activities . Blochem . Pkarmac. 211, 1549 . ; J . M. y Craves, F. (1980) Efectos proteolitico, hariorrégioo y mionecrbtico de los venenos de eerpiaates Gtm $texF costarricenses de los géneros Botkrops, Crotaku y lackesis . Toxicon 18, 315. HoaE, A. R. y Rot~arto, S. A. (1971) Neotropical pit vipers, sea snakes and coral snakes. In : Vereemoua AnimaG and their Yenoms. VoL 2, Venomous Vertebrates, p. 211 (BOcrtEet, W. y Buctciev, E. E, Eds.). New York : Academic Press. HoMMe, M. y Tu, A. T. (1971) Morphology of 1oc81 tissue damage is experimental snake envenomation. Br. .l. exp. Pack. 52, 583 .

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