Diseño, evaluación y validación de un método Presencia/Ausencia para analizar Clostridium perfringens

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“Diseño, evaluación y validación de un método Presencia/Ausencia para analizar Clostridium perfringens” Mariano Gómez - Applus+ Medio Ambiente Santiago de Compostela Manuel Araujo – I.I.A.A. Universidad Santiago de Compostela

Antecedentes 1 Medio Ambiente

El R.D. 140/03 establece "0" (cero) en cien ml como valor admisible para coliformes, E. coli, enterococos y C. perfringens. Si se acepta esto, no cabe duda de que se está en una situación en la que el número de esos indicadores en agua es irrelevante, puesto que el punto de corte, o sea, el valor discriminante, es 1. Esto es obvio, ya que la mera presencia de UNO de esos microorganismos en CUALQUIER volumen de agua, es suficiente para cambiar su calificación. Basándose en esto, es lógico pensar que la metodología analítica amparada por tal R.D., debiera ser la necesaria para dar una respuesta de PRESENCIA/AUSENCIA en un volumen de agua previamente definido

Antecedentes 2

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El R.D. 140/03 sigue propugnando métodos analíticos diseñados para recuentos bacterianos, más propios de épocas en las que se consideraba admisible una cierto número de bacterias indicadoras en agua, que de los tiempos actuales, en los que el propio R.D. establece límites de tolerancia nulos Es más, en el caso de la metodología analítica de referencia para C. perfringens, no sólo mantiene la filosofía de emplear un método clásico de recuento (filtración sobre membrana) en una situación en la que la mera presencia de UN clostridio es determinante, sino que establece el uso del medio m-CP como guía. Este medio, no sólo no tiene ninguna ventaja sobre otros de recuento sino que, por si esto fuera poco, su uso introduce un factor de riesgo innecesario (empleo de vapores de amoniaco) y unos inconvenientes técnicos, posiblemente asumibles en la década de los cincuenta, pero totalmente rechazables a las puertas del siglo XXI

Proyectos desarrollados

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Año 1999: La Xunta de Galicia subvenciona el proyecto : "Diseño de un medio de cultivo y evaluación de la técnica de detección de Clostridium perfringens en agua“. Proyecto PGIDTT00IN01E cuya culminación fue la formulación

de

un

medio

P/A

para

la

detección

del

citado

microorganismo. Año 2003: Se obtuvo número de solicitud de patente para la formulación obtenida: PACp® (nº solicitud de patente P200402323) Año 2005 La Xunta de Galicia subvenciona el proyecto: "Evaluación y validación del medio PACp® para detección de Clostridium perfringens en agua”. Proyecto PGIDIT04TAL043E cuya culminación ha sido la validación del medio mediante un ejercicio interlaboratorio

Por qué de la iniciativa?

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Se planteó este trabajo dirigido al desarrollo de una metodología eficaz y simple para la detección de Clostridium Perfringens en muestras de agua no sólo porque no se disponía de un procedimiento de presenciaausencia para la detección de este parámetro microbiológico, sino también por su importancia como organismo indicador en aguas destinadas al consumo humano. Payment ya demostró que las bacterias esporuladas prácticamente se ven inafectadas por las concentraciones de cloro residual libre. En este sentido, Clostridium perfringens, es probablemente la mejor elección como indicador de la inactivación de ooquistes y virus por cloro, así como un buen indicador de las eficacia del tratamiento de agua.

Objetivos

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Diseñar un medio de cultivo fluorogénico apropiado para la detección de Clostridium perfringens en aguas por la técnica de presencia-ausencia. Analizar la capacidad del medio diseñado para la detección y recuento de C. perfringens en aguas, en relación a otros medios de cultivo, incluido el establecido como guía por el R.D. 140/03. Evaluar la capacidad del medio de cultivo y técnica diseñada para detectar cepas de

Clostridium perfringens en presencia y

ausencia de otros microorganismos acompañantes. Determinar

las

propiedades

(sensibilidad,

especificidad,

selectividad) del medio diseñado para detectar la presencia de Clostridium perfringens en agua sometida a diferentes tipos de tratamiento.

Presentación del PACp®

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Cómo funciona el PACp®

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MUESTRAS DE AGUA

PACp®

INCUBACIÓN AEROBIOSIS 44 ± 1ºC/18 ± 2h

INCUBACIÓN AEROBIOSIS 44 ± 1ºC/18 ± 2h

UV UV C. perfringens

10 ml

NMP

PA

Clostridium sulfito-reductores

100 ml

AGITACIÓN

Evaluación de selectividad y especifidad

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Una vez optimizado el medio PACp® se llevaron a cabo ensayos con cultivos axénicos de cepas de colección y aisladas del ambiente, con el objeto de evaluar la capacidad del medio para detectar de forma selectiva y diferencial Clostridium perfringens. Para ello, se inoculó el medio de cultivo diseñado con diferentes cepas de Clostridium perfringens, otras especies del género Clostridium, y otras bacterias reductoras del sulfito y no reductoras del sulfito pertenecientes a diversas especies y géneros microbrianos.

Evaluación de selectividad y especifidad

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Clostridium perfringens: 20 cepas de colección y 50 cepas aisladas en muestras de agua (muestras con formas vegetativas y muestras con esporas). - Otras especies del género Clostridium (C. difficile, C. sordellii). - Enterobacterias: 20 cepas de colección (Salmonella spp, Proteus spp, Escherichia spp, Citrobacter spp, Enterobacter spp, Citrobacter spp). - Especies del género Enterococcus: 10 cepas de colección (E. faecium, E. durans, E. faecalis). - Especies del género Staphylococcus: 5 cepas de colección (S. aureus, S. epidermidis, S. simulans). - Especies del género Bacillus: 5 cepas de colección (B. cereus, B. subtilis, B. coagulans). - Especies del género Lactobacillus: 10 cepas de colección (L. brevis, L. casei. L. acidophilus).

Metodología analítica Medio Ambiente

El análisis de todas las muestras de agua con el medio PACp® se llevó a cabo bajo dos condiciones de incubación: aerobiosis y anaerobiosis a 37±1°C y 44±1 °C. Se consideraron como un resultado positivo en PACp® la presencia de crecimiento con precipitado negro y fluorescencia azulada tras la irradiación con una lámpara de Wood. La obtención de resultados idénticos con el medio PACp® incubado en aerobiosis y anaerobiosis permite confirmar las conclusiones obtenidas previamente, en el sentido de que la detección de Clostridium perfringens con el método PACp® puede llevarse a cabo con plena confianza cuando la incubación se realiza en condiciones de aerobiosis.

Evaluación de selectividad y especifidad

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Los resultados de estos ensayos permiten concluir que el medio es especifico y selectivo, por cuanto que las cepas de Clostridium perfringens dan una respuesta positiva y las cepas no pertenecientes a la citada especie dan una respuesta negativa. Estos resultados se obtuvieron, tanto en ausencia de flora acompañante, como en su presencia.

Evaluación de la capacidad del medio de cultivo PACp para detectar Cl. Medio Ambiente perfringens en muestras de agua.

Una vez diseñado el medio de cultivo PAcp y la técnica analítica a emplear para la detección de la presencia-ausencia de Clostridium Perfringens, la fase final de trabajo consistió en evaluar la capacidad de esta metodología para detectar estas bacterias en muestras de agua natural sometidas a diferentes condiciones ambientales. Para ello, se analizaron un total de 160 muestras de agua.

Cuantificación

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• El siguiente paso en el desarrollo del método fue estudiar la posible cuantificación de microorganismos utilizando el NMP. • Para ello se utilizaron dos métodos: • Un material de referencia fabricado y diseñado en Applus+ Medio ambiente Alicante • Un ejercicio interlaboratorio para la comparación de metodologías siguiendo la norma ISO 17994:2004 y las directrices de EMAG (European Microbiology Advisory Group). • Los resultados tanto de muestras naturales como los iniciales del ejercicio se presentan a continuación

Laboratorios participantes

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Resultados

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Análisis muestras ambientales

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MUESTRAS DE AGUA

FILTRACIÓN

PACp® 100 ml

Agar TSC

Agar TSCF INCUBACIÓN ANAEROBIOSIS 44 ± 1ºC/21 ± 3h

UV

Lactosa sulfito

INCUBACIÓN AEROBIOSIS 45 ± 1ºC/21 ± 3h

UV

Clostridium sulfito-reductores

C. perfringens

46ºC 46ºC 1818-24 h

C. perfringens

C. perfringens

CONFIRMACIÓN

Resultados muestras ambientales

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Concordancia entre el número de muestras de agua clasificadas como positivas y negativas por cada método. TSC

TSCF

PACp® +

-

+

-

+

135

13

142

6

-

4

8

3

9

Resultados verificación de cultivos

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Verificacion de cultivos positivos y negativos a partir del medio PACp®

Cultivos a partir del medio PACp®

Cultivos confirmados como Cl. perfringens

Type

Nº

Nº

%

Positives

148

139

93.9

Negatives

12

0

0

Análisis de material de referencia Disolución de la pastilla en 20 mL de agua

Material de referencia fabricado en Applus+ Medio Ambiente

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Dilución hasta 1000 mL de agua

Resultado con material de referencia

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2,5 TSC

m CP

Log UFC/100 mL (mCP, TSC)

R2 mCP: 0,71 2

R2 TSC: 0,75

1,5

1

0,5

0 0

0,5

1

1,5

Log NMP/100 m L (PACp)

2

2,5

Ensayos de equivalencia

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La Directiva 98/83/CE establece que los Estados Miembros pueden emplear métodos alternativos siempre que pueda demostrarse que los resultados obtenidos sean al menos tan fiables como los producidos por lo métodos de referencia o guía.

El Real Decreto 140/2003 establece que los laboratorios podrán emplear métodos alternativos, siempre que estén validados o acreditados o se haya demostrado su equivalencia.

Equivalencia entre métodos

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Requisitos de la Norma ISO 17994:2004 (Norma española UNE-EN ISO 17994: criterios para establecer la equivalencia entre métodos microbiológicos): Definir de los microorganismos diana. Participar un grupo de expertos. Describir los métodos analíticos y seguir el procedimiento escrito. Llevar a cabo una “Training” sesión. Participar laboratorios con sistemas de aseguramiento de la calidad. Emplear muestras representativas de amplia área geográfica. Emplear muestras incluidas en el campo de aplicación de ambos métodos: Las muestras naturales son las idóneas. No obstante, no tiene sentido analizar muestras reales de redes de distribución (el doble cero no se puede emplear en el análisis de comparación). Pueden prepararse muestras adecuadas por dilución, enriquecimiento o mezclado de diferentes tipos de agua. Puede resultar apropiado estresar las poblaciones microbiológicas de algunas muestras mediante la aplicación controlada de desinfectantes o por almacenamiento en condiciones de refrigeración.

Requerimientos Norma ISO 17994:2004

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Emplear muestras que contengan suficiente nº microorganismos diana (10 – 30). Las submuestras analizadas por los dos procedimientos deben proceder del mismo envase. Participar un mínimo de 6 laboratorios. Anotar los resultados presuntivos y confirmados. Excluir las muestras con doble cero y las que den resultados incontables. Evaluar los datos: Examen crítico de los datos (identificación de valores rechazables y otras irregularidades). Análisis de datos agrupados por laboratorio, tipo de muestra,… Cálculo de las diferencias relativas básicas, medias, desviaciones estándar, incertidumbres expandidas. Decisión sobre la idoneidad de los datos. Evaluación de la equivalencia de los métodos.

Preparación de muestras de agua superficial

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FILTRACIÓN

10 mL 44ºC /18--24 h 44ºC/18 anaerobiosis

AGUA SUPERFICIAL

1 mL AGAR TSC

DILUCIÓN

REFRIGERACIÓN (24 h)

100 mL 400 mL

1-2L

100 mL

0 10

100

mL

mL

FILTRACIÓN AGAR mm-CP

NMP PACp

Preparación de muestras de agua sometidas a tratamiento de desinfección

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AGUA SUPERFICIAL AGUA EFLUENTE 2º

6 – 12.5 mg Cl2

5L

CADA 1 min TRAS 33-5 min agitación

REFRIGERACIÓN (24 h)

DILUCIÓN

1/5

AGITACIÓN

1/3

AGITACIÓN

l

1/2

5L

m

100

4,5 L AGUA TRATADA 24 h a Tª ambiente

FILTRACIÓN AGAR mm-CP

1/3

10

500 mL

FILTRACIÓN 100 mL

SEDIMENTACIÓN 4ºC/1 ºC/1 h

8 UFC

mL

100

2 UFC

mL NMP PACp

500 mL

30 UFC

44ºC ºC/18 /18--24 h 44 anaerobiosis

60 UFC

500 mL

AGAR TSC

500 mL

500 mL

Nº de tubos o colonias para confirmar Inicio 5 COLONIAS

m-CP

Final

TODOS: si nº de tubos positivos es < 5 SELECCIÓN DE 5 TUBOS AL AZAR: si el nº de tubos positivos es > 5

PACp

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SELECCIÓN DE 1 COLONIA CADA n/5

Confirmación de colonias o tubos positivos m-CP

PACp

Incubación anaerobiosis 35/24 h 35-37ºC 37ºC/24

TSC-Yema huevo

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Incubación anaerobiosis 35/24 h 35-37ºC 37ºC/24

TSC-Yema huevo

Caldo Tioglicolato

Caldo Tioglicolato

Tinción Gram 46ºC /18--24 h 46ºC/18

Lactosa-sulfito

46ºC /2 - 5 h 46ºC/2

Leche-hierro

35ºC /24 h 35ºC/24

Caldo Tioglicolato

Movilidad-nitratos

Lactosa-gelatina

46ºC /24 h 46ºC/24

4ºC/1 ºC/1 h

35ºC /24 h 35ºC/24

sólido

líquido

Reacciones típicas de C. perfringens

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Prueba

Reacción típica de C. perfringens

Tinción Gram

+

Reducción del sulfito

+

Fermentación de lactosa

+

Fermentación tumultuosa de la leche

+

Movilidad

-

Reducción de Nitratos

+

Liquefacción de la gelatina

+

Análisis estadístico: UNEEN ISO 17994 Equivalencia:

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se fundamenta en la diferencia relativa media incertidumbre expandida (U)

Diferencia relativa,

y la

x = ln(ai)-ln(bi)

ai = valor confirmado por el método alternativo en la muestra i bi = valor confirmado por el método alternativo en la muestra i Incertidumbre expandida,

U = ksx =

2s √n

Intervalo de confianza, Límite inferior: xL = x – U Límite superior: xH = x + U

Resultados preliminares equivalencia

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Muestras

X

S

U

X+U

X-U

Interpretación (D = 0,1)

Agua con tratamiento

0,6620

1,2975

0,4903

0,169

1,152

Diferencia positiva

Agua sin tratamiento

- 0,1331

0,9408

0,2975

- 0,431

0,1644

No concluyente

Total

0,1943

1,1615

0,2816

- 0,0873

0,476

No concluyente

Métodos “no diferentes” (Equivalentes): Métodos “diferentes”:

xL > 0 ó

-D < xL < 0

y

0 < xH < +D

xH < 0

No concluyente:

xL < -D y xH > 0 ó bien

xL < 0 y xH > +D

Indiferente:

xL > -D y xH < 0 ó bien

xL > 0 y xH < +D

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