ORIGINALES Diagnóstico molecular del retinoblastoma: epidemiología molecular y consejo genético
116.491
Javier Alonsoa, Itziar Palaciosa, Ángelo Gámeza, Isabel Caminoa, Helena Fraylea,b, Ibis Menéndeza,c, Milica Kontica,d, Purificación García-Miguele, Ana Sastree, José Abelairase, Enric Sarretf, Constantino Sabadof, Aurora Navajasg, Mercé Artigash, José M. Indianoi, Ana Carbonej, Jordi Rosellk y Ángel Pestañaa a
OncoLab. Departamento de Biología Molecular y Celular del Cáncer. Instituto de Investigaciones Biomédicas (IIB) Alberto Sols. CSIC-UAM. Madrid. Instituto Nacional de Cancerología. Bogotá. Colombia. c Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología. La Habana. Cuba. d Institute of Ophthalmology. Belgrado. Serbia y Montenegro. e Unidades de Hemato-Oncología y Oftalmología pediátricas. Hospital Infantil La Paz. Madrid. España. f Unidades de Genética y Pediatría. Hospital Materno-Infantil Vall d’Hebron. Barcelona. España. g Unidad de Oncología Pediátrica. Hospital de Cruces. Baracaldo. Vizcaya. España. h Unidad de Genética. Hospital Virgen del Camino. Pamplona. Navarra. España. i Unidad de Oncología Pediátrica. Hospital de Basurto. Bilbao. Vizcaya. España. j Unidad de Oncología Pediátrica. Hospital Miguel Servet. Zaragoza. España. k Sección de Genética. Hospital Son Dureta. Palma de Mallorca. España. b
FUNDAMENTO Y OBJETIVO: El retinoblastoma, prototipo de cáncer hereditario, puede causar ceguera, por enucleación terapéutica, segundos tumores en pacientes con mutación germinal e incluso muerte si no se trata. El diagnóstico molecular de 213 pacientes a lo largo de 5 años ha conducido a la detección de 106 mutaciones que se analizan desde la perspectiva de la epidemiología molecular y consejo genético. PACIENTES Y MÉTODO: Estudio mutacional (reacción en cadena de la polimerasa, secuenciación y análisis de microsatélites) en pacientes con retinoblastoma procedentes de España, Cuba, Colombia y Serbia. RESULTADOS: Un 45% de las mutaciones analizadas son nuevas y corresponden a mutaciones de tipo de corrimiento de pauta de lectura, cambio de aminoácido o procesado del ácido ribonucleico. Todas las mutaciones sin sentido corresponden a sitios de alta mutabilidad. La tasa de detección de mutaciones en pacientes unilaterales esporádicos es alta (22%). En este grupo de pacientes se detecta una mayor incidencia (p = 0,018) de mutaciones de cambio de aminoácido y procesamiento. España y Francia muestran una incidencia mayor de mutaciones del procesado (p = 0,0003) que Alemania y el Reino Unido, países en los que predominan las mutaciones sin sentido (p = 0,0006). Las mutaciones del procesado se asocian al fenotipo de baja penetración y retraso en la aparición de tumores (p = 0,018). CONCLUSIONES: La incidencia de mutaciones germinales en pacientes unilaterales y las relaciones fenotipo/genotipo analizadas indican la necesidad del consejo genético basado en el diagnóstico molecular temprano. La mejora de las técnicas diagnósticas, la caracterización funcional de mutaciones asociadas a baja penetrancia o expresividad y el estudio del transcriptoma de los tumores son objetivos necesarios para definir mejor la patogenia del retinoblastoma. Palabras clave: Retinoblastoma. Hereditario. Mutaciones. Epidemiología molecular. Consejo genético.
Molecular diagnosis of retinoblastoma: molecular epidemiology and genetic counseling BACKGROUND AND OBJECTIVE: Retinoblastoma, a prototype of hereditary cancer, is the most common intraocular tumor in children and a potential cause of blindness from therapeutic eye ablation, second tumors in germ line mutation carriers, and even death when untreated. The molecular scanning of RB1 in search of germ line mutations in 213 retinoblastoma patients from Spain, Cuba, Colombia and Serbia, has led to the detection of 106 mutations whose knowledge is important for genetic counselling and characterization of phenotypic-genotypic relations. PATIENTS AND METHOD: Mutational study (PCR-sequentiation and microsatellites analysis) in patients with retinoblastoma, from Spain, Cuba, Colombia and Serbia. RESULTS: 45% of mutations, including most of the frame shift (FS), missense (MS) and splicing (SP), were new, while all nonsense mutations (NS) corresponded to hypermutable sites in RB1. Germ line mutations were found in 22% of unilateral sporadic patients. The incidence of SP plus MS mutations in this group of patients was greater (p = 0.018) than in bilateral patients. The frequency of SP mutations was higher (p = 0.0003) in Spain and France than in Germany and United Kingdom, while the incidence of NS mutations was lower (p = 0.0006). SP mutations were associated with the low penetrance phenotype and were also overrepresented (p = 0.018) in patients with delayed retinoblastoma onset. CONCLUSIONS: Mutational scanning of unilateral patients is important for genetic counselling and may help decipher the molecular mechanisms leading to low penetrance or expressivity. The functional characterization of mutations associated with low-penetrance or expressivity phenotypes and the molecular classification of tumors using multiple expression profiling is important for a better understanding of the retinoblastoma pathogenesis. Key words: Retinoblastoma. Hereditary. Mutations. Molecular epidemiology. Genetic counselling. Este trabajo ha sido realizado con ayudas de la Comunidad de Madrid (GR/SAL/0855/2004), Programa Bilateral CITMA-CSIC (Ref. 2003CU0015), y becas de corta duración de la UICC (ICRETT 584/2001 y 1029/2004) para IM y MK. Correspondencia: Dr. A. Pestaña. Departamento de Biología Molecular y Celular del Cáncer. Instituto de Investigaciones Biomédicas (IIB) Alberto Sols. CSIC-UAM. 28029 Madrid. España. Correo electrónico:
[email protected] Recibido el 13-5-2005; aceptado para su publicación el 1-9-2005.
El retinoblastoma (OMIM 180200) es un tumor embrionario de origen retinal, que se presenta generalmente en niños menores de 4 años, y puede ser causa de ceguera e incluso muerte si no se trata adecuadamente. Aunque su incidencia es baja –1 caso entre 15.000-20.000 nacidos vivos– su posibilidad diagnóstica, junto a su frecuente carácter hereditario (en un 40-50% de los casos se transmite con carácter autosómico dominante con alta penetrancia), ha hecho del retinoblastoma un paradigma del cáncer hereditario1. Precisamente, a partir de las estadísticas de edad de aparición (diagnóstico) de los retinoblastomas bilaterales (siempre hereditarios) y unilaterales (en su mayoría esporádicos), Knudson2 aventuró su modelo de 2 pasos (two hits) que tan provechoso ha sido para las ideas actuales sobre el papel de genes oncodepresores en la tumorogenia. El aislamiento ulterior del gen que causa el retinoblastoma (RB1) y su intensivo estudio mutacional han confirmado en buena medida las predicciones del modelo de Knudson: en las formas hereditarias, un alelo mutado se transmite por vía germinal, mientras que el otro alelo se inactiva por mutación somática durante la diferenciación de retinoblastos; en la forma no hereditaria, ambas mutaciones inactivantes tienen carácter somático3. Sin embargo, el desarrollo de metodologías para el diagnóstico molecular del retinoblastoma ha permitido establecer la existencia de mutaciones germinales en cerca del 15% de los pacientes con retinoblastoma unilateral, así como detectar la existencia de portadores sanos y casos de mosaicismo germinal4. Estos pacientes, con un elevado riesgo de transmitir la enfermedad a su descendencia, no pueden distinguirse clínicamente de los casos verdaderos unilaterales esporádicos, con un riesgo ínfimo para su descendencia, mucho más si se tiene en cuenta que la presencia de mutacioMed Clin (Barc). 2006;126(11):401-5
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g.77082G>A (2)
g.59793G>C
g.77000G>C
Intrón
g.59642C>G g.45868T>G g.45867G>T (3) g.45867–68insC
g.764428>G g.76491G>A (2) g.73870G>A
g.45653T>G
g.70330G>A (2)
g.39444A>G P
1
2
3
4 5 6
7
8
9
10 11 12
13 14
16
17
g.162196T>A
18
19
20
g.73789–73790insA
g.56934C>A
g.78159delC g.78238C>T (2) g.78250C>T g.78273G>T
g.64348C>T (7) g.64353C>A g.64357G>T
23
25
27
g.160750T>G g.160790–91insA
g.77047–48GdelGC g.77029–30delAT g.77065–77del13ins4
g.61750–53delAAAT g.61788–89del2ins6 g.61799delC
22
g.156728–156729insT
g.76430–36del7ins9 g.76430C>T (2) g.76460C>T (2)
g.59659-63del5ins18 g.59683C>T g.59695C>T g.59701C>T g.597015delCAGAAC g.59731–2insAC
21
g.153226delA g.153266delA g.153302C>T g.153352–53insA
g.70261C>T
g.45834–35deIAA g.45865delA
g.170407G>A (2) g.170404T>A g.170403G>T
g.150118T>C
g.65374–65375delCA g.65386C>T (4)
g.5493–94insT g.5503–06delAGAG g.5505–06dupGA
Exón
g.156681T>C g.153354delG g.153353G>C
g.162208delC g.162238G>A g.162237C>T (2) g.162248C>A g.162266delC g.173813delG
g.150102delC
Fig. 1. Mutaciones del gen del retinoblastoma identificadas en OncoLab. La descripción de las mutaciones se basa en la secuencia genómica (GenBank L11910.1). Las mutaciones nuevas se identifican en negritas; cuando procede, el número de mutaciones repetidas en la serie se indica entre paréntesis. Las mutaciones se refieren a su localización en intrones y exones del ADNc (NCBI: NM_000321.1). Los exones sombreados corresponden a los dominios A y B de la proteína Rb.
nes germinales confiere un alto riesgo de presentar segundos tumores primarios entre los sobrevivientes de retinoblastoma, con una incidencia del 22% a la edad de 25 años. La mayoría de estos segundos tumores son sarcomas5. Además, los sobrevivientes de retinoblastoma hereditario con mutación germinal tienen un riesgo mayor de experimentar en edades más avanzadas alguno de los tumores epiteliales más frecuentes6. El diagnóstico molecular ofrece un medio seguro y preciso de consejo genético, facilita el descubrimiento de portadores sanos y casos hereditarios entre los pacientes unilaterales esporádicos, y tiene un importante impacto social pese al carácter «raro» de la enfermedad. Este trabajo tiene por objeto analizar, desde la perspectiva del consejo genético y la epidemiología molecular, 106 mutaciones germinales –en su mayor parte publicadas7,8– detectadas en pacientes de retino-
blastoma procedentes de España, Colombia, Cuba y Serbia. En algunas ocasiones en este análisis se incluye las mutaciones de pacientes españoles publicadas por el grupo del Hospital La Fe de Valencia9,10, y se recurrirá a estudios comparativos con las más de 900 mutaciones de RB1 registradas en la base de datos RBGMD11. Pacientes y método El material de estudio es la sangre periférica de pacientes con retinoblastoma remitidos para el diagnóstico molecular por distintos hospitales españoles (principalmente el Hospital Infantil La Paz de Madrid y el Hospoital Materno-Infantil de la Vall d’Hebron de Barcelona) y otras instituciones del extranjero (Universidad Católica Pontificia de Quito, Instituto Nacional de Cancerología de Bogotá, el Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología de La Habana y el Instituto Oftalmológico de Belgrado) con las que tenemos establecidas colaboraciones. El estudio comprende a 213 pacientes distribuidos clínicamente entre 98 bilaterales esporádicos, 22 bilaterales familiares, 83 unilaterales esporádicos y 9 unilaterales familiares.
Resultados
TABLA 1
Mutaciones de RB1 en pacientes españoles, colombianos, cubanos y serbios
Procedencia de pacientes y mutaciones encontradas* España
Hospital La Paz Hospital Vall d’Hebron Resto Total
Pacientes estudiados
Cooperación internacional
Pacientes estudiados
89 (48) 33 (15) 19 (8) 139 (71)
Cuba Colombia Serbia Total
36 (17) 22 (12) 16 (6) 74 (35)
*El número de mutaciones encontradas figura entre paréntesis.
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En la tabla 1 se resume la procedencia de los probandos analizados. Se observa que el Hospital Infantil La Paz y el Hospital Materno-Infantil de la Vall d’Hebron proporcionan más del 85% de los pacientes españoles de este estudio, mientras que Cuba proporciona cerca de la mitad de los pacientes procedentes de los otros países estudiados. En los casos esporádicos con mutación germinal, el estudio mutacional incluye a los progenitores, mientras que en los casos familiares, el estudio se extiende a todos los parientes que se presten a ello. El ácido desoxirribonucleico (ADN) se extrae con procedimientos convencionales y se efectúa un control de calidad mediante electroforesis en geles de agarosa. El estudio mutacional se efectúa mediante la reacción en cadena de la polimerasa secuenciación7, empezando por los exones que frecuentemente son asiento de mutaciones. El estudio se completa con un análisis de microsatélites Rbi2 y RB1.2012, para delimitar microdeleciones intragénicas y establecer, en su caso, el haplotipo familiar. El análisis estadístico incluye ensayos no paramétricos (Mann-Whitney) para rasgos cuantitativos, y la χ2 o el test de Fisher para rasgos cualitativos. En algunos casos, se ha investigado la posibilidad de procesamiento alternativo utilizando la batería de programas NIX disponible en el Human Gene Mapping Project13.
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El estudio mutacional de 213 pacientes de diferente procedencia geográfica, según se especifica en la tabla 1, ha permitido identificar 106 mutaciones que se representan en la figura 1.
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En conjunto, se ha detectado 48 mutaciones nuevas, que representan el 45% de todas las mutaciones encontradas. La mayoría de estas nuevas mutaciones (28 de 48) corresponden a inserciones y/o deleciones con cambio de la pauta de lectura, que originan un codón de parada que da lugar a una proteína truncada. El resto de las mutaciones nuevas se distribuye entre mutaciones de cambio de aminoácido, que afectan a 6 de las 7 mutaciones de este tipo, y mutaciones que alteran sitios de procesamiento, que se detectan en 12 de las 28 mutaciones de este tipo. Finalmente, todas las mutaciones sin sentido, excepto una, son recurrentes y 11 de ellas corresponden a sitios conocidos de alta mutabilidad. En este sentido, destaca la mutación g. 64348C > T (Arg320X) que tiene 40 entradas en la RBGMD y que se ha encontrado en 7 pacientes de este estudio.
TABLA 2
Perfil de mutaciones por tipo de paciente
Hospital La Fe de Valencia9,10. En la tabla 4 se observa que los pacientes procedentes de Alemania y el Reino Unido tienen una incidencia relativa de mutaciones sin sentido muy superior a la de Francia y España, mientras que esta situación se invierte al considerar las mutaciones del procesado. Estas diferencias, que son estadísticamente muy significativas, indican la existencia de un fondo genético, probablemente ligado al diferente origen étnico –centroeuropeo o mediterráneo– de estos grupos poblacionales.
Los distintos tipos de mutaciones encontradas, junto con las microdeleciones observadas con el estudio de microsatélites, se han distribuido de acuerdo a la forma de presentación de los tumores (tabla 2). La tasa de detección media de casos hereditarios (65,4%) con mutación germinal obligada (bilaterales esporádicos y familiares, y unilaterales familiares) es similar a la obtenida en otros estudios14,15. Por otra parte, la tasa de detección en los unilaterales esporádicos es muy alta (22,9%) comparada con el 10-15% observado en otras series y, seguramente, tenderá a disminuir a medida que aumenten los casos estudiados. Otro aspecto a destacar es el mayor peso relativo de las mutaciones del procesado y de cambio de aminoácido en los pacientes unilaterales (12 de 20 [60%]) frente a la preponderancia de las mutaciones tipo sin sentido y de corrimiento del marco de lectura en los pacientes bilaterales (56 de 79) [71%]), cuya diferencia es significativa (p = 0,0183 en el test de Fisher; tabla 3). Perfil de mutaciones en función de la procedencia de los pacientes La disponibilidad de una base de datos de mutaciones, con indicación del país de procedencia de los pacientes, permite comparar la incidencia relativa de los distintos tipos de mutaciones. El análisis se ha centrado en 4 países europeos, de los que se posee un número suficiente de registros para efectuar un análisis estadístico fiable. Para elaborar los datos de España, se ha excluido las mutaciones de pacientes procedentes de Cuba, Colombia y Serbia, y se han incluido 14 mutaciones de pacientes españoles procedentes de publicaciones del grupo del
Distribución del tipo de mutaciones por forma de presentación* Del
Bilateral esporádico Bilateral familiar Total bilaterales Unilateral esporádico Unilateral familiar Total unilaterales Todos
4
CM
18 9 27 3
4 5
CA
3
3 3 1 5 3 4 9 (8,5) 30 (28,3) 7 (6,6)
SS
PR
Mutación identificada
22 18 65 5 2 16 27 20 81 3 5 19 2 3 6 5 8 25 32 (30,2) 28 (26,4) 106 (100)
Casos estudiados
Tasa, %
99 22 121 83 9 92 213
65,6 72,7 66,9 22,9 66,6 27,2 49,8
Del: deleciones; CM: cambio de marco de lectura; CA: cambio de aminoácido; SS: sin sentido; PR: procesado. *La tasa corresponde a la proporción de casos diagnosticados del total de casos estudiados.
TABLA 3 Lateralidad y tipo de mutación SS + CM CA + PR
Bilaterales Unilaterales
54 8
23 12
Test de Fisher
p = 0,018 Odds ratio = 3,52
SS: sin sentido; CM: cambio de marco de lectura; CA: cambio de aminoácido; PR: procesado.
Relaciones fenotipo-genotipo El estudio mutacional de RB1 en los casos hereditarios ha permitido establecer interesantes relaciones genotipo/fenotipo, que pueden explicar las formas hereditarias de baja penetrancia y expresividad, caracterizadas por desvíos de las proporciones mendelianas que originan una menor incidencia de retinoblastomas en determinadas familias, presencia de portadores sanos o una edad tardía de presentación. De acuerdo con los estudios genético-moleculares de diferentes autores, los casos de baja penetrancia/expre-
sividad se sitúan en 3 categorías: a) mutaciones que afectan a secuencias reguladoras del promotor, y dan lugar a baja expresión de proteína Rb normal; b) mutaciones puntuales no inactivantes (cambio de aminoácido) o deleciones/inserciones que conservan la pauta de lectura, que dan lugar a una proteína Rb mutada, pero que conserva algo de actividad (alelo débil), y c) mutaciones que afectan a los sitios de procesado, que pueden dar lugar a una reducción, pero no eliminación total, del ácido ribonucleico (ARN) mensajero normal16. En nuestra serie de mutaciones, hemos detectado algunos casos que podrían considerarse como fenotipo de baja penetrancia y que analizamos con algún detalle en la figura 2. La familia 40 es portadora de una mutación sin sentido que elimina el extremo carboxilo terminal de Rb, fuera del dominio funcional B. Esta mutación se considera oncogénica por afectar al sitio de unión de E2F16. La presencia de un portador obligado no puede explicarse por la naturaleza de la mutación e indica la existencia de un mosaicismo germinal que no puede ser investigado. El probando de la familia 103 fue inicialmente clasificado como unilateral esporádico. Sin embargo, el hallazgo de una mutación germinal llevó a investigar la presencia de mutaciones germinales en la familia, con lo que se detectó 3 portadores sanos. La mutación germinal, que no ha sido publicada por otros autores, consiste en una sustitución de arginina en posición 787
TABLA 4 Distribución de mutaciones en algunos países europeos Procedencia
Reino Unido27-34 Porcentaje Alemania26,35-38 Porcentaje Grupo A Porcentaje Francia14,39,40 Porcentaje España7-10 Porcentaje Grupo B Porcentaje p (ensayo χ2)
Todas
55 180 235 114 76 190
CM
CA
14 25,5 53 29,4 67 28,5 32 28,1 25 34,3 57 30,0 NS
6 10,9 7 3,9 13 5,5 6 5,3 6 7,1 12 6,3 NS
SS
29 52,7 93 51,7 122 51,9 44 38,6 22 31,4 66 34,7 0,0006
PR
6 11,1 27 15,0 33 14,0 32 28,1 23 27,1 55 28,9 0,0003
SS: sin sentido; CM: cambio de marco de lectura; CA: cambio de aminoácido; PR: procesado; NS: no significativo.
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Familia 40 (Y790X)
A I II III
(2 m)
B
C Familia 103 (R787Q)
Familia 12 (IVS6 + G > T)
I
I
II
II
(60) (90)
S780 S788 S795 S807 S811 T821 T826
III
5
C
6
6,1
7
IPRSPYK Fig. 2. Casos de baja penetración o expresividad. A) Árbol genealógico de la familia 40, en que la madre del probando es portador obligado. B) Familia 103 con 3 portadores sanos. En la parte inferior del recuadro se esquematiza la posición del aminoácido mutado (R, en negritas), en la vecindad de una serina (S) fosforilable (*) y los 3 elementos invariables de la secuencia de reconocimiento de la cinasa (prolina [P] y lisina [K]) subrayados. C) Familia 12 con 2 afectados unilaterales de aparición muy retrasada. En la parte inferior se esquematiza la posible activación de un exón crítico como consecuencia de la mutación. Los círculos y cuadrados se refieren a mujeres y varones. Los rellenos presentan tumores bilaterales y los rellenos hasta la mitad son portadores de tumores unilaterales. Los círculos negros centrales corresponden a portadores sanos. Entre paréntesis se indica la edad de diagnóstico en meses.
por glutamina. Esta arginina (R) está junto a una serina (S) fosforilable (fig. 2B), por lo que podría afectar al sitio de reconocimiento de la ciclina cinasa, cuya secuencia se detalla en este esquema. Esta mutación puede dar lugar a una proteína Rb con actividad inferior a la normal, lo que justificaría la baja expresividad observada en esta familia. No obstante, esta hipótesis tendría que refrendarse mediante un estudio funcional. La familia 12
(fig. 2C) es un caso particularmente interesante porque reúne 2 rasgos fenotípicos anormales: baja penetrancia, acreditada por el carácter unilateral de los tumores y aparición retrasada (edad de diagnóstico de 60 y 90 meses). La mutación germinal de estos pacientes altera el procesado correcto del ARN, de forma que se elimina el exón 6 con un desplazamiento de la pauta de lectura, que da lugar a una proteína Rb inactiva. Sin em-
50 Edad media Procesado Resto 18,5 9,6 p = 0,018
Edad de diagnóstico
40 30 20 10 0 Procesado
Tipo de mutación
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Resto
Fig. 3. Relación entre la edad de diagnóstico y el tipo de mutación. Representación de parámetros estadísticos (box plot) de las mutaciones de procesamiento frente al resto. La media aritmética y el valor de p (Mann-Whitney) se muestra en la tabla insertada. La edad de diagnóstico se expresa en meses.
bargo, esta mutación se ha observado en 4 familias de baja penetrancia7,8,17, de forma que debe considerarse dentro de este genotipo. En busca de mecanismos moleculares que pudieran explicar dicho fenotipo, se ha procedido a un estudio in silico, con el uso de los programas de reconocimiento de exones en la web del Human Genoma Mapping Project. Este estudio muestra que la destrucción mutacional del sitio de reconocimiento de sitios de procesamiento del exón 6 (esquematizado en la figura 2C) puede activar un exón críptico (6,1) que mantiene la pauta de lectura. Este procesado alternativo daría lugar a una proteína Rb con 11 aminoácidos menos, que se supone que puede mantener buena parte de las funciones de la proteína nativa. Aquí, como en el caso anterior, la hipótesis debería verificarse con estudios funcionales. La existencia de familias, como la 12, con una aparición retrasada de tumores, ha llevado a estudiar posibles relaciones fenotipo-genotipo para este rasgo, comparando la edad de diagnóstico y el tipo de mutación. En la figura 3 se resume los resultados del análisis estadístico para las 105 muestras de edad disponible. En ella puede verse que los pacientes con mutaciones de procesado tienen una edad media de diagnóstico de 18 meses, frente a los 9 meses de pacientes con el resto de mutaciones, diferencia que es muy significativa. Estos resultados son superponibles a los encontrados en un metaanálisis de más de 900 mutaciones publicadas (manuscrito pendiente de evaluación) e indican la existencia de un fenotipo de aparición retrasada de tumores asociado a mutaciones que afectan al procesamiento del ARN. Discusión La experiencia en el diagnóstico molecular del retinoblastoma, resumida en este trabajo, permite extraer algunas conclusiones y objetivos de investigación que se discuten a continuación en el contexto de la experiencia internacional. Ante todo es preciso destacar la importancia del estudio mutacional de pacientes unilaterales para descubrir esa fracción, pequeña pero significativa, de pacientes con mutación germinal y alto riesgo de propagar la enfermedad entre sus descendientes. Ahora bien, el estudio mutacional completo del gen del retinoblastoma es lento y caro, y requiere la implementación de metodologías multiplex para simplificarlo14. En segundo lugar, pero no menos importante, el estudio de pacientes y tipos de mutaciones permite establecer unas interesantes relaciones fenotipo-genotipo, entre las que destaca la asociación de mutaciones de procesado con familias de baja penetrancia y también con el rasgo
ALONSO J ET AL. DIAGNÓSTICO MOLECULAR DEL RETINOBLASTOMA: EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR Y CONSEJO GENÉTICO
que definimos como presentación retrasada de tumores. Como es sabido, este tipo de mutaciones no afecta directamente a la secuencia codificante, sino a secuencias reguladoras de la compleja maquinaria del procesamiento del ARN premensajero18, cuya maduración puede estar relacionada con la mayor latencia en la expresión tumoral de las mutaciones de procesado. Por otra parte, son de destacar las diferencias muy significativas en la distribución de mutaciones sin sentido y de procesado entre países europeos (tabla 4) que indican la existencia de un fondo genético de predisposición en el que podría implicarse un desequilibrio entre la maquinaria reparadora (MMR: MSH2-MSH6) y la actividad demetilante de ADN, causa de la mayoría de las mutaciones sin sentido19,20. Muchas de las mutaciones asociadas al fenotipo de baja penetrancia (cambio de aminoácido, procesado) no tienen efectos inactivantes obvios, por lo que su carácter oncogénico debe establecerse mediante estudios funcionales, con técnicas de mutagénesis dirigida o minigenes, y transfección a células que no expresan la proteína Rb21,22. Por otra parte, es bien sabido que las mutaciones asociadas al fenotipo de baja expresividad son causa también de tumores bilaterales y de una edad de aparición muy temprana. Esta variabilidad entre genotipo y fenotipo de baja penetrancia ha llevado a algunos autores a postular la existencia de factores genéticos adicionales de predisposición al retinoblastoma23. Estas observaciones, junto a la demostración experimental de que el retinoblastoma se desarrolla sobre clones celulares defectivos en muerte celular24, ponen de manifiesto la necesidad de investigar otros genes que puedan estar implicados en la patogenia del retinoblastoma, además de RB1. Este objetivo puede abordarse con las metodologías disponibles para el estudio de expresión génica múltiple y clasificación molecular de tumores, con el uso de matrices de alta densidad de oligonucleótidos25. Agradecimientos Los autores desean expresar su agradecimiento a Javier Pérez por la preparación de los dibujos. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Vogt F. Genetics of retinoblastoma. Hum Genet. 1979;52:1-54. 2. Knudson AG. Mutation and cancer. Statistical study of retinoblastoma. Proc Natl Acad Sci USA. 1971;68:820-3.
3. Cavenee WK, Dryja TP, Phillips RA, Benedict WF, Godbout R, Gallie BL, et al. Expression of recessive alleles by chromosomal mechanism in retinoblastoma. Nature. 1983;305:779-84. 4. Draper GJ, Sanders PA, Brownbill PA, Hawkins MM. Patterns of risk of hereditary retinoblastoma and applications to genetic counseling. Br J Cancer. 1992;66:211-9. 5. Moll AC, Imhof SM, Schouten-Van Meeteren AYN, Kuik DJ, Hofman P, Boers M. Second primary tumors in hereditary retinoblastoma: a register-based study, 1945-1997. Ophthalmology. 2001;108:1109-14. 6. Fletcher O, Easton D, Anderson K, Gilham C, Jay M, Peto J. Lifetime risks of common cancers among retinoblastoma survivors. J Natl Cancer Inst. 2004;96:357-63. 7. Alonso J, Mendiola M, García-Miguel P, Abelairas J, Sarret E, Vendrell T, et al. Spectrum of germline RB1 gene mutations in Spanish retinoblastoma patients. Phenotypic and molecular epidemiological implications. Hum Mutat. 2001;17:412-22. 8. Alonso J, Frayle M, Menéndez I, López A, García-Miguel P, Abelairas J, et al. Identification of 26 new constitutional RB1 gene mutations in Spanish, Colombian and Cuban retinoblastoma patients. Hum Mutat. 2005;25:99. 9. Mateu E, Sánchez F, Nájera C, Beneyto M, Castell V, Hernández M, et al. Genetics of retinoblastoma: a study. Cancer Genet Cytogenet. 1997;95:40-50. 10. Nájera C, Sánchez F, Mateu E, Prieto F, Beneyto M. Diagnóstico temprano del retinoblastoma: importancia de la búsqueda de mutaciones en el gen RB1. Med Clin (Barc). 2001;116:365-72. 11. Retinoblastoma gene mutation database (RBGMdb). Disponible en: http://www.es.embnet.org/Services/MolBio/rbgmdb/idx.html 12. Alonso J, Mendiola M, García-Miguel P, Abelairas J, Pestaña A. Microsatellite fluorescent methodology for linkage analysis studies in familial retinoblastoma and deletion detection at the RB1 locus in retinoblastoma and osteosarcoma. Diag Mol Pathol. 2001;10:9-14. 13. UK Human Genome Mapping Project. Disponible en: http://www.hgmp.mrc.ac.uk/ 14. Houdayer C, Gauthier-Villars M, Lauge A, PagesBerhouet S, Dehainault C, Caux-Moncoutier V, et al. Comprehensive screening for constitutional RB1 mutations by DHPLC and QMPSF. Hum Mutat. 2004;23:193-202. 15. Kiran VS, Kannabiran C, Chakravarthi K, Vemuganti GK, Honavar SG. Mutational screening of the RB1 gene in Indian patients with retinoblastoma reveals eight novel and several recurrent mutations. Hum Mutat. 2003;22:339. 16. Harbour JW. Molecular basis of low-penetrance retinoblastoma. Arch Ophthalmol. 2001;119: 1699-704. 17. Klutz M, Brockmann D, Lohmann DR. A parentof-origin effect in two families with retinoblastoma is associated with a distinct splice mutation in the RB1 gene. Am J Hum Genet. 2002;71:174-9. 18. Buvoli M, Mayer SA, Patton JG. Functional crosstalk between exon enhancers, polypyrimidine tracts and branching point sequences. EMBO J. 1997;16:7174-83. 19. Cooper DN, Krawczak M. Cytosine methylation and the fate of CpG dinucleotides in vertebrate genomes. Hum Genet. 1989;78:151-5. 20. Kolodner RD, Marsischky GT. Eukaryotic DNA mismatch repair. Curr Opin Dev Biol.1999;9: 89-96. 21. Stoss O, Stoilov P, Hartmann AM, Nayler O, Stamm S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 1999;4:383-94. 22. Kaye FJ, Kratzke RA, Gerster JL, Horowithtz JM. A single amino acid substitution results in a retinoblastoma protein defective in phosphorylation and oncoprotein binding. Proc Natl Acad Sci USA. 1990;87:6922-6.
23. Lohmann DR, Gallie BL. Retinoblastoma: revisiting the model prototype of inherited cancer. Am J Med Gene. 2004;Part C,129C:23-8. 24. Chen D, Livne-Bar T, Vanderluit JL, Slack RS, Agochiya M, Bremner R. Cell-specific effects of Rb or RB/p107 loss on retinal development implicate an intrinsically death-resistant cell-of-origin in retinoblastoma. Cancer Cell. 2004;5:539-51. 25. Khan J, Wei JS, Ringner M, Saal LH, Ladanyi M, Westermann F, et al. Classification and diagnostic prediction of cancers using gene expression profiling and artificial neural networks. Nature Medecin. 2001;7:673-9. 26. Klutz M, Horsthemke B, Lohmann DR. RB1 gene mutations in peripheral blood DNA of patients with isolated unilateral retinoblastoma. Am J Hum Genet. 1999;64:667-8. 27. Cowell JK, Bia B. A novel missense mutation in patients from a retinoblastoma pedigree showing only mild expression of the tumor phenotype. Oncogene. 1998;16:3211-3. 28. Cowell JK, Cragg H. Constitutional nonsense germline mutations in the RB1 gene detected in patients with early onset unilateral retinoblastoma. Eur J Cancer. 1996;32A:1749-52. 29. Cowell JK, Bia B, Akoulitchev A. A novel mutation in the promotor region in a family with a mild form ofretinoblastoma indicates the location of a new regulatory domain for the RB1 gene. Oncogene. 1996;12:431-6. 30. Hogg A, Bia B, Onadim Z, Cowell JK. Molecular mechanisms of oncogenic mutations in tumors from patients with bilateral and unilateral retinoblastoma. Proc Natl Acad Sci USA. 1993;90: 7351-5. 31. Hogg A, Onadim Z, Baird PN, Cowell JK. Detection of heterozygous mutations in the RB1 gene in retinoblastoma patientsusing single-strand conformation polymorphism analysis and polymerase chainreaction sequencing. Oncogene. 1992;7:1445-51. 32. Onadim Z, Woolford AJ, Kingston JE, Hungerford JL. The RB1 gene mutation in a child with ectopic intracranial retinoblastoma. Br J Cancer. 1997;76:1405-9. 33. Onadim Z, Hogg A, Cowell JK. Mechanisms of oncogenesis in patients with familial retinoblastoma. Br J Cancer. 1993;68:958-64. 34. Onadim Z, Hogg A, Baird PN, Cowell JK. Oncogenic point mutations in exon 20 of the RB1 gene in families showing incomplete penetrance and mild expression of the retinoblastoma phenotype. Proc Natl Acad Sci USA. 1992;89: 6177-81. 35. Lohmann DR, Brandt B, Hopping W, Passarge E, Horsthemke B. The spectrum of RB1 germline mutations in hereditary retinoblastoma. Am J Hum Genet. 1996;58:940-9. 36. Lohmann DR, Brandt B, Hopping W, Passarge E, Horsthemke B. Spectrum of small length germline mutations in the RB1 gene. Hum Mol Genet. 1994;3:2187-93. 37. Lohmann DR, Brandt B, Hopping W, Passarge E, Horsthemke B. Distinct RB1 gene mutations with low penetrance in hereditary retinoblastoma. Hum Genet. 1994;94:349-54. 38. Yilmaz S, Horsthemke B, Lohmann DR. Twelve novel RB1 gene mutations in patients with hereditary retinoblastoma. Hum Mutat. 1998;12:434. 39. Blanquet V, Turleau C, Gross MS, Goossens M, Besmond C. Identification of germline mutations in the RB1 gene by denaturant gradient gel electrophoresis and polymerase chain reaction direct sequencing. Hum Mol Genet. 1993;2:975-9. 40. Blanquet V, Turleau C, Gross-Morand MS, Senamaud-Beaufort C, Doz F, Besmond C. Spectrum of germline mutations in the RB1 gene: a study of 232 patients with hereditary and non hereditary retinoblastoma. Hum Mol Genet. 1995;4: 383-8.
Med Clin (Barc). 2006;126(11):401-5
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