DETERMINACION Y DIFERENCIACION DE ESCHERICHIA COLI Y COLIFORMES TOTALES USANDO UN MISMO SUSTRATO CROMOGENICO GOEZ LOPEZ, Mariano; VÁZQUEZ GARCÍA, María José; PENA CAAMAÑO, Pilar Laboratorio Central. Aquagest Galicia. Rua Isidro Parga Pondal 7 E-15702 Santiago de Compostela (España) email:
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INTRODUCCIÓN La próxima entrada en vigor de la Directiva 95/C 131/03 [1], sobre la calidad de las aguas destinadas al consumo público, que obliga a la determinación individual de la Escherichia coli, además de las coliformes totales supone, para las empresas suministradoras de agua, la adopción de nuevas estrategias de medida de dichas bacterias. Esta nueva reglamentación modifica a las nacionales de diversos países de la CEE y USA [2-6], que hasta este momento exigían solo la determinación de coliformes fecales y coliformes totales y, se adapta a las nuevas recomendaciones que la OMS [2] dio para la calidad bacteriológica de aguas potables en 1993. Estas directrices se enmarcan dentro de nuevos criterios de contaminación, según los cuales los organismos coliformes se analizan solo como señalizadores de la eficacia del tratamiento y la integridad del sistema de distribución no como indicadores de la presencia de patógenos, mientras que los organismos coliformes termotolerantes, en este caso los E. coli se analizan como indicadores de polución fecal. Hasta este momento, en casi todos los laboratorios de estas empresas se determinan coliformes totales y coliformes fecales de acuerdo con la definición siguiente: todo bacilo gramnegativo, capaz de desarrollarse en presencia de sales biliares u otros agentes (tensioactivos) que tengan propiedades similares inhibitorias del crecimiento y que sean capaces de fermentar la lactosa a temperaturas de 35º ó 37ºC, con producción de ácido, gas y aldehido en un lapso de 24 a 48 horas; también son oxidasa negativas, no esporágenas y reducen el nitrato a nitrito. Este grupo comprende, según la clasificación de Clark y Pagel los géneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter pertenecientes a la familia de las enterobacterias. Sin embargo, hay autores que discrepan de esta clasificación como Lecrerc y Mossel [7] que incluyen Serratia y Buttiauxella.
En 1904, Eijkman [8] propuso que la producción de gas a partir de glucosa a 46º C podría ser un buen método para la determinación de coliformes de origen fecal. Una modificación de este método sirve para definir las bacterias coliformes fecales termotolerantes, que son las que poseen las propiedades antes citadas a una temperatura de 44º ó 45ºC. Estas últimas, cuando fermentan tanto la lactosa como otros sustratos adecuados, como el manitol, a las mismas temperaturas con producción de ácido y gas y que también forman indol a partir del triptófano, se consideran como E. coli presuntivas. Se puede confirmar que se trata de E. coli mediante la demostración de un resultado positivo en la prueba del rojo de metilo, al no producir acetilmetilcarbinol y no utilizar citrato como única fuente de carbono. Estas no son definiciones taxonómicas sino prácticas de trabajo que se usan en el análisis del agua y, en ese sentido, están comprendidos miembros de diversos géneros. Así por ejemplo, algunos organismos que desde el punto de vista taxonómico se identificarían como coliformes no serán reconocidos como tales cuando se analizan en el agua, como también algunas cepas de E. coli que no son termotolerantes. En estos ejemplos se incluyen especies de bacterias coliformes que son anaerogénicas y algunas que no fermentan la lactosa. Dentro de los coliformes termotolerantes aparte de la E. coli, se pueden encontrar, entre otros menos frecuentes, Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae.
IMPORTANCIA DE LOS ORGANISMOS COLIFORMES El uso de organismos intestinales normales como indicadores de contaminación fecal, en lugar de los patógenos mismos, es un principio de aceptación universal en la vigilancia y evaluación de la seguridad microbiana en los sistemas de abastecimiento de agua. Lo ideal sería que el hallazgo de dichas bacterias indicadoras denotara la presencia posible de todos los organismos patógenos pertinentes. Las exigencias a las que debe responder un organismo indicador las podemos agrupar en:
Epidemiológicas: La relación entre un indicador, su naturaleza o concentración y la probabilidad de aparición de infecciones en la población debe establecerse a partir de estudios o encuestas epidemiológicas.
Ecológicas: Un buen indicador debe ser específico de contaminación fecal; debe hallarse de forma constante en las heces de los animales de sangre caliente y estar asociado de forma exclusiva a las aguas residuales. Es decir, su presencia en ambientes no polucionados debe ser mínima o nula.
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Bacteriológicas: Los organismos indicadores deben ser más resistentes que los patógenos a los agentes desinfectantes y por otra parte, ser incapaces de reproducirse o crecer, en el ambiente acuático. Taxonómicas: Los organismos indicadores deben ser fácilmente reconocibles y clasificables en especies de acuerdo con los criterios bacteriológicos existentes. Es decir, cuando un organismo indicador corresponda a una población de determinados organismos, ésta debe estar perfectamente definida.
Metodológicas: Un buen organismo indicador debe ser fácilmente aislable, identificable y enumerable en el menor tiempo posible y con el menor coste. Debe ser capaz de crecer en los medios de cultivo empleados, estar distribuido al azar en las muestras y ser resistente a la inhibición de su crecimiento por otras especies.
En la práctica, todos estos criterios no pueden darse en un solo organismo, aunque las bacterias coliformes cumplen muchos de ellos: están siempre presentes en aguas que contienen patógenos entéricos, su tiempo de supervivencia es muy superior al de microorganismos productores de enfermedades: Mc Feters y colaboradores [9] señalan que mientras un coliforme sobrevive una media de 17 horas, una Salmonella typhi tiene una vida media de 6 horas y un Vibrio cholerae tiene una vida media de 7,2 horas, razón por la cual puede suponerse que en la mayoría de los casos en los cuales el agua no contenga coliformes estará libre de bacterias productoras de enfermedades. Por otra parte, el mejor indicador conocido de contaminación fecal de origen humano o animal es la presencia de coliformes fecales, ya que las heces contienen dichos microorganismos, presentes en la flora intestinal, y, de ellos, entre un 90% y un 100% son E. coli mientras que en aguas residuales y muestras de agua contaminadas este porcentaje disminuye hasta un 59% [10]. De echo, un gramo de heces humanas contiene entre 5*109 y 5*1010 bacterias. Es decir, más del 40% del peso húmedo de las heces humanas está compuesto de células bacterianas. Si bien las bacterias coliformes pueden no tener relación directa con la presencia de virus en aguas potables, el uso de la prueba coliforme sigue siendo esencial para vigilar la calidad microbiana del agua en los sistemas de abastecimiento. Se sabe que los quistes de algunos parásitos son más resistentes a la desinfección que los organismos coliformes. La ausencia de estos últimos en agua de superficie que solamente ha sido desinfectada no significa necesariamente que también haya ausencia de quistes de Giardia, amebas u otros parásitos. Es preciso tener en cuenta que las bacterias coliformes no provienen solo de las heces de los animales de sangre caliente, sino también de la vegetación y el suelo [11-13]. Bajo ciertas condiciones, dichas bacterias pueden también persistir en nutrientes que provienen de materiales de construcción no metálicos. Por las razones expuestas, la presencia de
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algunos microorganismos coliformes (1-10 ufc/100ml), especialmente en aguas subterráneas que no hayan sido tratadas, puede tener poca importancia desde el punto de vista sanitario, siempre que haya ausencia de organismos coliformes fecales. También se han encontrado relaciones entre la E. coli y la fauna heterótrofa presente en el agua, de tal suerte que en experiencias de laboratorio se ha podido comprobar que en agua esterilizada en autoclave el número de E. coli presentes es inversamente proporcional al número de bacterias heterótrofas presentes [14]. Este resultado se refleja claramente en el gráfico 1:
Período de Supervivencia de la E. coli en agua de mar esterilizada tras la adición de bacterias marinas 7
Colif. 1/L.
6
Agua de mar esterilizada en autoclave + 100.000 bacterias marinas por mL
5
Agua de mar esterilizada en autoclave + 1000 bacterias marinas por mL Agua de mar esterilizada en autoclave + 10 bacterias marinas por mL
4
Agua de mar esterilizada en autoclave
3
2 0
1
2
3
4
Días
5
6
7
8
Microbiologia de las aguas G. Rheinheimer
Existen otros organismos que satisfacen algunos de estos criterios, aunque sin alcanzar el grado de satisfacción de las bacterias coliformes, y que en determinadas circunstancias, pueden usarse también como indicadores suplementarios de contaminación fecal. El significado que puede adjudicarse a la presencia o ausencia de determinados indicadores fecales varía con cada organismo y especialmente con el grado de relación que dicho organismo guarda con las heces.
IMPORTANCIA DE LA ESCHERICHIA COLI Además de las características ya citadas, de todos los organismos coliformes, solo los E. coli tienen un origen específicamente fecal, pues están siempre presentes en grandes cantidades en las heces de los seres vivos de sangre caliente y rara vez se encuentran en agua o suelo que no haya sufrido algún tipo de contaminación fecal. Por tanto, se considera que la detección de éstos como organismos fecales o la presunción de E. coli constituye una información suficiente como para estimar la naturaleza fecal de dicha contaminación. Es poco probable que en el sistema de explotación se
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desarrollen nuevamente organismos fecales [15], salvo que existan los suficientes nutrientes bacterianos ( DBO > 14 mg/L, T>13ºC y no haya cloro libre residual). Sin embargo, estudios recientes inyectando E. coli en sistemas de distribución, han demostrado que una vez contaminado éste, al cabo de unos diez días, se produce acumulación de bacterias en el biofilm de las tuberías. Pese a todo, la colonización de la red por dicho microorganismo es sólo parcial y transitoria [16] Flanagan [6] ha resumido la interpretación de la presencia de E. coli como sigue: "Cuando los E. coli están presentes en un gran número, la interpretación es que ha tenido lugar una polución fuerte y/o reciente por desechos animales o humanos. Si el número de E. coli es pequeño indica que la polución, del mismo tipo, es menos reciente o menos importante. Si se detectan coliformes pero no E. coli señala que la polución es reciente pero de origen no fecal o de origen fecal pero lejana, de modo que los coliformes intestinales no han sobrevivido". Otra característica importante de las E. coli, es que pueden ser vectores de algunas enfermedades. en este caso se trata de E. coli patógenos, de los cuales existen muchos serotipos diferentes capaces de causar gastroenteritis en humanos y animales, siendo éstas especialmente serias en recién nacidos y niños de edad inferior a 5 años. Pese a que se considera que los E. coli patógenos representan menos del 1% del total de coliformes presentes en el agua contaminada, basta con 100 organismos para causar una enfermedad. La importancia de este microorganismo queda patente en muchos casos a lo largo de la historia. Desde que Bray publicó en 1.945 el primer estudio epidemiológico sobre la presencia de cepas de E. coli en 42 de los 44 recién nacidos con diarrea que estaban ingresados en un hospital londinense, se han descrito muchos episodios de trastornos debidos a la contaminación producida por esta bacteria. [17-18]. Una extensa revisión de la importancia de este microorganismo y las características de sus serotipos puede encontrarse en la referencia [17]. Entre los diversos tipos de E. coli patógenos podemos diferenciar:
E. coli enteropatogénico (EPEC): Son aquellas cepas asociadas a diarreas infantiles, denominadas a menudo gastroenteritis infantiles (GEI), que se presentaron en forma epidémica en la década de los 40 en los países industrializados, decreciendo a partir de 1.970.
E. coli enterotoxigénico (ETEC): Son E. coli capaces de producir enterotoxinas LT (enterotoxina termolábil), bastante parecida a la toxina del cólera y ST (enterotoxina termoestable), que parece encubrir a un grupo de varias tóxinas parecidas. En la actualidad los E. coli ETEC constituyen una de las principales causas de diarrea infantil en los países en vías de desarrollo. En los países industrializados estas epidemias son excepcionales. Son también los agentes más frecuentes de la
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llamada diarrea del viajero; enfermedad que se produce habitualmente a los 4-6 días de llegada a otro país, generalmente tropical.
E. coli enteroinvasivas (EIEC): Algunas cepas de E. coli pueden ser responsables de un cuadro clínico disentérico similar al de Shigella. La enfermedad se caracteriza por signos de toxemia con malestar, fiebre, intensos dolores intestinales y heces acuosas con sangre, mucus y pus. Estas cepas de E. coli pertenecen a un número limitado de serotipos y se parecen por sus características bioquímicas, antigénicas y por su comportamiento en modelos experimentales a las Shigellas aunque se diferencia de éstas por dar negativo el test de la lisina descarboxilasa. Se denominan enteroinvasivas ya que tras establecer contacto con el epitelio del intestino grueso, destruyen el borde ciliado y penetran en las células, dando lugar a ulceraciones e inflamación intestinal.
E coli productora de verotoxina (VTEC): Es causa de diarrea, que tienen graves secuelas: colitis hemorrágica y posiblemente síndrome urémico hemolítico. Estas bacterias son, a diferencia de las anteriores clases, sorbitol y MUG (4-metilumbiliferil-β-D-glucorónido) negativos. Algunos autores incluyen a las bacterias de este grupo entre las ETEC, pero como clásicamente se ha considerado entre estas últimas a las bacterias capaces de producir LT y ST, se ha diferenciado entre ambas clases.
Importancia de la E. coli en Sanidad medioambiental.
Por citar sólo algunos de los numerosos y más recientes casos en los que la E. coli es la responsable de muertes y gastroenteritis a lo largo y ancho del planeta se tienen los ejemplos significativos siguientes: el que se produjo en Japón en el año 1996 con más de 9.500 personas contaminadas y una decena de muertes en la ciudad de Sakai, de infección de varios cientos de personas, incluyendo cinco muertos, en Inglaterra debido a su presencia en carne de vacuno y de no menos de 55 muertos en Estados Unidos y Canadá. Incluso, se puede destacar un caso más cercano, en la provincia de Lugo, donde según la Sociedad Gallega de Microbiología Clínica, ha afectado a no menos de ocho personas desde 1.992 y en 1.995 se detectó en un 2% de la carne que llegaba al matadero. Estos pocos ejemplos indican la importancia de controlar esta bacteria de una forma escrupulosa.
DETERMINACION DE COLIFORMES Las bacterias coliformes, de acuerdo con la diversa y numerosa bibliografía existente [2,3,6,10,17,19-22], se pueden determinar, sin necesidad de grandes inversiones que incluyan la compra
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de aparatos sofisticados como PCR, medidores basados en el cambio de impedancia de un medio de cultivo, de diversas formas: métodos basados en el número más probable (NMP), de presencia-ausencia (P/A), basados en la filtración de membrana (MF) y métodos cromogénicos y/o fluorogénicos basados en reacciones específicas de estos microorganismos. Actualmente, los métodos NMP están en claro retroceso frente a las otras opciones. Entre los incluidos en la MF hay variaciones en el medio utilizado: puede ser Tergitol TTC, Endo gelose, Agar de Chapman, Hektoen Agar, Levine EMB, Agar verde brillante-bilis, etc. e incluso en la forma de hacerlo: puede ser una filtración directa e incubación sobre una placa que contenga el medio o bien usar discos de cartón nutriente que se empapan con el medio. Los medios P/A tienen una desventaja inicial y que su nombre indica: no reflejan la "cantidad de contaminación" (número de colonias que se desarrollan) del agua analizada. En los medios cromogénicos y/o fluorogénicos, basados en reacciones con indicadores específicos (tecnología de sustrato definido), se produce un cambio de coloración o emisión de fluorescencia en caso de estar presentes organismos coliformes y E. coli respectivamente. Hay autores [17] que diferencian entre medio cromogénico y fluorogénico según el sustrato utilizado (unos provocan coloración y otros fluorescencia), pero en este trabajo se consideran indistintamente. El problema surge en el momento en que se quiere determinar específicamente el número de E. coli presentes ya que los medios cromogénicos más extendidos solo indican presencia o ausencia y los otros medios -los usados tradicionalmente en MF y NMP- no son selectivos, solo son presuntivos. Por las razones expuestas, es por lo que se precisa un método de detección que sea a la vez selectivo y confirmativo. Hace poco tiempo se han puesto a disposición de los microbiólogos nuevos medios de incubación, cromogénicos, que intentan evaluar simultáneamente organismos coliformes y E. coli. Se trata de medios que contienen sustratos cromogénicos enzimáticos.
OBJETIVO DEL ESTUDIO Es determinar la idoneidad de uno de los medios cromogénicos descritos en el capítulo anterior para analizar y diferenciar organismos coliformes y E. coli, intentando establecer una comparación de resultados con métodos ya existentes para confirmar que se trata de un medio válido y utilizable.
Métodos y materiales
Como medio de referencia se ha escogido un medio Endo-Gelose, de la casa bioMérieux (Ref. 43 231), que ya ha sido comparado con otros medios [17,23-24] y establecido su crecimiento como idóneo para análisis de agua. El medio sobre el que se va a realizar el estudio es uno denominado coli ID, de la misma casa (Ref. 42 017). Para identificar las colonias se utilizan un medio API de la misma
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casa (Ref. 20 100) y un medio RapID de la misma casa (Ref. 20 700). Estos test se basan en una serie de reacciones específicas que permiten establecer el tipo de organismo de que se trata con una fiabilidad muy elevada. Para testar cada medio se usan cepas de material de referencia suministradas por el BCR (Ref. WR 63 correspondientes a Enterococcus faecium y Ref. WR3 correspondiente a Enterobacter cloacae) y por Microkit (Ref. ATCC 25992 correspondiente a E. coli y Ref. ATCC 13882 correspondiente a K. pneumoniae). Las referencias de los lotes de medio Endo son: 600846A, 606876A y 616576A, el de Coli ID 748345A, el del API 20E 656135A y el del RapID 20E 630335A, todos suministrados con su correspondiente ficha de control técnico. En el estudio se consideran como organismos coliformes totales todas las colonias que crecen en medio endo tras incubación durante 24 horas a 37º y desarrollan coloración rojo oscuro, están nucleadas con color granate o presentan brillo metálico verde. Se consideran organismos coliformes fecales todas aquellas colonias de las mismas características que crecen en medio endo tras incubación durante 24 horas a 44ºC [10,17,19]. Las placas de medio coli ID se incuban a 37ºC durante 24 horas, considerándose como E. coli las colonias de color morado o violáceo, como organismos coliformes totales las colonias de color azul además de las anteriores y como otro tipo de microorganismos las grisáceas y amarillas. Las placas de este medio contienen dos sustratos cromogénicos, uno que reacciona con la β−glucoronidasa, enzima que es producido por el 97% de las cepas de E. coli y que hidroliza el enlace o-glucoronosil de los glucorónidos conjugados, coloreando las colonias de esta bacteria de morado o violeta y otro que reacciona con la βgalactosidasa, enzima específico producido por los organismos coliformes, coloreando las colonias de éstos de azul. La combinación de ambos sustratos optimiza la detección de E. coli y coliformes. Se han usado membranas filtrantes Millipore HAWG 047.
DESARROLLO DEL ESTUDIO Dado que el medio coli ID se presenta en frascos de 200 ml, siendo necesario licuarlo, extenderlo sobre placa y dejarlo solidificar cabrían dos posibilidades: proceder como en una filtración de membrana típica o bien añadir una cantidad fija de agua a la placa y echar el medio sobre ella. Para mayor seguridad del estudio han seguido los dos caminos. Las muestras de agua que se han analizado proceden de un río (Río Tambre), un efluente de EDAR (EDAR de Silvouta en Santiago de Compostela) y las preparadas con las cepas de referencia. De cada muestra se han realizado tres placas por el procedimiento de MF correspondiendo dos a medio endo, incubadas durante 24 horas a 37º y 44º respectivamente y otra al medio coli ID incubada durante 24 horas a 37ºC. Como las muestras iniciales están bastante contaminadas, se han usado diluciones adecuadas con objeto de evitar placas saturadas de colonias y de imposible lectura. Las diluciones han sido las mismas en cada caso para cada placa y los resultados que se presentan ya están corregidos al habitual de bacterias por 100 ml. de muestra. Aquí ha surgido uno de los problemas experimentales más
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importantes: dado el gran número de inhibidores que contienen las placas rellenas con medio coli ID, ha sido necesario usar diluciones menores en las filtraciones cuyos filtros se han incubado en el citado medio. El último paso del estudio ha consistido en identificar las colonias de las placas realizadas según el procedimiento de MF con alguno de los métodos ya indicados para verificar que se trata de organismos coliformes y/o E. coli dependiendo de cada caso. No se han usado muestras de aguas poco contaminadas o cloradas ya que lo que se intenta encontrar es una correlación entre el número y el tipo de colonias presentes en medio Endo y el número de colonias presentes en coli ID. Tampoco se ha usado la incubación previa de la placa a 35º antes de incubar a 44ºC para recuperar las posibles bacterias en estado latente.
RESULTADOS A la hora de presentar los resultados se diferencia entre coliformes totales y coliformes fecales, cuando lo estrictamente correcto sería diferenciar entre coliformes totales y E. coli. Esto no se hace debido a que, como ya se ha mencionado, más del 90% de los coliformes fecales y además, como se demostrará más adelante -concretamente al estudiar las identificaciones- alguna colonia violácea no corresponde a E. coli. Al hacer esta aproximación se reduce el error. Los resultados que se han encontrado, tras realizar análisis durante el período comprendido entre Febrero y Abril de 1.996 y realizar un número representativo de experiencias, ofrecen, para el Río Tambre los siguientes valores:
Medio Coli totales Endo Coli totales Coli ID Coli fecales Endo Coli fecales Coli ID
Máximo
Minimo
Media
2670 1100 920 980
340 70 150 50
970 431 389 349
En una aproximación estadística: dividiendo el número de coliformes totales obtenidas al incubar en medio endo entre el número de coliformes totales obtenidas al incubar en medio coli ID y procediendo de igual forma para las coliformes fecales y, calculando la desviación estándar, la correlación y el chi cuadrado para cada uno de los casos, se obtiene:
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Coli totales (Endo)/Coli totales (Coli ID) Coli fecales (Endo)/Coli fecales (Coli ID)
2
σn
Media
Correlación
χ
0,77 0,71
2,31 1,78
0,94 0,88
5,2 6,3
De la anterior tabla es fácil deducir que existe una cierta paridad entre los datos correspondientes a los organismos coliformes fecales encontrados en cada caso, puesto que la media de los cocientes entre los números de colonias incubadas en ambos se aproxima a la unidad (que sería el caso ideal). En cambio, para los organismos coliformes totales la paridad es mala ya que el mismo cociente se separa bastante de la unidad. Sin embargo, la correlación individual de cada uno de los datos es mejor en el caso de los coliformes totales, como indica el coeficiente de correlación calculado en la gráfica resultante de representar los valores obtenidos en cada medio en cada uno de los casos. De la tabla del chi cuadrado se puede concluir que para P= 0.05 y 5 grados de libertad, (χ2 = 11,1) que no se puede rechazar la hipótesis de que los resultados sean independientes del medio utilizado. Si se representan las curvas de dispersión de los valores encontrados en las experiencias realizadas para ambos medios, se encuentra que los puntos guardan una relación bastante próxima a la linealidadd –como era de esperar en función del valor de correlación de la anterior tabla-, volviéndose a encontrar una mejor relación en el caso de coliformes totales que en el de coliformes fecales.
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Medio Coli ID
Correlación entre medios. Colif. totales 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
Serie1 Lineal (Serie1)
y = 0,4537x + 25,526 R 2 = 0,8793
0
1000 2000 Medio Endo-Gelose
3000
Correlación entre medios. Colif. fecales 1200 Medio Coli ID
1000 800
Serie1 Lineal (Serie1)
600 400 200
y = 0,7559x - 25,371 R2 = 0,7732
0 0
500
1000
1500
Medio Endo-Gelose
Finalmente, si se realiza un análisis de varianza para cada uno de los casos se tiene:
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ANOVA para coliformes totales Fuente de
Suma de
Grados de
Media
F
variación
cuadrados
libertad
Regresión
2035041,667
1
2035041,667
10,373
Residuo
11379256,667
58
196194,080
Total
13414298,333
59
ANOVA para coliformes fecales Fuente de
Suma de
Grados de
Media
F
variación
cuadrados
libertad
Regresión
244737,067
1
244737,067
3,698
Residuo
3839009,867
58
66189,825
Total
4083746,933
59
En este caso, se observa que F
