Determinación por medios instrumentales del perfil cromatográfico y la composición másica del veneno de la avispa solitaria Pepsis sp. y su relación con los péptidos reportados para otras especies de avispas del familia Pompilidae.

DETERMINACIÓN POR MEDIOS INSTRUMENTALES DEL PERFIL CROMATOGRÁFICO Y LA COMPOSICIÓN MÁSICA DEL VENENO DE LA AVISPA SOLITARIA Pepsis sp. Y SU RELACIÓN CON LOS PÉPTIDOS REPORTADOS PARA OTRAS ESPECIES DE AVISPAS DEL FAMILIA POMPILIDAE

FRANKLIM ALAN GONZÁLEZ ÁVILA DUBERNEY PÁEZ RINCÓN

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA BOGOTÁ D.C. 2015

DETERMINACIÓN POR MEDIOS INSTRUMENTALES DEL PERFIL CROMATOGRÁFICO Y LA COMPOSICIÓN MÁSICA DEL VENENO DE LA AVISPA SOLITARIA Pepsis sp. Y SU RELACIÓN CON LOS PÉPTIDOS REPORTADOS PARA OTRAS ESPECIES DE AVISPAS DEL FAMILIA POMPILIDAE

FRANKLIM ALAN GONZÁLEZ ÁVILA DUBERNEY PÁEZ RINCÓN

Proyecto de Trabajo de Grado para optar al título de Licenciados en Biología

Director Dr. Sc. JULIO CESAR CALVO Director del Grupo de investigación Proteoma Universidad Distrital

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA BOGOTÁ D.C. 2015

NOTA DE ACEPTACIÓN Director ___________________________ Jurado ___________________________ Jurado ___________________________

“La universidad no se hace responsable de las ideas, ni el contenido del presente trabajo, debido a que estas hacen parte única y exclusivamente de sus autores”

Capitulo XV, articulo 117, Acuerdo n° 29 de 1988 del Consejo Superior de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas.

AGRADECIMIENTOS

A Dios, por brindarnos la fortaleza necesaria para afrontar las dificultades presentadas en el camino. A Nuestro Director de tesis el Doctor Julio Cesar Calvo Mozo, por el apoyo incondicional durante esta investigación. Al profesor Álvaro Granados, por su colaboración. Al grupo de extractos marinos de la Universidad Nacional de Colombia, especialmente a Sandra Martínez. Al profesor Cesar Segura, por sus enseñanzas y su hospitalidad. A todos aquellos que supieron brindar una palabra de aliento, de motivación y de esperanza en los momentos más difíciles.

DEDICATORIA

A mis padres: Félix Páez Manrique y Lucila Rincón Chacón, a quienes agradezco infinitamente por brindarme la vida, todo el apoyo, cariño y confianza necesarios para poder soñar y cumplir todas mis metas. A mis hermanas, por respaldarme en todos y cada uno de los momentos difíciles. A mi sobrino, de quien espero mucho. A Cristhel Moreno, por los momentos compartidos y sus palabras de aliento.

A mis padres Gonzalo González y María Odalinda Ávila, a quienes les estoy inmensamente agradecido por su apoyo incondicional para poder seguir adelante con la realización de mis proyectos. A Jessica, por su Amor incondicional. A mi Hermano Gonzalo González y a mi Hermana Cristina González, por alentarme a seguir adelante. A Felipe Martínez Camacho, por brindarnos una sincera amistad.

CONTENIDO

Pág.

RESUMEN

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INTRODUCCIÓN

15

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

17

2. JUSTIFICACIÓN

18

3. PREGUNTA PROBLEMA

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4. OBJETIVOS

20

4.1. Objetivo general

20

4.2. Objetivos específicos

20

5. MARCO TEÓRICO

21

5.1. Generalidades Avispas.

21

5.2. Pompílidos.

21

5.2.1. Pepsis sp.

23

5.3. Veneno de Véspidos.

24

5.3.1. Composición Química.

24

5.3.2. Composición Peptídica.

24

5.3.3. Péptidos reportados en Avispas.

26

5.3.3.1. Péptidos de avispas solitarias.

26

5.4. Técnica de separación péptidos.

28

5.4.1. HPLC-RP.

28

5.4.1.1. Columna RP-18.

28

5.5. Técnicas para identificación péptidos.

28

5.5.1. Espectrometría de Masas (MS).

28

5.5.1.1. Funcionabilidad MS.

29

5.5.1.2. Ionización por electronebulización (ESI/MS).

29

5.6. Tipos de analizador de masa.

30

5.6.1. Analizador de trampa de iones IT-MS, ion-trap MS o ITD.

30

5.7. Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas LC/EM.

30

5.7.1. Sistemas de acople nano-ESI Chip-HPLC-MS/MS.

31

6. MATERIALES Y MÉTODOS.

32

6.1. Obtención del material biológico.

32

6.1.1. Caracterización de la zona de colecta.

32

6.1.2. Identificación de los individuos.

32

6.1.3. Captura de especímenes.

33

6.1.4. Extracción y conservación de los sacos de veneno.

35

6.2. Preparación de las muestras.

35

6.3 Análisis por HPCL-RP.

35

6.4. Análisis LC/MS-MS.

36

6.5. Obtención de Datos.

37

6.5.1. Relación masas obtenidas vs masas reportadas.

37

6.5.2. Relación masas Obtenidas Masas no reportadas.

37

6.6. Masas obtenidas relacionadas con los péptidos reportados para la familia Pompilidae.

37

7. RESULTADOS.

38

7.1. Análisis HPLC en Fase reversa.

38

7.2. Análisis LC/MS-MS.

39

7.3. Análisis de Datos.

41

7.3.1. Relación masas obtenidas vs masas reportadas.

41

7.4. Análisis Espectros de masas.

43

7.5. Masas encontradas no registradas en Bases de Datos.

46

7.6. Relación pesos moleculares y péptidos reportados para Familia Pompilidae.

46

8. DISCUSIÓN.

48

9. CONCLUSIONES.

53

10. SUGERENCIAS.

54

BIBLIOGRAFÍA. ANEXO 1. Compuestos del análisis LC/MS-MS, Software DataAnalysis in house versión 5.3. Avispa - Pesis sp. ANEXO 2. Base de datos péptidos reportados en Avispas (UniProt.org y EROPMoscow) ANEXO 3. Tiempos de Retencion de Compuestos entre Ideal 45-85 minutos.

GLOSARIO

ACN: Acetonitrilo. CI: Fuentes de ionización química. CL/EM: Cromatografía líquida-espectrometría de masas. DA: Dalton. EI: Impacto de electrones. EM: Espectrometría masa. ESI: Ionización Electrospray. ESI/MS: Ionización por electro nebulización. FAB: Iones rápidos bombardeo. FD: Fuentes de desorción por campo. FI: Fuentes de ionización por campo. HPLC: Cromatografía liquida de alta resolución. ION TRAP: Trampa iones. IT-MS: Analizador de trampa de iones. KV: Kilo Voltios. LC/MS-MS: Cromatografía liquida acoplada a masas en tándem. MALDI: Desorción láser asistida por matriz. M/Z: Masa Carga. NIST: Instituto Nacional de Estándares y Tecnología PAM: Péptidos Anti Microbianos PD: Desorción por plasma. PMTX: Pompilotoóxina RP: Fase reversa. SIU: Centro de investigaciones universitaria.

TFA: Acido trifloro acético. TOF: Analizador de tiempo de vuelo. TS: Ionización por termo nebulización. UNAL: Universidad Nacional de Colombia Ul: Microlitros UV-VIS: Espectroscopia visible Ultravioleta o en ingles Ultraviolet–visible spectroscopy

ÍNDICE DE TABLAS

Pág.

Tabla 1: Péptidos aislados de venenos de Avispas Solitarias

26

Tabla 2: Gradiente Utilizado en la HPLC

38

Tabla 3: Gradiente empleado en el análisis de LC/MS-MS

39

Tabla 4: Masa Observada Vs Masa Reportada (Compuestos Obtenidos de BD – Uniprot y EROP-Moscow.

42

Tabla 5: Péptidos Reportados para Pompilidos.

46

ÍNDICE DE FIGURAS

Pág.

Figura 1: Avispa halcón cazando.

22

Figura 2: Theraphosidae Hembra.

22

Figura 3: Venación Sub marginales y marginales.

32

Figura 4: Pepsis Sp. Posición placas Subgenitales.

33

Figura 5: Zona de observación A. Zona de observación B.

34

Figura 6: Hembra Pepsis sp, Vista Dorsal, cuerpo completo

34

Figura 7: Espectrómetro de masas Agilent SL 6300 con fuente de ionización nano Hplc –chip- cube.

36

Figura 8: Hplc Agilent 1200 equipada por bomba de nanoflujo.

36

Figura 9: Nano Chip 150mm Agilent.

36

Figura 10: Perfil cromatográfico obtenido en el análisis.

39

Figura 11: Perfil obtenido con concentración de TFA de 0.1%.

39

Figura 12: Cromatograma de masas completo y total tiempo corrida.

40

Figura 13: Cromatograma obtenido en el análisis de LC/MS-MS.

40

Figura 14: Espectro de masas 1153.9 Da. Masa Observada. Compuesto 103 Tiempo de retención 67.8 min.

43

Figura 15: Espectro de masas 1240.2 Da. Masa Observada. Compuesto 142 Tiempo de retención 86.7 min.

43

Figura 16: Espectro de masas 1243.7 Da. Masa Observada. Compuesto 144 Tiempo de retención 88.0 min.

44

Figura 17: Espectro de masas 1359.3 Da. Masa Observada. Compuesto 175 Tiempo de retención 99.5 min.

44

Figura 18: Espectro de masas 1386.1 Da. Masa Observada. Compuesto 181 Tiempo de retención 102.4 min.

45

Figura 19: Espectro de masas 1623.2Da. Masa Observada. Compuesto 216 Tiempo de retención 109.5 min.

45

RESUMEN

El estudio del contenido peptídico del veneno de los himenópteros ha cobrado una gran relevancia en las últimas décadas, se ha demostrado que dentro de dichos complejos se pueden identificar diversas sustancias que tienen una actividad biológica importante; la gran mayoría de investigaciones en el campo de la bioquímica han mostrado que se puede reconocer un número importante de sustancias activas entre las cuales se encuentran toxinas, antimicrobianos y depresores del sistema nervioso.

La gran mayoría de investigaciones se han centrado en la caracterización y purificación de uno o un grupo de péptidos de actividad biológica específica, pero aún se desconoce la complejidad desde el punto de vista de la composición de estos venenos. Por esta razón, se realizó una investigación del veneno de la avispa solitaria Pepsis sp. con el fin de determinar el perfil cromatográfico, la composición másica de los compuestos presentes en el veneno de la avispa solitaria e identificar si hay alguna relación de estas masas con péptidos que ya hayan sido reportados para la familia Pompilidae.

En esta investigación se colectaron y liofilizaron 11 sacos de veneno de hembras de la especie Pepsis sp., los liofilizados fueron preparados y posteriormente analizados por el método de cromatografía líquida en fase reversa ejecutado en la sede de postgrados de química de la Universidad Nacional de Colombia (UNAL), se determinaron los parámetros generales para el análisis por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas LC/MS-MS, el cual se realizó en la ciudad de Medellín en el laboratorio de cromatografía líquida y espectrometría del SIU de la Universidad de Antioquia con un equipo Agilent Nanochip cube y un espectrómetro de masas de fuente Nano-ESI-ion trap. Como resultados se pudo establecer una relación entre el perfil cromatográfico y los pesos moleculares de 6 sustancias con péptidos reportados para venenos de avispas en las bases de datos Uniprot.org y Erop- Moscow con una diferencia peso a peso de menos de 0.4 Da. Los cuales correspondieron a grupos de Quininas, antimicrobianos y un péptido de función potenciadora de la contracción del musculo liso . Entre los que se destacan fulvonina y Anoplina, los cuales son péptidos reportados para la familia Pompilidae a la cual pertenece Pepsis sp. Estos péptidos poseen características antimicrobianas (Dos Santos Cabrera et al., 2008) y bloqueadoras de los receptores nicotínicos (Kinoshita et al., 2001) respectivamente. De igual manera se registraron un gran número de pesos moleculares que oscilan entre 1000 y 3000 Da. Los cuales no registran reportes en bases de datos para este tipo de individuos. Lo cual nos hace inferir que este tipo de venenos constituye una mezcla bastante compleja desde el punto de vista peptídico, lo que abre camino a futuras investigaciones que permitan su caracterización.

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INTRODUCCIÓN

El análisis de los péptidos presentes en el veneno de los animales, sin duda ha sido un gran campo para el desarrollo de técnicas químicas instrumentales en las cuales se ha invertido mucho esfuerzo y dinero para realizar investigación en búsqueda de sustancias que por su actividad biológica especifica puedan dar una utilidad al hombre; inicialmente los estudios de composición química de los venenos de animales se centraban en la identificación de las toxinas que contenían, para poder reconocerlas y minimizar sus efectos; sin embargo, en esta búsqueda poco a poco el hombre fue encontrando que además de estas sustancias tóxicas, los venenos eran ricos en diversos compuestos de actividad biológica diversa. Es por ello que en las últimas décadas se aumentan de manera estrepitosa los hallazgos de péptidos con características interesantes desde el punto de vista médico y farmacológico (Palma, 2006).

Una de las líneas de investigación más grande en esta materia, sin duda ha sido la búsqueda de antimicrobianos, los cuales tienen una gran aplicabilidad farmacológica. Estos péptidos antimicrobianos se encuentran en todos los grupos animales incluyendo a los humanos (Kastin, 2006), individuos como artrópodos e insectos al no presentar sistemas inmunológicos definidos, se caracterizan por poseer una elevada cantidad de estos péptidos antimicrobianos de origen natural (Cuadrado Cano, 2012; K. Konno et al., 2001; K. Konno et al., 2006; M. A. Mendes, de Souza, & Palma, 2005; Montaño-Pérez & Vargas-Albores, 2002). Estos péptidos en todos los insectos una vez fabricados son expresados en su cuerpo graso y son repartidos a diversas zonas de su anatomía para protegerlos de ataques bacterianos y de otros individuos (hongos, protozoos) (Raa, 1996).

El estudio del contenido peptídico del veneno de los himenópteros (abejas avispas y hormigas), ha cobrado una gran relevancia en los últimos años; se ha demostrado que dentro de dichos complejos se pueden identificar diversas sustancias que tienen una actividad biológica importante, principalmente sustancias con función antimicrobiana (Monteiro, Romao, & Soares, 2009).

Las avispas solitarias han sido un grupo de individuos ampliamente analizado, tanto en la búsqueda de péptidos con actividad biológica como en potentes neurotoxinas. Inicialmente se enfocaron las investigaciones en encontrar las sustancias del veneno que eran capaces de paralizar por un tiempo extenso a las presas y se pudo determinar que para la familia Pompilidae las sustancias responsables eran dos toxinas las cuales se describieron como Pompilotoóxina alfa y beta (Katsuhiro Konno et al., 2000). Por otro lado, los estudios de purificación por HPLC-RP permitieron identificar péptidos antimicrobianos en familias como Scolidae, Eumeninae, Polistinae y Pompilidae (Santos LD, 2011); la importancia de estos péptidos antimicrobianos hallados radica en que han mostrado menor actividad de hemolisis de eritrocitos en los estudios realizados en ratas. Dentro del grupo de los insectos los péptidos antimicrobianos más comunes son la Cabrolina y el Mastoparán puesto que presentan un amplio espectro de acción frente a cientos de 15

cepas bacterianas; sin embargo, su actividad hemolítica era muy alta (K. Konno et al., 2001) (K. Konno et al., 2006) logró demostrar que la Anoplina y Eumenitina aisladas de avispas solitarias tienen una actividad de lisis de los eritrocitos mucho menor e incluso Anoplina y Eumenitina mostraron una alta efectividad frente a promastigotes de Leshmania (K. Konno et al., 2001) y Plasmodium sp. (Carter et al., 2013).

Cabe resaltar que el veneno de las avispas solitarias es un gran complejo peptídico, el cual posee actividades que permiten evitar que la presa de la avispa sea colonizada por una gran variedad de bacterias y hongos, también se indica que genera un aumento de la permeabilidad celular sin inducir la muerte celular a bajas concentraciones y como conservantes a largo plazo de la presa, (Ji Hyeong Baek, Ji, Shin, Lee, & Lee, 2011). Péptidos específicos como el Eumenitina de la avispa eumenine puede desempeñar un papel en prevención de la infección potencial por microorganismos durante el consumo de presas por sus larvas (K. Konno et al., 2006), investigaciones han demostrado que otros péptidos pueden conducir a cambios de comportamiento de las presas como es el caso de la Avispa Ampulex Compressa (Libersat, 2003). Hasta el momento la caracterización y purificación de péptidos de actividad biológica específica en diferentes individuos se desconoce, a ciencia cierta el número de péptidos que están presentes en el veneno de las avispas solitarias en especial las pertenecientes a la familia Pompilidae (Yashad, Dhananjaya, Rakesh Kumar, & Gopi, 2014).

Gracias a la amplia gama de publicaciones realizadas en diversas especies de avispas solitarias de todo el mundo podremos establecer relación entre sustancias reportadas anteriormente y los péptidos que se puedan identificar por medio del análisis del veneno por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas LC/MS-MS. Con el fin de observar si existen péptidos que tengan masas moleculares similares a los péptidos reportados para este tipo de insectos y de esta manera establecer por análisis comparativo qué tipo de péptidos presenta esta avispa y qué relación existe entre esta composición específica y la de otros individuos.

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1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El veneno de los Pompílidos es una fuente rica de péptidos con variadas actividades biológicas, debido a la naturaleza y al uso que la avispa le da al momento de la caza (Coello 2000; K. Konno et al., 2001). Las investigaciones sobre el contenido peptídico del veneno de este tipo avispas se ha centrado en la identificación de uno o un grupo de péptidos para cada especie; Se han aislado antimicrobianos, citotóxinas, miotóxinas, entre otros (Ji Hyeong Baek et al., 2011). Estos estudios han permitido aportar en la construcción de conocimiento y búsqueda de nuevas alternativas de defensa biológica frente al ataque de nuevos organismos patógenos; sin embargo, se desconoce la complejidad desde el punto de vista peptídico que puedan presentar estos venenos, puesto que en nuestro país no existen estudios que determinen el grupo de sustancias que los compone.

La avispa solitaria Pepsis sp. es un Pompílido común en Colombia, en términos generales de dieta, comportamiento y hábitos de caza es muy similar a los individuos estudiados en otros países. Por tanto se espera encontrar una amplia variedad de compuestos peptídicos en la investigación de su veneno.

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2. JUSTIFICACIÓN

Las avisas solitarias comprenden un grupo de individuos de hábitos especiales y características biológicas muy particulares, las hembras poseen un veneno que usan únicamente con fines reproductivos, el cual principalmente está compuesto por sustancias de alto interés biológico como péptidos antimicrobianos, quininas, citotóxinas, miotoxinas, entre otras. En las últimas décadas se ha abordado el estudio de la composición peptídica con el interés de identificar péptidos que puedan generar alguna utilidad al ser humano. Producto de estas investigaciones se han logrado purificar sustancias con acción antibactericida y antifúngica; sin embargo, en Colombia no existen estudios que aborden la composición del veneno de los individuos de la familia Pompilidae. Resulta importante desarrollar esta investigación, puesto que aporta al conocimiento de los mecanismos de acción que tiene el veneno y da un punto de partida para el desarrollo de nuevas investigaciones en esta materia.

Al realizar una revisión exhaustiva de las investigaciones que se le han realizado al veneno de Avispas se describen péptidos antimicrobianos para las distintas especies de avispas como componente abundante en sus venenos. Por tanto el desarrollo de investigaciones en diversas especies colombianas puede desencadenar en la obtención de nuevos péptidos con función antimicrobiana, que no solo presenten la misma o una mayor actividad frente a los microorganismos, si no que tengan un impacto mínimo en la lisis de eritrocitos; si bien, los péptidos aislados de venenos de avispas solitarias actualmente no se pueden utilizar directamente en seres humanos en países como España y Estados Unidos se investiga su acción biológica frente enfermedades como la leishmaniasis o el cáncer (Moreno, Zurita, & Giralt, 2014).

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3. PREGUNTA PROBLEMA

En Colombia la avispa Pepsis sp. está ampliamente distribuida; sin embargo, no existe una investigación en torno a la composición de su veneno, de acuerdo a estos planteamientos surge la siguiente pregunta:

¿Qué tan complejo es el veneno de la avispa solitaria Pepsis sp. respecto a su composición peptídica?

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4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general.

Establecer el perfil cromatográfico y la composición másica de los compuestos peptídicos presentes en el veneno de la Avispa Solitaria Pepsis sp.

4.2. Objetivos específicos.

Realizar un análisis cromatográfico del veneno de la avispa solitaria Pepsis sp.

Obtener el registro de las masas moleculares entre 1000 y 3000 Da de los compuestos presentes en el extracto de veneno.

Comparar las masas moleculares identificadas con los péptidos reportados para otras especies de avispas.

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5. MARCO TEÓRICO

5.1. Generalidades Avispas.

Las avispas son insectos pertenecientes al grupo monofiletico de los Aculeata, el cual agrupa a los himenópteros que tienen el ovopositor transformado en un aguijón ponzoñoso. Las avispas comprenden un grupo extenso de individuos sociales o solitarios. Existe mucha variación entre las diversas especies de avispas pero en general su morfología se constituye por cabeza, tórax y abdomen, protegidos por un exoesqueleto duro poseen ojos u ocelos que les dan capacidad de diferenciar luminosidad y oscuridad (Storer, 1980). Poseen 2 pares de alas, 1 par grande y otro par posterior más pequeño, unidos por una serie de ganchos llamados frenillos. Las hembras de algunas especies están desprovistas de alas. Sus antenas están formadas por una serie de segmentos denominados escapo, pedicelo y flagelo. También cuentan con piezas dentales con las que pueden morder, el cuerpo en algunas especies está cubierto de pelillos. (de la Fuente, 1994).

5.2. Pompílidos.

La familia Pompilidae comprende avispas solitarias depredadoras de tamaño pequeño a grande con aproximadamente 5000 especies en más de 230 géneros alrededor del mundo (Cambra-Torok, Quintero-Arias, & Miranda, 2004). Este tipo de avispas presentan hábitos crepusculares y nocturnos. Los Pompílidos son un grupo avanzado de aculeados que presenta una avanzada estenofagia centrada en las arañas. Con una relación intraespecífica de predoparasitismo. Este grupo de Avispas es interesante debido a que toman su presa la inmovilizan y aguijonean su cuerpo hasta provocar la paralización a causa un poderoso veneno. La presa es llevada a una madriguera donde se introducirá un huevo en su interior el cual crecerá a expensas de la vida de la araña (Coello 2000).

Una de las técnicas de caza de este tipo de avispas es dar saltos cortos y carreras rápidas en el piso haciendo vibrar sus antenas, logrando con esto un avanzada exploración del terreno y posteriormente la atención de la araña. Tomándola por la base de la coxa, plegara su abdomen ventralmente y así podrá aguijonear a su presa. En este momento empieza el desarrollo de una nueva avispa por medio de una ovoposición in-situ. Paralizada y vencida la araña es alimento de la nueva larva que nacerá poco tiempo después. El transporte de la presa puede ocurrir a un sitio determinado o la madriguera del Pompilido, para facilitar el transporte la avispa amputa las patas de la araña en un comportamiento singular (Coello 2000). Estas avispas tienen prevalencia por las arañas del tipo Theraphosidae las cuales posteriormente son sepultadas y abandonadas por la avispa. Un claro ejemplo de la caza de la avispa se muestra en la siguiente imagen (Ver Figura 1).

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Figura 1: Avispa halcón cazando. (Kishinami, 2011) Tarantula Hawk [fotografía]. Recuperado de https://www.flickr.com/photos/kishlc/8021687451/ En casos particulares por ejemplo las avispas de la familia Sphecidae, aprovisionan las larvas con múltiples presas para que estas puedan ser consumidas. Caso contrario de los Pompílidos que tienen preferencia de ovopositar en arañas macho (Pérez-Miles, Oca, Postiglioni, & Costa, 2005), confiriéndoles prioridad de supervivencia a las arañas hembras (Ver Figura 2), las cuales son las encargadas de ovoposiciones de generaciones futuras.

Figura 2: Theraphosidae Hembra. (Hedin, 2009) Theraphosidae [fotografía]. Recuperado de http://www.flickr.com/photos/23660854@N07/3405613471/ Su ciclo de vida se caracteriza por un comportamiento sereno y cumplimiento estricto de las funciones vitales, son individuos tranquilos, nectivoros y solitarios, cuando se aproxima la necesidad de reproducirse todo cambia; la hembra caza y parasita la araña y a continuación sepulta o empareda. La araña puede recuperar parte de su movilidad si es picada por el veneno de algunas especies como P. 22

cinereus (Cambra-Torok et al., 2004). Tres días más tarde del parasitismo nace la larva, perfora el tegumento y comienza a depredar el interior de la araña, mientras la larva crece la araña se debilita y posteriormente muere, es aquí donde los péptidos antimicrobianos surten un efecto de preservación de la presa en vía de descomposición (Konno et al., 2006). La pupación se produce al interior de la cámara en un capullo sedoso. La mayoría de las especies pasa el invierno como larva (Cambra-Torok et al., 2004); sin embargo, Anoplius viaticus lo pasa como adulto, algunas especies poseen una sola generación anual mientras otras pueden tener múltiples generaciones al año siendo multivoltinas frecuentemente se solapan unas con otras (Coello 2000). Esta característica particular de pasar de un estado nectarívoro a predador y de larva carnívora a adulto nectarívoro posiblemente influirá en la variación de péptidos representativos de cada individuo, sin dejar de lado la familia y especie específica a la cual pertenece el individuo, el tipo de alimentación y la posición geográfica donde se encuentran distribuidas, además de la variación de los venenos según el tipo de presas que depredan (Ji Hyeong Baek, Ji, Shin, Lee, & Lee, 2011; Copperi, Pompozzi, Barneche, & Ferretti, 2011).

En cuanto a la copula, dura unos pocos segundos pasando los espermatozoides al espermateca de la hembra, donde son almacenados y utilizados por ella a voluntad. Una característica singular es la que ocurre con Evagetes lapeletier, y Ceropales latreille, el cual localiza los nidos de las arañas parasitadas, los excava devora la larva puesta por el otro Pompilidae y deposita su propio huevo, sella o lapida de nuevo y abandona la cámara nuevamente; esto es considerado un cleptoparasitismo, en cuanto a Ceropales, intercepta a la hembra Pompilidae le quita su presa y ovoposita en frete de ella, después deja que esta culmine su trabajo, la larva del cleptoparasito nacerá más pronto y devorara su competidor (Coello 2000; Copperi et al., 2011).

Pompílidos de argentina específicamente Pepsis aciculata y Notocyphus sp. encuentran simpatria con tarántulas vachoni y P. longisternal (Costa, Pérez-Miles & Mignone, 2004). Pepsis aciculata introduce un huevo aproximado en tamaño de 3,9 mm, a los dos días obtiene un tamaño aproximado de 5,8 mm y a los 7 días alcanza un tamaño de 13,5 mm. Esto contempla un ejemplo del desarrollo de la larva con respecto a una tasa de tamaño versus tiempo (Costa et al., 2004) (Copperi et al., 2011).

5.2.1. Pepsis sp.

El género Pepsis Comprende un amplio grupo de avispas cazadoras de arañas, su distribución es cosmopolita con presencia en el Sudeste de Asia, África, Australia y América (Fernández F, 2006). Son avispas caza tarántulas que comúnmente son llamadas avispas halcón, se estima que en Suramérica existen cerca de 250 especies descritas (Vardy, 2002). Dentro de este género hay variabilidad de tamaños y coloraciones. Todas estas especies conservan los hábitos reproductivos de la familia Pompilidae aunque se desconocen muchos aspectos en cuanto la anidación o el desarrollo larval de estos individuos (Fernández F, 2006). En norte y 23

centro América específicamente en las zonas desérticas la abundancia de estos individuos es alta y se han descrito comportamientos de dos especies (Pepsis Formosa y Pepsis thisbe). La picadura de la especie Pepsis Formosa es considerada como la segunda picadura más dolorosa dentro de todos los artrópodos registrando 9.5 puntos en el índice de dolor de Shmith, superada únicamente por la hormiga bala. A pesar de la reputación de sus hábitos, las avispas del género Pepsis sp. son individuos tranquilos que muy rara vez atacan a los seres humanos. En Suramérica y en general el neotrópico se carece de claves que puedan permitir su identificación certera a nivel de especies (Fernández 2006).

5.3. Veneno de Véspidos.

5.3.1. Composición Química.

El veneno de los Himenópteros tiene características especiales en cuanto a su composición química, las avispas y abejas se constituyen como los principales organismos objeto de estudios y de investigaciones, los científicos se han enfocado principalmente en el aprovechamiento de los péptidos que tienen actividad antimicrobiana aunque los venenos de estas avispas también contienen neurotóxinas, algunos compuestos alérgenos y proteínas que podrían también tener propiedades farmacológicas.

En la literatura se reportan cerca de 2000 investigaciones que se dirigen al aprovechamiento de péptidos y proteínas del veneno de los Himenópteros (Santos LD, 2011). En el caso de las avispas el campo investigación se centra en los péptidos catiónicos de bajo peso molecular, la gran mayoría de compuestos aislados y purificados han sido extraídos de avispas de hábitos sociales y solitarios. Se estima que uno de los péptidos mejor aislado y reportado de estos insectos es la Anoplina el cual posee propiedades antimicrobianas y un amplio rango de acción frente a colonias de bacterias Gram + y Gram - (Konno et al., 2001). A partir de este estudio se ampliaron las perspectivas en torno a esta línea de investigación permitiendo identificar péptidos que tienen una conformación estructural similar a la Anoplina y debido a que muchos de ellos se han evaluado con el fin de establecer la actividad hemolítica, se ha podido determinar que el mecanismo de acción muy similar.

5.3.2. Composición Peptídica.

Los componentes peptídicos de los venenos de himenópteros se distribuyen en el rango de masa molar de 1400 a 7000 Da y juntos comprenden hasta el 70% del peso total de los venenos liofilizados (Santos LD, 2011). La mayoría de estas toxinas son péptidos lineales policatiónicos anfipáticos con un alto contenido de alfa hélices en sus estructuras secundarias (Albericio & Barany, 1984; Kastin, 2006; Konno et al., 2007; Picolo et al., 2010; Zelezetsky & Tossi, 2006), los venenos de 24

himenópteros también puede contener compuestos como las neurotoxinas las cuales accionan en los canales de Na + y/o Ca +2, o incluso en el receptor nicotínico de ACh. Las avispas solitarias utilizan sus venenos para la captura de presas en las cuales inyectan la Pompilotoóxina A y B paralizando las arañas u otros insectos. Los péptidos miotoxicos, citotóxicos y antimicrobianos del veneno de la avispa, conservan el cuerpo de la araña para que este sea consumida por sus larvas (Ji Hyeong Baek et al., 2011; Coello 2000). Por lo tanto, el veneno de las avispas solitarias contiene un rico material biológico con el que se pueden estudiar variados productos de interés farmacológicos y científico para combatir sin número de bacterias Gram + y Gram - (Zalat SM, Nabil Z, A, & M, bradicinina,1999).

Los venenos de avispas solitarias pueden contener una variedad de bioactivos (Kinoshita et al., 2001), además la Bradiquinina y péptidos relacionados con cininas neurotóxicas reportadas en el veneno de las Avispas, como la TreoninaBradiquinina (Thr6- BK) y megascoliaquinina (Thr6-BK-Lys-Ala), aislado a partir del veneno de la avispa europea Scolide Megascolia lavifrons, Thr6-BK también se informó en el Veneno de la avispa Colpa interrupta. Un análisis con los extractos de veneno de 27 especies de las avispas de las familias, Pompilidae, Euménide y Scoliidae; mediante MALDI-TOF MS como la herramienta experimental, demostró que péptidos BK-relacionados están presentes en cuatro de estas especies, con Thr6-BK como el componente principal en el veneno de Megacampsomeris prismática (Palma, 2006).

Desde hace aproximadamente tres décadas se ha demostrado por medio de estudios, que los venenos de las avispas solitarias contienen péptidos con una alta capacidad similar a los antimicrobianos (Kastin, 2006). Un novedoso péptido denominado Anoplin se aisló en el veneno de la avispa solitaria del género Anoplius samariensis cuya secuencia de aminoácidos es GLLKRIKTLL-NH2; es un decapéptido ampliamente activo contra bacterias Gram + y Gram - (Dos Santos Cabrera et al., 2008; Konno et al., 2001), presentando una actividad hemolítica hacia eritrocitos humanos más baja que el Mastoparán, de allí su importancia. Este péptido fue sintetizado y purificado; el primer ensayo con seres vivos fue realizado por Konno en el 2001 en ratas, mostrando una eficacia muy amplia como el Mastoparán X., a partir de allí Konno en el 2006 realizó estudios en otros individuos Eumenes sp. Encontrando un nuevo péptido que denominó Eumetinina. Estudios realizados en la última década en otras especies de avispa se encontraron cerca de 4 nuevos péptidos que presentan características de estructuras alfa helicoidales que tienen acción bactericida (Konno et al., 2006; M. A. Mendes, de Souza, & Palma, 2005), en el 2005 descubrieron dos análogos del Mastoparán y el Protonectin en el veneno de Orancistrocerus drewseni drewsenii corroborando que dentro de esta familia de avispas solitarias y específicamente en su veneno, existe una gran cantidad de péptidos que tienen como característica una estructura alfa helicoidal. Estos péptidos alfa-helicoidales se encuentran entre los amtimicrobianos más abundantes y generalizados en la naturaleza, y parecen representar una disposición estructural particularmente exitosa en la defensa innata contra microorganismos; ellos tienden a ser cortos (menos de 40 residuos de aminoácidos) tienen estructuras relativamente simples y son fáciles de hacer por síntesis química, por lo que los péptidos de este tipo tanto natural como sintéticos, han sido objeto de numerosos 25

estudios en cuanto a su estructura o actividad (Won, Pripotnev, Ruscito, & Ianoul, 2011). Antimicrobianos bastante potentes y de amplio espectro, activos contra una amplia gama de patógenos, incluyendo bacterias promastigotes de lesmania y variedad de cepas de bacterias resistentes a antibióticos, así como también una excelente opción frente al aniquilamiento de hongos y protozoos.

5.3.3. Péptidos reportados en Avispas.

Gracias a los avances tecnológicos y la perspectiva de la investigación de los péptidos presentes en venenos de avispas solitarias a lo largo del mundo se empezaron a estudiar con el fin de dar respuestas a diferentes preguntas en cuanto a su composición y actividad benéfica para el ser humano. Desde que se reportó el primer péptido extraído del veneno de avispas solitarias con efectos antimicrobianos hasta la fecha se demuestra que básicamente cada especie desvela un nuevo péptido de estructura y composición diferente en cada especie, un ejemplo de esto se muestra en la siguiente tabla. (Ver Tabla 1).

Péptido obtenidos Anoplina Eumenitina

Decoralina

Especie Anoplius samariensis Eumenes rubronotatus Oreumenes decoratus

Secuencia Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-LysThr-Leu-Leu-NH2 Leu–Asn–Leu–Lys–Gly– Ile–Phe–Lys–Lys–Val–Ala– Ser–Leu–Leu–Thr Ser-Leu-Leu-Ser-Leu-Ile-ArgLys-Leu-Ile-Thr

Tabla 1: Péptidos aislados de venenos de Avispas Solitarias Los datos contenidos en la anterior tabla muestran una amplia gama de compuestos la mayoría de ellos capaces de atacar gran número de cepas de bacterias multiresistentes y además agentes como los promastigotes en el caso del péptido Decloralina.

5.3.3.1. Péptidos de avispas solitarias.

Anoplina: estructuralmente tiene una alta homología con Crabrolina y Mastoparán-X, los cuales son péptidos que provocan degranulación de mastocitos y se encuentran presentes en venenos de avispas sociales (Konno et al., 2001). Por medio del análisis de dicromismo circular se pudo predecir que este péptido tiene una estructura alfa-helicoidal, característica de los péptidos antimicrobianos que permitió su síntesis. Se corroboro su amplio espectro frente a cepas de S. aureus ATCC 25923 y E. coli ATCC 25922. Los mecanismos de acción de este decapéptido consisten principalmente en una acción que se produce entre la Anoplina y membranas de las bacterias (Dos Santos Cabrera et al., 2008) generando la 26

apertura de poros en la misma, esta acción se potencia cuando la porción carboxiterminal se encuentra amidada (Dos Santos Cabrera et al., 2008). El Anoplin se ha considerado como una interesante biomolécula que podría llegar a usarse en tratamientos farmacológicos.

Eumenitina: Es un péptido linear con estructura Leu–Asn–Leu–Lys–Gly–Ile–Phe– Lys–Lys–Val–Ala–Ser–Leu–Leu–Thr. Sus características son muy similares a las de la Anoplina. Es un péptido linear catiónico con estructura antipática que forma estructuras de alfa-hélice juega un papel determinante en el ciclo biológico de este individuo ya que protege a la larva de las posibles colonizaciones o infecciones de microorganismos a la presa mientras que la larva o futura avispa se alimenta de la ella (Araña). (Konno et al., 2006) Al igual que los homólogos encontrados en otras especies de avispas su posibilidad de inhibir la replicación de colonias bacterianas es muy amplia, su actividad frente a los protozoarios como leshmania muestra gran eficacia. Rangel y colaboradores en el 2011 hallaron 4 péptidos análogos al Eumenitina en las especies: Eumenes rubrofemoratus y Eumenes fraterculus dichos péptidos difieren en la composición de la estructura secundaria y fueron designados como:

-Eumenitina- R -Eumenitina- F -Emp-ER -Emp_EF.

Decoralina: Es un péptido linear catiónico compuesto por 11 aminoácidos, Ser-LeuLeu-Ser-Leu-Ile-Arg-Lys-Leu-Ile-Thr. Este péptido fue aislado del veneno de la avispa Oreumenes decoratus esta vez en Japón lo que da cuenta de la gran diversidad de estos individuos que han logrado colonizar prácticamente todos los hábitats. Las características que diferencian este compuesto de los otros péptidos aislados anteriormente; es que este péptido no mostro una amidación en el grupo carboxi-terminal (Konno et al., 2007) y debido a esta conformación la acción antibacteriana es muy mínima a comparación a muchos PAM, pero al sintetizar este péptido en fase sólida y adicionándole un grupo NH2 terminal la actividad de esta sustancia fue mucho más amplia que la Anoplina incluso frente a promastigotes de Leshmania (Konno et al., 2007).

Aislar diversos péptidos del veneno de varias especies de avispas de hábitos solitarios contribuyeron para corroborar que la función biológica de estos péptidos en la naturaleza es proteger a la larva de la invasión de microorganismos patógenos mientras que completa su desarrollo y puede emerger (J. H. Baek & Lee, 2010).

En síntesis extraer y sintetizar péptidos antimicrobianos con un alto valor científico ya ha sido demostrado por diferentes estudios dirigidos a comprobar la actividad de los PAM que inducen cambios intracelulares en la célula y el rompimiento de la bicapa lipídica de organismos bacterianos y protozoarios (Corrales-García, 2010; 27

Costa Neto, Pino, & Ramos-Elorduy, 2006; Cuadrado Cano, 2012; Konno et al., 2006). Se encuentra una variedad de péptidos similares en estructura y actividad como los encontrados en Anoplius samariensis, Oreumenes decoratus, Eumenes rubronotatus y Polybia paulista (Konno et al., 2001; Konno et al., 2006; Konno et al., 2007; Ribeiro et al., 2004).

5.4. Técnica de separación péptidos.

5.4.1. HPLC-RP.

Cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) implica la separación de las moléculas sobre la base de la hidrofobicidad. El compuesto pasa por la columna a través de una fase fija, mediante el bombeo de alta presión. Los análisis realizados en estas columnas particularmente muestras se retrasan dependiendo de las interacciones físicas y químicas. El tiempo en que tarda un compuesto en ser eluido se denomina tiempo de retención, por tanto los solutos eluyen en orden creciente de hidroficidad molecular (Aguilar, 2003).

5.4.1.1. Columna RP-18.

La columna de HPLC está diseñada en dos partes; la primera el relleno químico de la columna y la segunda el soporte (Rieger, 2003). Los tamaños de columna más habitualmente recomendados para el desarrollo de métodos analíticos son 4,6 x 150 mm y 4,6 x 75 mm (Agilent, 2009). Una característica destacada de las columnas de fase reversa (RP) es que posee una mayor durabilidad a su vez que están compuestas por silica modificada. Habitualmente se recomienda que no se utilice bases en medio acuoso debido a que dañarían el esqueleto silica, también se recomienda no exponer al acido por largos periodos de tiempo. Las columnas de HPLC que tienen diámetros superiores a >10mm se utilizan en purificación de compuestos y las de un diámetro entre 4-5 mm o también denominadas de rango analítico se utilizan para el análisis cuantitativo muestras, comúnmente asociadas a estas detectores tipo UV-VIS. (Rieger, 2003).

5.5. Técnicas para identificación péptidos.

5.5.1. Espectrometría de Masas (MS).

Un espectrómetro de masas permite la determinación de la caracterización de un péptido y una proteína, es una potente herramienta para el análisis donde el constante cambio y la tecnología hace que las técnicas sean más depuradas. Los péptidos y proteínas analizados con este instrumento y la aplicación de técnicas permiten determinar su secuencia de amino ácidos y su peso molecular. 28

El espectrómetro de masas compite con métodos clásicos como la degradación de Edman siendo está muy buena solución cuan se buscan o se tratan de analizar péptidos con su terminación animo bloqueada o de aquellos modificados química o enzimáticamente (Joaquin., 1997). La volatilización de la muestra en gas; más específicamente hablando, tomar la muestra y ionizarla (convertir un péptido en iones) para después ser analizada, esto es el mayor impedimento que tiene el EM, pero después de unos años con nuevas técnicas como la ionización suave ha ampliado el rango para el análisis de moléculas las cuales eran termolábiles. La manera más ingeniosa para llevar un análisis a buen fin es el poder combinar una buena técnica de ionización con una técnica de análisis para obtener los mejores resultados (Plascencia, 2003).

5.5.1.1. Funcionabilidad MS.

La espectrometría de masas posee una fuente de iones la cual convierte por diversos métodos la muestra en iones en fase gaseosa. Se separan entonces por masa- carga (m/z), y un detector que simplemente genera una señal eléctrica proporcional al número de iones incidentes. La representación de la corriente iónica frente a la masa carga, constituye el espectro denominado, espectro masas. Los analizadores más utilizados son los de cuádruplo de sectores y TOF, donde la resolución de análisis es de aproximadamente 500-1000 m/z. (Joaquin., 1997).

5.5.1.2. Ionización por electronebulización (ESI/MS).

Esta técnica se ha convertido en una de las más importantes para el análisis de biomoléculas de pesos superiores a 100.000 Daltons (ver Figura 93). Se realiza en condiciones atmosféricas de presión y temperatura. La disolución de la muestra se bombardea a través de una aguja capilar de acero inoxidable a un flujo de algunos microlitros por minuto. Las agujas se mantienen a un potencial de varios kV con respecto al electrodo cilíndrico que rodea a dicha aguja. La niebla de finas gotitas cargadas resultantes pasa a través de un capilar de desolvatación donde se produce la evaporación del disolvente y de las moléculas del analito y donde estas adquieren la carga. Debido a que las gotitas se vuelven más pequeñas por la evaporación del disolvente, su densidad aumenta produciéndose la desorción de los iones en la atmósfera gaseosa.(Joaquin., 1997).

Se introduce un analito disuelto en un solvente más volátil por un capilar de metal muy pequeño y cargado ya que debido a la repulsión de las cargas eléctricas, el líquido se sale del capilar y forma un aerosol, una nube de pequeñas gotas altamente cargadas las cuales conforme el solvente se evapora, las moléculas del analito se aproximan, se repelen y finalmente, cuando la repulsión de las cargas positivas vence la tensión superficial, estallan las gotas la cual es llamada la Explosión de Coulomb El proceso se repite hasta que el analito está libre de

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solvente, de modo que no quedan más que iones y estos se mueven hacia el analizador de masa (Chowdhury, Katta, & Chait, 1991). 5.6. Tipos de analizador de masa.

Aunque el funcionamiento del analizador de trampa de iones fue descrito por primera vez a mediado de los años 50, los espectrómetros de masas con este tipo de analizador no empezaron a comercializarse hasta 1983. Actualmente, las aplicaciones descritas en la bibliografía que utilizan este tipo de instrumentación son innumerables, y abarcan campos tan variados como por ejemplo estudios de reactividad en fase gaseosa, análisis de péptidos o aplicaciones medioambientales (March, 2000; Hao et al., 2001).

5.6.1. Analizador de trampa de iones IT-MS, ion-trap MS o ITD.

Una trampa de iones es un dispositivo en el que los cationes o aniones gaseosos pueden ser formados y confinados durante largos períodos de tiempo por la acción de campos eléctricos y/o magnéticos. Se han desarrollado varios tipos de trampas de iones que en general son cuadrupolos, pero en el espacio lo que hacen es manipular iones y permitir hacer masas/masas.

Los iones de m/z circulan en una órbita estable dentro de la cavidad que está rodeada por un anillo. Cuando el potencial de radiofrecuencia se aumenta, las órbitas de los iones más pesados llegan a estabilizarse, mientras que las de los iones más ligeros se desestabilizan, lo que causa colisiones. En un espectrómetro de masas los iones quedan atrapados en el interior de la trampa mediante la aplicación de los voltajes y radiofrecuencias adecuados. Se sacando así los iones que no interesan de la trampa y dejamos a estudio los iones que chocarían con el He y así se haría se produciría masas/masas (Corral, 2006).

5.7. Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas LC/EM.

El acoplamiento CL/EM es más complicado debido principalmente a dos factores: en la espectrometría de masas se tienen que producir iones en fase gaseosa y resulta necesario eliminar el disolvente utilizado en la elución. “Acoplamiento por interfase de flujo de partículas: Se trata de un procedimiento mediante el cual se puede separar el disolvente de las moléculas eluidas en una columna de cromatografía líquida de forma rápida y eficiente. El eluato cromatográfico se bombea a través de un capilar hacia un nebulizador concéntrico de vidrio. Seguidamente el eluato se transforma en una nube de gotas que son dispersadas mediante un flujo concéntrico de helio. La nube pasa a través de una cámara de desolvatación cuyas paredes están calentadas y en la que existe una presión ligeramente inferior a la 30

atmosférica. Durante el trayecto estas gotas sufren una desolvatación parcial y producen gotas de los compuestos eluídos ligeramente solvatadas. Cuando el flujo abandona la cámara de evaporación la mezcla de helio, vapor de disolvente y moléculas eluidas sufre una expansión en la primera etapa de bombeo, de lo cual resulta un flujo de gas a alta velocidad que contiene a las moléculas eluidas. Estas moléculas difunden más lentamente del centro del flujo hacia la periferia. Mediante un selector se escogen las capas periféricas del flujo de manera que el vapor de disolvente escogido y el helio son extraidos y bombeados mecánicamente fuera del aparato. Este proceso se repite en la segunda etapa del bombeo. Finalmente, un estrecho flujo de partículas enriquecido en las moléculas de interés, de lenta difusión, es enviado hacia el espectrómetro de masas sin perturbar el vacío. En las fuentes de ionización (EI) o (CI) las partículas inyectadas se vaporizan rápidamente antes de la ionización. En la fuente FAB, el flujo de partículas se dirige sobre una boquilla FAB cubierta por una matriz. Así, las partículas chocan con la superficie de la matriz y son atrapadas en ella” (Corral, 2006).

5.7.1. Sistemas de acople nano-ESI Chip-HPLC-MS/MS.

Consiste en un cromatógrafo líquido acoplado a un espectrómetro de masas con una fuente de ionización de electrospray (ESI) y un analizador de masas de trampa iónica. Los péptidos trípticos son separados por cromatografía líquida de fase inversa e introducidos secuencialmente on-line de forma automática en el espectrómetro de masas para su análisis"(Alicante, 2015).

El sistema HPLC -Chip / MS permite una amplia gama de aplicaciones incluyendo péptidos y moléculas pequeñas, esta nano columna cuenta con un micro inyector automático con termostato. El chip elaborado en poliimida. La espectrometría de masas nanospray ha demostrado amplio potencial, técnica sensible y reproducible para la identificación de péptidos a niveles femtomol a atomol (Agilent, 2012).

Aplicaciones:

1. identificación de péptidos y muestras biológicas en mezclas complejas.

2. Secuenciación Novo. Búsqueda de espectros MS/MS identificación de proteínas y péptidos por MS/MS.

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6. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1. Obtención del material biológico.

6.1.1. Caracterización de la zona de colecta.

La zona en la cual se realizó la colecta de especímenes se encuentra ubicada sobre cuenca Alta del río Sumpaz, localizada en la vertiente Occidental de la Cordillera Oriental a 137 km vía Bogotá – cabrera, en la vereda Aposentos del municipio de Venecia Cundinamarca. Posee un clima templado de aproximadamente 19ºC, es una zona montañosa medianamente disturbada, conserva abundante vegetación nativa; lo que permite la alta abundancia de arácnidos y por ende avispas cazadoras de arañas. Se escogió esta zona por el alto número de lugares de anidación tanto de Pepsis sp. como de Teraphosidos que constituyen su principal alimento (Copperi et al., 2011).

6.1.2. Identificación de los individuos.

Previo a la colecta de los individuos para el análisis de su veneno se realizó una captura inicial de un espécimen por el método de jameo.(Márquez, 2005) Con el fin de determinar los rasgos generales que la diferenciaban de las otras especies presentes en la zona. Se corroboro que pertenecía a el género Pepsis sp. por las características de venación marginal, (Ver Figura 3) y conformación de su placa subgenital (Ver Figura 4) de acuerdo a las claves taxonómicas (Vardy, 2002). La colaboración del Mg. en ciencias Agrarias Alexander García, se determinaron los rasgos de diferenciación sexual ya que nuestro estudio se centra en el veneno, por tanto solo era útil la colecta de hembras ya que ellas con las únicas que producen dichas toxinas (de la Fuente, 1994).

Figura 3: Venación Sub marginales y marginales de las Alas de Avispa Pepsis sp. A. B. Ala de Pesis sp. Tomado de vardy, 2002.

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Figura 4: Pepsis Sp, Posición placas Subgenitales.

6.1.3. Captura de especímenes.

Se escogieron dos sitios de captura de acuerdo a la mayor presencia individuos y presas. Se denominaron sitio A y B. El sitio A comprendía una zona de cultivo de frijol de aproximadamente una hectárea en el cual la presencia de arañas era alta debido a que la remoción del suelo por el arado les facilita la búsqueda de alimento. En consecuencia era una zona de alta probabilidad de captura de hembras de Pepsis sp, (Ver Figura 5).

El sitio B se caracterizaba por ser un camino de aproximadamente 1 km a lo largo de una zona descarpada con un suelo árido en el cual se observaron galerías construidas por tarántulas y presencia de hembras en busca de presa. Durante tres días se realizaron los recorridos de colecta en el sitio A por el método jameo, haciendo el barrido lineal de cada surco del cultivo y en la zona B por recorrido libre. La captura se realizó de manera manual con ayuda de recipientes aprovechando los lapsos de tiempo en los que las avispas abandonan sus vuelos cortos y reptan sobre la tierra, esto debido a que el método de jameo se dificultaba por la topografía del sitio; cada individuo observado en pleno vuelo era seguido hasta que iniciaba a caminar sobre la tierra y allí eran cubiertos con los pies e ingresados a recipientes de vidrio.

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Figura 5: Zona de observación A. Zona de observación B.

Figura 6: Hembra Pepsis sp, Vista Dorsal, cuerpo completo

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Se colectaron 10 especímenes hembras las cuales se sacrificaron in situ y sus abdómenes fueron conservados en congelación para posteriormente realizar la extracción de la bolsa de veneno (Picolo et al., 2010), esta técnica de manejo de los ejemplares no fue exitosa, al tratar de hacer la disección de las bolsas de veneno las glándulas de la misma se encontraban totalmente degradadas. Por lo que se decidió programar una nueva colecta que se ejecutó durante cuatro días, en las mismas zonas y bajo los mismos parámetros. Finalmente se colectaron 11 hembras (Ver Figura 6) las cuales fueron conservadas vivas y llevadas al laboratorio para la extracción de sus sacos de veneno.

6.1.4. Extracción y conservación de los sacos de veneno.

Las 11 hembras fueron sacrificadas en frascos.(Márquez, 2005). La disección se realizó mediante un corte en la parte ventral del abdomen el complejo glandular de cada individuo, posteriormente se separó la bolsa de veneno del resto de órganos.(Schoeters, Billen, & Schmidt, 1997) Cada saco de veneno fue colectado en recipientes de 2ml con septa; fueron colectadas un total de 11 complejos glandulares los cuales fueron transportados a una temperatura de -20°C hasta el laboratorio de química general de la universidad Javeriana en donde fueron sometidos a proceso de liofilización que duro 24 horas, luego de ser liofilizadas las muestras se mantuvieron a temperatura de -70°C hasta su uso.

6.2. Preparación de las muestras.

La preparación de cada una de las muestras para el análisis cromatográfico se realizó mediante la preparación de una solución 1:1 mg/ml del liofilizado de los sacos con una mezcla que contenía 50% de Acetonitrilo y 50% de H20 con TFA 0.1 % (Konno et al., 2001; Rangel et al., 2011) esta mezcla era sometida a ultrasonido por espacio de 1 hora, la totalidad de la solución fue puesta en tubos eppendof se llevaron a centrifugación por 5 minutos a 14.000 rpm; a su término el sobrenádate fue depositado en viales de análisis con septa y almacenado a -20°C hasta el análisis de HPLC RP.

6.3. Análisis por HPCL-RP.

El análisis cromatográfico se realizó en las instalaciones del laboratorio de Química de Postgrados de la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá D.C. donde se utilizó el equipo Agilent 1200 y una columna RP-18 Chromolith® de 10 a 100ml de Mecrk corporation. Con el fin de determinar el perfil cromatográfico para Pepsis sp, realizando varios ensayos basándonos en estudios de cromatográficos en otras especies de avispa.(J. H. Baek & Lee, 2010; Baptista-Saidemberg et al., 2012; M. A. d. S. Mendes, Bibiana Monson Palma, Mario Sergio, 2005)

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6.4. Análisis LC/MS-MS.

El análisis de cromatografía liquida acoplado a masas se realizó en las instalaciones del laboratorio de Cromatografía y espectrometría de masas del sistema universitario de investigación (SIU) de la Universidad de Antioquia. El método de análisis usado fue: HPLC- Chip- NANO-ESI /MS-MS para lo cual se utilizó el quipo HPLC marca Agilent serie 1200 en modo nanoflow acoplado a un espectrómetro de masas tipo Trampa de Iones Agilent modelo SL serie 6300 con fuente de ionización NANOESI y un detector de trampa iones como se observa en las figuras a continuación. (Ver Figura 7 y Figura 8).

Figura 8: Hplc Agilent 1200 equipada por bomba de nanoflujo.

Figura 7: Espectrómetro de masas Agilent SL 6300 con fuente de ionización nano Hplc –chip- cube.

Para sistema de nano flujo nano HPLC se utilizó el chip de larga capacidad 150mm 300 A C18 chip w/ 160 nl de Agilent Tecnologies. (Ver Figura 9)

Figura 9: Nano Chip 150mm Agilent Tecnologies

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6.5. Obtención de Datos.

Los datos del análisis LC/MS-MS se obtuvieron por el software DataAnalysis de Bunker Daltonics programa preinstalado en el equipo; los análisis complementarios para la determinación de masas moleculares se realizaron en el software DataAnalysis in house versión 5.3 cuya licencia fue cordialmente compartida por el PhD Ciencias Biomédicas Cesar Segura director del laboratorio de cromatografía liquida y espectrometría de masas del SIU.

6.5.1. Relación masas obtenidas vs masas reportadas.

Se conformó una listado con las masas moleculares de los péptidos reportados para Avispas en las bases de datos online Uniprot.org y Erop- Moskow. Posteriormente se realizó comparación masa/masa entre los datos obtenidos y los registrados en la base de datos.

6.5.2. Relación masas Obtenidas Masas no reportadas.

Se determinaron los compuestos que tenían pesos moleculares entre 1000 y 3000 Dalton, los cuales poseían una gran abundancia dentro del espectro, pero su masa molecular no se relacionaba con ninguno de los pesos moleculares reportados en avispas.

6.6. Masas obtenidas relacionadas con los péptidos reportados para la familia Pompilidae.

Se identificaron las masas moleculares que tenían una alta concordancia con los pesos moleculares de los péptidos reportados para la familia Pompilidae, con el fin de establecer una relación entre la composición de sus venenos.

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7. RESULTADOS

7.1. Análisis HPLC en Fase reversa.

En base a las investigaciones de (K. Konno et al., 2001; Picolo et al., 2010) se utilizó el mismo gradiente lineal (Ver tabla 2), el rango de absorbancia utilizado fue el de 215 nanómetros el cual es el ideal para este tipo de análisis (Andreu & Rivas, 1997b). Se realizaron varios ensayos y se pudo identificar un perfil cromatográfico (Ver figura 10) el cual se repetía en las diferentes corridas, este análisis preliminar del veneno de esta avispa en términos generales muestra relación con los datos obtenidos en los estudios realizados para la identificación de Decoralina y Anoplina. Puesto que se puede observar que los picos de separación importantes se encuentran al iniciar cada corrida y al final de la misma, lo que indicaría que la separación ocurre en un primer momento en el cual las condiciones de la fase móvil son 95% de agua y 5% de acetonitrilo. El segundo grupo de picos aparece cuando las condiciones de la fase móvil se acercan al final de gradiente es decir que su separación se da cuando hay una concentración de acetonitrilo cercana al 65% y 35% de agua.

Este aspecto es muy importante puesto que los péptidos que se han aislado y sintetizado tienen estas características y se han descrito sus tiempos de elución bajo estas condiciones (K. Konno et al., 2001; Picolo et al., 2010).

Tiempo

H20+TFA

ACN

O min

95%

5%

5 min

95%

5%

15min

65%

35%

30min

35%

65%

Tabla 2: Gradiente empleado en el análisis de HPLC en fase reversa Tecnologies La separación de los diferentes picos mostro una mejor resolución al reducir la concentración de TFA en el solvente pues esto permitió que algunos picos que se mostraban superpuestos se pudieran identificar claramente (Ver figura 10) (Andreu & Rivas, 1997b).

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Figura 10: Perfil cromatográfico obtenido en el análisis La concentración de TFA que teníamos como base era 0,1% (Ver figura 11) pero bajo esta concentración no se apreciaba una buena separación entre los picos. Se disminuyó la concentración del mismo a 0,01 como se señala en la Figura 10 siendo este último el ideal.

Figura 11: Perfil obtenido con concentración de TFA de 0.1% 7.2. Análisis LC/MS-MS.

Para este análisis se estableció un método para la separación partiendo del mismo gradiente que se usó en el análisis por cromatografía liquida en fase reversa, pero la corrida se realizó de 120 minutos con el fin de permitir una mayor separación y la identificación de masas.

Tiempo

H20+TFA

ACN

0 20 45

95% 95% 65%

5% 5% 35%

85 120

35% 5%

65% 95%

Tabla 3: Gradiente empleado en el análisis de LC/MS-MS 39

Los datos fueron analizados bajo los parámetros generales para péptidos que establece el programa DataAnalysis y se analizaron masas de 200 a 2200 Dalton de acuerdo al tipo de molécula y al marco de referencia de los péptidos reportados para este tipo de organismos.

Figura 12: Cromatograma de masas completo y total tiempo corrida. Los datos obtenidos por análisis de espectrometría en trampa de iones permitieron identificar 13086 iones moleculares, Gracias al registro de iones precursores con carga +2 y +3 los cuales se organizaron a través del software del equipo. Se obtuvo un cromatograma (Ver Figura 12 y 13) que arrojo datos para 250 compuestos que tienen masas moleculares de entre 825 Da y 2175 Da. Ver anexo 2.

Figura 13: Cromatograma obtenido en el análisis análisis de LC/MS-MS

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El perfil de masas que logramos obtener describía 2 sitios de concentración de los picos al igual que los ensayos que se realizaron por la HPLC se percibe una semejanza.

Dentro de la ensayo el cromatograma nos permitió identificar una serie de picos altos al iniciar la corrida y otros justo cuando la concentración de acetonitrilo en la fase móvil estaba entre 50% y 65% tal como sucedía en los ensayos de cromatografía en fase reversa que realizamos.

7.3. Análisis de Datos.

7.3.1. Relación masas obtenidas vs masas reportadas.

Al realizar la comparación de las base de datos de las masas de los péptidos reportados en veneno de avispas (Ver Anexo 1) con los datos obtenidos en el análisis realizado para Pepsis sp. se encontraron 6 masas que tienen una relación peso a peso de +/- 0.4 Da. (Ver Tabla 4).

Los péptidos que tienen relación con los datos obtenidos para el veneno son: Anoplina, Eumenitina Fulvonina Bradiquinina Polistesquinina y péptido Polibia Cp. la masa experimental registrada en cada una de estas sustancias tiene una alta proximidad a nuestros datos; sin embargo, debido a que esta investigación constituye un análisis preliminar al veneno de Pepsis sp. surge la imposibilidad de purificar y secuenciar cada una de estas sustancias. Por tanto no podemos asegurar que se trata directamente de estas sustancias hasta no realizar un análisis más detallado de los compuestos que se presentan en el extracto del veneno.

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Masa Observada +E8A1:E7A1:F7+A1:F7 Masa Reportada Equipo Utilzado Péptido reportado 1153,9 1153,8 MALDI-TOF Péptido Antimicrobiano, Anoplina

Especie de Avispa Avispa Solitaria (Anopilis samariensis )

1240,2

1239,7 ESI

Polybia-CP péptido

Avispa Social Neotropical (Polybia paulista )

1243,7

1243,8 MALDI-TOF

Fulvonina

Avispa Caza Arañas (Cyphononyx fulvognathus )

1359,3

1359,3 MALDI-TOF

Bradiquinina

Avispa Social Neotropical (Polistes major )

1386,1

1385,7 MALDI-TOF

Bradiquinina Polistesquinina J [R2,T8]

Avispa de papel (Polistes jadwigae )

1623,2

1623 MALDI-TOF

Eumenitina-R

Avispa Solitaria (Eumenes rubrofemoratus )

Publicacion/Autor. Anoplin, a novel antimicrobial peptide from the venom of the solitary wasp Anoplis samariensis. Konno K. Structural and functional characterization of two novel peptide toxins isolated from the venom of the social wasp Polybia paulista. Souza BM. Bradykinin-related peptides in the venom of the solitary wasp Cyphononyx fulvognathus. Picolo G. Identification of three novel peptides isolated from the venom of the neotropical social wasp Polistes major major. Cerovský V. Waspkinins of some Japanese wasps (Vespidae, Hymenoptera). Nakajima T. Chemical and biological characterization of four new linear cationic alpha-helical peptides from the venoms of two solitary eumenine wasps. Rangel M.

Tabla 4. Masa Observada Vs Masa Reportada (Compuestos Obtenidos de BD – Uniprot y EROP-Moscow

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7.4. Análisis Espectros de masas. A continuación relacionamos los espectros de masa de cada uno de los compuestos que conforman el grupo de datos que tiene relación con los péptidos reportados en las bases Uniprot y Ewrop-Moscow 1. M/z= 1153.9 Da. Masa experimental reportada = 1153.8 Da Diferencia= 0.1 Da

Figura 14. Espectro de masas 1153.9 Da. Masa Observada. Compuesto 103 Tiempo de retención 67.8 min. 2. M/z= 1240.2 Da. Masa experimental reportada = 1139.7 Da Diferencia= 0.4 Da

Figura 15. Espectro de masas 1240.2 Da. Masa Observada. Compuesto 142 Tiempo de retención 86.7 min. 43

3. M/z= 1243.7 Da. Masa experimental reportada = 1243.8 Da Diferencia= 0.1 Da

Figura 16. Espectro de masas 1243.7 Da. Masa Observada. Compuesto 144 Tiempo de retención 88.0 min. 4. M/z= 1359.3 Da. Masa experimental reportada = 1359.3 Da Diferencia= 0.0Da

Figura 17. Espectro de masas 1359.3 Da. Masa Observada. Compuesto 175 Tiempo de retención 99.5 min. 44

5. M/z= 1386.1 Da. Masa experimental reportada = 1385.7 Da Diferencia= 0.4Da

Figura 18. Espectro de masas 1386.1 Da. Masa Observada. Compuesto 181 Tiempo de retención 102.4 min. 6. M/z= 1623.2Da. Masa experimental reportada = 1623.0 Da Diferencia= 0.2 Da

Figura 19. Espectro de masas 1623.2Da. Masa Observada. Compuesto 216 Tiempo de retención 109.5 min. 45

7.5. Masas encontradas no registradas en Bases de Datos. Un total de 244 masas que registramos en nuestro análisis no presento relación con los datos experimentales reportados en las bases de datos Dentro del análisis estos compuestos comprenden el 97.6 % de los datos obtenidos en el complejo del veneno de Pepsis sp. este grupo de masas moleculares que están dentro del rango de estudio no las podemos catalogar como péptidos puesto que no realizamos purificación de un pico cromatográfico en específico, ni secuenciación pero nos parece importante incluirlas puesto que su tiempo de elución, su peso molecular y abundancia dentro del análisis LC/MS-MS. Debe considerarse para futuros estudios que busquen péptidos con actividad biológica buscar los compuestos cuyo pico de elución se encuentre entre los 45 min y los 85 min. (Ver Anexo 3) pues las condiciones de concentración de la línea b son ideales para la obtención de péptidos como los que se han encontrado en este grupo de organismos (K. Konno et al., 2007). En el cromatograma de masas los compuestos mayoritarios es decir los que mostraban mayor intensidad curiosamente están al inicio de la corrida por lo que difícilmente se llegue a concluir que son péptidos con características similares a los péptidos antimicrobianos o quininas que se han reportado en este tipo de avispas ya que la concentración de la línea b es mínima. Instante en el que hay una alta polaridad y los péptidos que se han reportado eluyen en condiciones donde la polaridad se ha disminuido notablemente, lo que nos lleva a inferir que son sustancias medianamente apolares (Palma, 2006).

7.6. Relación pesos moleculares y péptidos reportados para Familia Pompilidae.

En las bases de datos que tomamos el estudio se encuentran reportados 7 péptidos con actividad biológica (Ver Tabla 5) han estudiado tan solo tres especies: Anoplius samariensis, Cyphononyx dorsalis y Cyphononyx fulvognathus individuos pertenecientes a la familia Pompilidae (Palma, 2006). Dentro de los 6 compuestos relacionados en el estudio, (Ver Tabla 4). Tan solo dos de los pesos moleculares. Se encuentra relacionado con los péptidos que han sido purificados del veneno de las avispas de la familia pompilidae Entrada P84896 P83661

E03806 P0DL32 P83660

E02618 E02619

Péptidos Reportados para Pompilidos Organismo

Peptido

[Thr6]-Bradiquinina Péptido Cd-125 Anoplina Fulvonina Péptido Cd-146 Alfa-Pompilidotóxina Beta-Pompilidotóxina

Avispa Caza Arañas (Cyphononyx fulvognathus ) Avispa Caza Arañas (Cyphononyx dorsalis ) Avispa Solitaria (Anoplius samariensis ) Avispa Caza Arañas (Cyphononyx dorsalis ) Avispa Caza Arañas (Cyphononyx fulvognathus ) Avispa Solitaria (Anopilis samariensis ). Avispa Solitaria (Anopilis samariensis ).

Tabla 5: Péptidos Reportados para Pompilidos.

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Peso Mol.

1074 1026 1153,5 1244 1693 1529,9 1557,9

La masa experimental reportada para el péptido Anoplina es de 1153.9 mientras que la masa que relacionamos con este péptido difiere en tan solo 0.1 Da. En el caso de Fulvonina que es el otro péptido que se ha descrito para la familia Pompilidae tambien la diferencia es minima 0,1 Da. Sin embargo con el análisis realizado no es posible dar certeza que este dato corresponda al péptido. Se establece entonces un punto departida para el análisis en cuanto a la identificación y la posible relación de la composición peptídica del veneno de Pepsis sp y otras estas especies de avispas.

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8. DISCUSION

Las investigaciones realizadas en el veneno de avispas de la familia Pompilidae y otras avispas solitarias se caracterizan por demostrar la existencia de uno o un pequeño grupo de péptidos con actividad biológica aprovechable principalmente desde el punto de vista farmacológico; sin embargo, en estos trabajos no se ha descrito a ciencia cierta la complejidad de estos venenos; por tanto, al iniciar la investigación pensábamos que la composición peptídica podría resultar bastante sencilla. Los análisis realizados establecieron que este tipo de venenos presentan una alta complejidad en cuanto a su composición peptídica y realmente se desconoce a profundidad cual es la composición total del veneno (Kastin, 2006).

Se afirma que estos venenos de avispas contienen quininas, péptidos citotóxicos, péptidos alérgenos entre otros, pero esta aseveración parte de una visión muy general de todo el grupo, ya que dicha composición se ha planteado desde la evidencia experimental enfocada más en el veneno de los individuos de hábitos sociales que emplean su veneno para la defensa (Palma, 2006). Las avispas solitarias por su comportamiento y por sus características reproductivas han mostrado contener péptidos de acción mucho más específica, por ejemplo: la manipulación y cambio del comportamiento vital de la presa para llevar a buen término su reproducción (Ji Hyeong Baek et al., 2011; Libersat, 2003).

Gracias a los métodos de separación específicos para péptidos utilizados y los análisis de LC/MS-MS se lograron identificar 6 pesos moleculares presentes en el veneno de Pepsis sp., las cuales tienen una alta similitud con masas reportadas para péptidos con actividad biológica demostrada. Los datos obtenidos permitieron comparar las masas observadas vs los pesos moleculares que se encuentran publicados en artículos científicos y bases de datos, se encontró en el análisis una diferencia mínima de 0,1 Da. entre pesos moleculares observados y pesos moleculares descritos en bases de datos, nos lleva a inferir que puede llegar a tratarse del mismo compuesto. Teniendo en cuenta que nos referimos a péptidos la variación en la secuencia de aminoácidos mostraría una diferencia considerable en las masas moleculares (Andreu & Rivas, 1997a).

En términos generales al realizar el análisis de los péptidos que componen el veneno de una avispa solitaria, se esperaría encontrar los mismos péptidos para un grupo de individuos que comparten hábitos de alimentación, comportamiento y cercanía taxonómica (Kastin, 2006; Téllez & Castaño, 2010; Uma, 2010). Sin embargo, nuestros resultados muestran que de los péptidos reportados para la familia Pompilidae tiene relación entre la masa experimental reportada: 1,153,8 Da. y la masa observada: 1153,9 Da. de ser confirmada nuestra inferencia este sería un péptido antimicrobiano que desempeñaría un papel importante en la protección del individuo y también tendría función específica en su reproducción (K. Konno et al., 2006; Palma, 48

2006; Picolo et al., 2010; Santos LD, 2011). Adicional a esto, existe relación de las masas halladas con dos péptidos de función análoga en el péptido quimiotactico de polybia y eumenitinina-R, estos péptidos presentan una función análoga a la Anoplina siendo Eumenitina-R mucho más parecido a la Anoplina, tanto en su estructura como en su mecanismo de acción (Santos LD, 2011); mientras que el péptido CP- polybia actúa como antimicrobiano, pero también desempeña funciones de regulador de hemotaxis.

De acuerdo a su comportamiento reproductivo todos los Pompilidos poseen un péptido antimicrobiano en su veneno; por tanto, en el veneno de Pepsis sp. debe existir por lo menos un péptido antimicrobiano, curiosamente relacionamos nuestros datos con tres moléculas de este tipo, lo que no ocurre en las investigaciones realizadas con otros pompílidos pues en estas solo se ha descrito un péptido con dicha función (Nakajima T, 1984; Palma, 2006). Los estudios realizados en búsqueda de péptidos análogos se ha demostrado que una especie puede poseer diferentes péptidos que se asemejen ampliamente en cuanto a estructura y por tanto presenten un mecanismo de acción o función biológica análoga o similar, presentando uno o más análogos en su veneno (Baptista-Saidemberg et al., 2012; Istvan Toth & William Anthony Gibbons, 1999; M. A. Mendes et al., 2005; Murata et al., 2009).

Solo la secuenciación de estas moléculas que hemos encontrado en nuestro análisis permitirán saber si existe más de un péptido antimicrobiano con las características alfa helicoidales dentro del extracto del veneno de Pepsis sp. Nuestros datos nos llevan a pensar que la Eumenitina y la Anoplina pueden estar presente en venenos de Pompilidos; si partimos de la base que una especie puede poseer diferentes péptidos que se asemejen ampliamente al mecanismo de acción o función biológica análoga (Costa Neto et al., 2006), Pepsis sp. podría presentar dos análogos con función antimicrobiana, hecho que no se ha reportado para ninguna especie de avispa (Palma, 2006). Por otro lado Las masas observadas 1359,3 Da y 1386,1 Da corresponderían Bradiquinina y un análogo Poliesquinina los cuales al igual que los Mastoparán son muy frecuentes en el veneno de Avispas sociales pero esencialmente los análogos como el THr6-Bk, se han reportado en Avispas solitarias de las familias Pompilidae, Specidae, Eumenidae y Socoliidae (Palma, 2006). De la Bradiquinina y la Poliesquinia no se tienen reportes en estos individuos. La función de las quininas sería la de bloquear el receptor nicotínico de acetilcolina de la presa inmovilizando el sistema nervioso central del insecto o araña; de igual manera se ha reportado un efecto hipotensor y vasodilatador; que influyen en la presión sanguínea, principalmente como hipotensoras, actuando en el músculo liso, provocando lesión rápidamente (Peña, Pineda, Hernández, & Rodríguez-Acosta, 2006). La masa 1243,7 Da. que podría tratarse de Fluvonin péptido que se relaciona con las quininas coadyudando a la contracción del musculo liso puede que este péptido esté estrechamente ligado a los receptores involucrados en la transmisión y acción de estos neuropéptidos y otras quininas, por lo tanto es posible que esté presente en el extracto o un análogo a su actividad, debido a que la avispa solitaria al cazar su presa genera después de la picadura el mismo efecto en la araña (Copperi et al., 2011). 49

Si bien, no podemos dar total certeza de las relaciones que hemos establecido entre nuestros datos experimentales y el análisis de LC-MS/MS. Nuestros resultados aportan un rango de fiabilidad bastante alto, pero es de aclarar que hasta que no se realice un estudio donde se incluya una purificación del pico representativo de cada péptido por medio de HPLC y un análisis de secuenciación peptídica no es imposible afirmar con certeza que este sea la composición y por tanto el péptido que aquí en esta discusión se menciona. Nuestros análisis de HPLC-RP permitieron obtener el perfil completo del fraccionamiento del contenido del saco de veneno de Pepsis sp. cuyo cromatograma es bastante similar al que se reporta para muchos péptidos como lo es Anoplina, Decoralina, Eumenitina donde se observan siempre dos grupos de picos similares. El segundo grupo de picos podría decirse que es donde se reduce la polaridad y aparecen siempre de forma plausible un péptido con actividad biológica específica (K. Konno et al., 2001; K. Konno et al., 2006; K. Konno et al., 2007). En ese orden de ideas los tiempos de retención que mostraron las masas que relacionamos con péptidos antimicrobianos y quininas tienen un comportamiento similar lo que aporta más sustento a nuestros planteamientos.

Dentro de las 250 masas observas en el espectro de masas posiblemente se encuentren fragmentos de proteínas complejas como la pompiltoxina alfa o beta las cuales sin duda debe estar presentes en el veneno de avispas solitarias en este caso Pepsis sp. también deben ser analizados los compuestos del cromatograma de masas que responden a una separación cromatografica altamente polar puesto que se presentan como compuestos mayoritarios, tanto en el espectro de masas como en todos los análisis por HPLC-RP que se le realizó al extracto de veneno de Pepsis sp. Es importante aclarar que el segundo grupo de picos que se mencionó tienen unas características medianamente apolares, teniendo en cuenta el gradiente utilizado y sus tiempos de elución y siendo estos uno de los que se le debe prestar una importancia significativa al momento de futuros análisis, así como lo demuestran investigaciones realizadas en Japón y Brasil, donde este tema con los peptidos de propiedad antimicrobiana es de gran interés. (Costa et al., 2004; Costa Neto et al., 2006; Monteiro et al., 2009). Los únicos de los posibles péptidos que podemos relacionar con los individuos de la familia Pompilidae es Anoplinina y Fulvonina donde existe la alta relación masa-masa. Mientras que las bradiquininas que hemos relacionado con las masas estudiadas fueron reportados en otras familias de avispas independientemente si tienen comportamientos sociales o solitarios (Kinoshita et al., 2001; K. Konno et al., 2001; Picolo et al., 2010). De confirmarse la existencia de estos dos péptidos para el veneno de Pepsis sp. la investigación establecería un punto de partida para futuras investigaciones las cuales deben centrarse en la purificación de los picos que se obtienen entre los 10 a los 30 minutos, ya que la concentración de la línea B es ideal 50

para la elución de péptidos con características similares a los que se han descrito para las diferentes especies de avispas solitarias. Los datos preliminares que hemos obtenido por medio de esta investigación se ofrece un perfil general del comportamiento del veneno pero en el análisis de cromatografía liquida acoplada a masas con base a la complejidad que mostró el contenido de la bolsa de veneno, consideramos pertinente indicar que se deberían repetir corridas bajo los mismos parámetros que hemos usado en la cromatografía liquida en fase reversa. Recoger los extractos y una vez obtenidos realizarle el análisis LC-MS/MS puesto que esto brindaría confirmación más certera de la presencia de péptidos con actividad biológica específica dentro del extracto del veneno. Consideramos que las futuras investigaciones deben profundizar en el campo de la identificación de las secuencias de los espectros de masas hallados.

Realizando una investigación más minuciosa de los datos arrojados por el espectrómetro de masas y análisis con diferentes bases de datos, la coincidencia de pesos moleculares es bastante alto con relación a péptidos reportados mencionados anteriormente. Es muy complicado dar certeza sobre la comparación de los espectros entre nuestro análisis y otros ubicados en bases de datos profesionales como NIST y Mascot; pues NIST hasta el 2008 no tiene bases claras sobre péptidos antimicrobianos en artrópodos o una base de datos de péptidos antimicrobianos registrando espectros de masas para ellos en estos software. El análisis de ESI o MALDI-TOF serían una solución a este problema aislando los picos de interés y haciendo una secuenciación por degradación de Edman o con el método de secuenciación de Novo tratar de identificarla, pero surge un problema pues la confiabilidad con este método es baja. Una secuenciación sería un análisis más confiable o con equipos de mayor confiabilidad como UPLC acoplada a masas y buscar en sus bases de datos o utilizar el mismo método de análisis que se mencionó en este estudio pero purificando o separando el pico de interés y así realizar el estudio con ESI y confirmarlo secuenciando sintetizando y probando su actividad biológica. Debido a que la Anoplina, Fulvonina, Bradiquinina, Polistesquinina J, Eumenitina-R fueron determinados por MALDI-TOF, es difícil ratificar que la semejanza entre las masas experimentales y nuestros datos caso contrario el determinado por ESI PolybiaCP, péptido que tiene un peso molecular con un alto porcentaje de coincidencia, pero a su vez no se puede afirmar que sea el péptido debido a que puede ser un fragmento o parte de un compuesto más grande que en el análisis MS/MS puede que lo excluya del sector faltante (Andreu & Rivas, 1997a). Recordemos que la trampa de iones nebuliza el extracto y analiza por medio del detector, por lo tanto no podemos tener un porcentaje muy alto de confianza ya que se analizó todo el extracto y no solo un pico aislado del veneno. Lo que si podemos discutir aquí es que el veneno tuvo un tratamiento para péptidos, con esto nos referimos a que se extrajo, se manipuló y corrió en métodos ideales para péptidos y no con esto queremos decir que cualquier sustancia que se trate de esta manera se obtendrán péptidos; si no que también se tenía una bibliografía y documentación previa de la posible composición del extracto de veneno, lo que queremos decir es que con estos métodos de tratamiento de muestra se eliminan grandes cantidades de compuesto que no queremos que aparezcan en el análisis de masas como proteínas y otros compuestos. Pero no se descarta que 51

fragmentos de proteínas más grandes u otros compuestos se analicen con este método pues existe la probabilidad de que esto suceda. Debido a esto y a la utilización de membranas con filtros específicos para el tratamiento de péptidos en el trabajo se descartaron bastantes materiales no peptídicos en el extracto, lo que nos da una confianza adicional para asegurar también las afirmaciones en este estudio preliminar. Finalmente, a pesar de tratarse de un análisis preliminar desde el punto de vista experimental exaltamos los hallazgos producto de esta investigación, se pudó establecer un protocolo para la purificación y caracterización individual de los compuestos peptídicos presentes en el veneno de Pepsis sp., logrando establecer el perfil cromatográfico que permite la separación de los compuestos de interés biológico. Corroborando los datos de investigaciones de la última década (Dos Santos Cabrera et al., 2008; K. Konno et al., 2001; Picolo et al., 2010; Ribeiro et al., 2004). De igual manera presentamos una muestra global de los pesos moleculares presentes en el veneno de esta especie, lo que puede utilizarse como punto de partida la creación de una biblioteca de péptidos y demás especies de Avispa solitaria para conducir a nuevas perspectivas y nuevos conocimientos para el estudio del veneno en individuos de la familia Pompilidae o quizá empezar a cultivar una biblioteca de péptidos de todas las especies de Avispas sociales y solitarias en Colombia que esperamos sea una realidad en el futuro.

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9. CONCLUSIONES Se pudo establecer un perfil cromatográfico completo del veneno de la avispa solitaria Pepsis sp., se identificaron 250 posibles compuestos peptídicos de los cuales solo el 2.4 % evidenció alta similitud con péptidos ya descritos para avispas y tan solo dos de las masas moleculares identificadas mostraron estrecha relación con péptidos descritos para la familia Pompilidae. Como posibles péptidos presentes en esta avispa se relacionan tres péptidos de acción antimicrobiana Anoplina, Eumenitina-R y el péptido chemotactico de Polibya sp. El resto de compuestos que mostraron semejanza correspondería a neuropéptidos de tipo quininas denominadas Bradiquinina, Polistequinina y un coadyudante de estos Fluvonin. Ya que la gran mayoría de masas identificadas no se pudo asociar con ningún péptido reportado, se asume que la complejidad de la composición peptídica del veneno de esta avispa exige análisis más puntuales entre los cuales el más recomendable seria el estudio de las masas de los compuestos previamente purificados y aislados. Los péptidos antimicrobianos de origen animal que se encuentran en los venenos de las Avispas establecen criterios para inferir que el extracto de veneno de la avispa solitaria Pepsis sp., posee péptidos con actividad biológica importante y se demuestra claramente en este estudio preliminar la posible presencia de estas sustancias partiendo que es muy difícil en este tipo de estudios que los pesos comparados varíen uno del otro teniendo una diferencia tan escasa en su masa y el análisis cromatográfico a 215 nm muestre un cromatograma tan bueno en la separación de estas sustancias y picos de interés como se muestran en los demás estudios que sustentan estos planteamientos.

Los péptidos antimicrobianos de origen animal que se encuentran en los venenos de las Avispas establecen criterios para inferir que el extracto de veneno de la avispa solitaria Pepsis sp., posee péptidos con actividad biológica importante y se demuestra claramente en este estudio preliminar la posible presencia de estas sustancias partiendo que es muy difícil en este tipo de estudios que los pesos comparados varíen uno del otro teniendo una diferencia tan escasa en su masa y el análisis cromatográfico a 215 nm muestre un cromatograma tan bueno en la separación de estas sustancias y picos de interés como se muestran en los demás estudios que ostentan esta temática.

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10. SUGERENCIAS Teniendo en cuenta que los estudios de la composiciòn del veneno de himenopteros y especialmente en individuos de la familia Pompilidae son muy escasos en Colombia; en un buen número de instituciones existe el equipamiento tecnológico necesario para el desarrollo de este tipo de investigaciones; por tanto, establecemos nuestra investigación como un punto de partida para esta línea de investigación de alto interés biológico, farmacológico y biomédico.

Con el fin de completar los datos de nuestra investigación proponemos complementar nuestras apreciaciones con la purificación y análisis de espectrometría individual de los picos. Pues suponemos que pueden confirmar la presencia de péptidos lineales catiónicos con actividad antimicrobiana.

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ANEXO 1. Compuestos del análisis LC/MS-MS, Software DataAnalysis in house versión 5.3. Avispa - Pesis sp. Compuesto m/z 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Compuesto m/z 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160

Tiempo Ret. Compuesto m/z Tiempo Ret. Compuesto m/z Tiempo Ret. Compuesto m/z Tiempo Ret. Compuesto m/z Tiempo Ret. Compuesto m/z Tiempo Ret. Compuesto m/z 1010,5 27.8 21 922,3 36.6 41 959,3 43.0 61 882,4 51.2 81 1282,6 58.1 101 1137,3 66.4 121 1111,7 29.8 22 907,5 36.9 42 966,8 43.4 62 905,4 51.7 82 919,1 58.4 102 1056,8 67.2 122 929,3 32.1 23 1146,3 37.0 43 1144,5 43.9 63 1106,3 52.1 83 944,1 59.4 103 1399,9 67.8 123 875,3 33.1 24 957,5 37.2 44 1260 44.2 64 962,1 52.7 84 1116,4 59.7 104 1114,8 68.5 124 2013,7 33.6 25 908,6 37.5 45 1019,3 45.3 65 906,4 52.8 85 921,3 59.9 105 1291 69.0 125 1037,4 33.8 26 921,9 37.6 46 1019,3 45.4 66 906,4 53.2 86 1137,6 60.6 106 1242,4 69.1 126 1106,4 34.1 27 907,4 37.6 47 2095 46.5 67 953,2 53.4 87 1139,5 60.9 107 1101,8 69.6 127 997,3 34.3 28 921,9 38.0 48 2095 46.6 68 858,2 53.5 88 1025,8 61.8 108 1286,5 70.4 128 894 34.4 29 1676,1 38.0 49 1236 47.0 69 1228,3 54.6 89 941,1 62.3 109 1175,9 70.9 129 894 34.4 30 1067,5 38.9 50 1080,1 47.0 70 1100,6 54.9 90 1865,7 62.6 110 1083,4 71.1 130 943,9 34.8 31 1129,6 38.9 51 1168,6 48.2 71 1797,5 55.3 91 1139,2 63.1 111 1023,3 71.5 131 938,5 35.0 32 1085,3 39.4 52 963,3 48.7 72 1277,9 56.0 92 1094,9 63.2 112 1112,3 71.6 132 938,5 35.0 33 905,5 40.0 53 1870,6 48.8 73 1522,5 56.5 93 1000 63.5 113 1354,3 72.7 133 862,5 35.7 34 1016,7 40.2 54 1041,1 49.4 74 1139,7 56.6 94 1048,6 64.0 114 1354,3 73.0 134 820,3 35.9 35 1027,9 40.4 55 1041,1 49.7 75 1139,7 57.0 95 1048,6 64.0 115 1106,6 73.9 135 867,5 36.1 36 883,4 40.6 56 1061,5 50.1 76 1419,6 57.1 96 1330,8 64.8 116 1052,4 74.1 136 885,9 36.1 37 1119,4 41.8 57 1203,7 50.5 77 1419,6 57.2 97 1173,9 65.2 117 1130,4 74.6 137 814,5 36.1 38 1185,1 41.9 58 1112,9 50.7 78 918,3 57.6 98 2116,4 65.3 118 1167,8 75.2 138 816,5 36.3 39 967,2 42.3 59 1047,8 50.9 79 1034,4 58.1 99 1309,1 65.7 119 1167,8 75.3 139 814,5 36.5 40 922,9 42.8 60 1047,8 51.0 80 1034,4 58.1 100 1130,5 65.8 120 1392,1 76.6 140 Tiempo Ret. Compuesto m/z Tiempo Ret. Compuesto m/z Tiempo Ret. Compuesto m/z Tiempo Ret. Compuesto m/z Tiempo Ret. Compuesto m/z Tiempo Ret. 1192,2 86.6 161 1182,1 96.5 181 1201,6 102.4 201 1790,5 107.1 221 1394,9 111.1 241 1362,6 117.0 1240,2 86.7 162 1045,2 96.7 182 1319,4 102.6 202 1577,5 107.4 222 1422,1 111.3 242 1215,6 117.4 1199,4 87.3 163 1197,3 97.0 183 1260,7 102.7 203 1577,5 107.5 223 1196,8 111.4 243 1283,6 117.4 1152,9 88.0 164 1623,2 97.1 184 1260,7 102.7 204 1577,5 107.5 224 1998,5 111.4 244 1492,5 117.6 1655,4 88.5 165 1346,5 97.8 185 1548,9 103.1 205 1666,7 108.1 225 1387,3 111.9 245 1299,6 118.1 1655,4 88.6 166 1583,8 97.8 186 2139,9 103.1 206 1373,7 108.1 226 1393,7 112.3 246 1325,7 118.4 1153,9 89.1 167 1073,2 97.8 187 1687,8 103.6 207 1573,6 108.4 227 1863,7 112.5 247 1325,7 118.5 1082,9 89.7 168 1296 98.1 188 1616,1 104.3 208 1398,4 108.5 228 1393,7 112.5 248 1492,6 118.7 1473,3 90.8 169 1198,9 98.6 189 1616,1 104.4 209 1573,6 108.5 229 1221,6 113.1 249 1528,9 119.8 1172,3 92.2 170 1169,4 98.9 190 1604,1 104.9 210 1573,6 108.6 230 1312,6 113.2 250 1706,6 120.7 1154 92.3 171 1258,6 99.0 191 2111,3 105.0 211 2139,4 108.9 231 1375,5 113.9 1230,6 93.5 172 1169,4 99.0 192 2111,3 105.1 212 1376,4 108.9 232 1724,9 114.0 1152,3 94.2 173 1699,9 99.4 193 2111,3 105.2 213 2139,4 109.0 233 1230,6 114.2 975,2 94.2 174 1699,9 99.4 194 1877,8 105.5 214 1695,5 109.1 234 1207,7 115.6 1310,3 95.3 175 1187,1 99.5 195 2039,3 105.7 215 1797,5 109.5 235 1440,2 115.6 1189,2 95.4 176 1318,8 100.9 196 2138,5 105.7 216 1797,5 109.5 236 1276,4 116.2 1101,7 95.8 177 1318,8 101.0 197 2039,3 106.0 217 1373,5 109.7 237 1293,5 116.3 1078,5 96.1 178 1386,1 101.4 198 2175 106.5 218 1321,6 110.2 238 1185,1 116.4 1161,1 96.1 179 1549,4 101.9 199 2175 106.5 219 1549,6 110.7 239 1185,1 116.5 1161,1 96.3 180 1549,4 102.0 200 1475,4 107.0 220 1394,9 110.8 240 1359,3 116.7

Tiempo Ret 1392,1 76.7 1116,9 77.1 1243,7 77.3 1259,5 78.2 1105,3 78.5 1191,3 78.8 1280,2 79.2 1180,2 79.5 1204 79.8 1080,9 79.8 1115,4 80.3 1099,8 81.0 1099,8 81.0 1182,3 82.2 1182,3 82.4 1154,2 82.9 1345,6 83.7 1687,4 84.2 1214,2 85.8 1319,9 86.2

ANEXO 2. Base de datos péptidos reportados en Avispas (UniProt.org y EROP-Moscow) Entrada E10471 P83661 E03789 N/S

E00048 E00343 E03806 P0C005 E05430 P0C1R1 P69437 E06083 P0C1R0 P0DL32 E06091 P85870 E00651 P12797 E00472 P83659 E00713 P42718 E00143 E00469 E08520 P85875 E00191 E00482 E00395 P17237 P85873 E08519 E00483 E00470 P17235 E00471 E07842 E07844 P0CJ38 P0CJ39 E00241 E00411 P01514 E00394 E02084 P0C022 E02618 E06111 P69036 E00242 E02619 P69392 E07822 E05432 E06110 P69436 P69035 P84388 P42717 E05431

Peptido Péptido Quimiotáctico P-10 [1-6] Péptido Cd-125 Péptide de Veneno, Cd-125 [Thr6]-Bradiquinina Bradiquinina [G1] Bradiquinina [A1] Péptido Antimicrobiano, Anoplina Anoplina (As-183) Quimiotáctico Péptido P-10 Protonectina Protonectina (Péptido Quimiotáctico) Péptido Polybia-Quimiotáctico Péptido Polybia-Quimiotáctico Fulvonina Decoralina Decoralina Bradiquinina-lys-ala [T6] Megascoliaquinina Bradiquinina Polistesquinina C Cyphoquinina Péptido Quimiotáctico Péptido Quimiotáctico Bradiquinina Polistesquinina-R Bradiquinina Polistesquinina J [R2,T8] Péptido de Veneno PPM3 Péptido de Veneno PPM3 Bradiquinina Vespaquinina X Péptido Quimiotáctico I-CP Péptido Quimiotáctico T Péptido Quimiotáctico (I-CP) Quinina PMM1 Bradiquinina Péptido Quimiotáctico X Bradiquinina Polistesquinina J [R2] Péptido Quimiotáctico L (VESCP-L) (Ves-CP-L) Bradiquinina Polistesquinina J [R2,T8] Antimicrobiano Péptido VESP-V1 Mastoparan-V1 Mastoparan-ER (EMP-ER) Eumenine Mastoparan-EF (EMP-EF) Eumenine Mastoparan Mastoparan M Mastoparan-L Mastoparan T Mastoparan-AF Mastoparan-AF (EMP-AF) (Af-113) Eumenine Alpha-Pompilotoxina Protoplybia MP III Mastoparan-3 (Mastoparan III) (MP-III) Mastoparan X Beta-Pompilotoxina Beta-Pompilotoxina (Beta-PMTX) Mastoparan PDD-B Agelaia-MP Protoplybia MP II Agelaia-Mastoparan (Agelaia-MP) Mastoparan-2 (Mastoparan II) (MP-II) Polybine-1 (Polybine-I) Waspquinina Péptido Quimiotáctico P-8

Organismo Avispa Social (Agelaia pallipes pallipes ) Avispa Caza Arañas (Cyphononyx dorsalis) Avispa Caza Arañas (Cyphononyx dorsalis ) Avispa (Cyphononyx fulvognathus) Avispa (Polistes annularis Linnaeus ) Avispa Avispa Solitaria (Anopilis samariensis ) Avispa Solitaria (Anoplius samariensis ) Avispa Social Neotrópical (Agelaia pallipes pallipes) Avispa Brasilera (Protonectarina sylveirae ) Avispa Social Neotrópical (Agelaia pallipes pallipes) Avispa Social Neotrópical (Polybia paulista) Avispa Social Neotrópical (Polybia paulista) Avispa Caza Arañas (Cyphononyx dorsalis) Avispa Alfarera (Oreumenes decoratus) Avispa Alfarera (Oreumenes decoratus) Avispa Solitaria (Megascolia flavifrons) Avispa Solitaria (Megascolia flavifrons ) Avispa (Polistes chinensis ) Avispa Caza Arañas (Cyphononyx fulvognathus) Avispa (Parapolybia indica ) Avispa del Papel (Parapolybia indica) Avispa (Polistes rothneyi ) Avispa de Papel (Polistes jadwigae ) Avispa Social Neotrópical (Polistes major) Avispa Social Neotrópical (Polistes major ) Avispa Japonesa (Vespa xanthoptera ) Avispa (Icaria sp ) Avispa (Vespa tropica ) Avispa (Icaria sp) Avispa Social Neotrópical (Polistes major) Avispa Social Neotrópical (Polistes major) Avispa Japonesa (Vespa xanthoptera ) Avispa del Papel (Polistes jadwigae ) Avispa (Vespula flaviceps lewisii ) Avispa de Papel (Polistes jadwigae) Avispa Hong Kong (Vespa bivolor ) Avispa Hong Kong (Vespa bivolor ) Avispa Solitaria (Eumenes rubrofemoratus ) Avispa Solitaria (Eumenes fraterculus) Avispa Chaqueta Amarilla (Vespula lewisii ) Avispa (Vespa mandarinia ) Avispa Chaqueta Amarilla (Vespula flaviceps lewisii ) Avispa (Vespa tropica ) Avispa (Anterhynchum flavomarginatum ) Avispa Solitaria (Anterhynchium flavomarginatum ) Avispa Solitaria (Anopilis samariensis ) Avispa Social Neotrópical (Protopolybia exigua) AvispaSocial Neotrópical (Protopolybia exigua) Avispa Japonesa (Vespa xanthoptera ) Avispa Solitaria (Anopilis samariensis ) Avispa Solitaria (Batozonellus maculifrons ) Avispa de Papel (Polistes dorsalis ) Avispa Social Neotrópical (Agelaia pallipes pallipes) Avispa Social Neotrópical (Protopolybia exigua) Avispa Social Neotrópical (Agelaia pallipes pallipes) Avispa Social Neotrópical (Protopolybia exigua) Avispa Social Neotrópical (Polybia paulista) Avispa de Papel (Parapolybia indica) Avispa Brazil (Protonectarins sylveira )

Peso Mol 627,56 1.026 1026,1 1074 1117,2 1131,2 1153,5 1.155 1209,6 1.211 1.211 1239,6 1.241 1.244 1256,8 1.257 1273,4 1.274 1275,4 1.290 1297,6 1.298 1301,4 1317,4 1317,8 1.320 1343,5 1351,7 1352,8 1.353 1.359 1359,3 1366,8 1372,5 1.384 1386,6 1420,6 1456,5 1.476 1.476 1478,9 1478,9 1.480 1512,9 1523 1.524 1529,9 1552,9 1.554 1555,9 1557,9 1.559 1565 1565,3 1567,8 1.568 1.569 1.570 1.573 1581,9

E06109 P0C1Q5 P69034 P85879 E05469 E07095 P84389 E00712 P42716 P0CJ36 E07823 E00328 E03675 P01517 E06656 P0C931 P0CJ37 E06082 P0C1Q4 E05470 E07096 E03790 P83660 P0C1Q9 E07821 P0C1Q8 E00699 P85880 E01412 E09498 P0C1M6 E09499 E07824 P0C1M7 P85874 E05924 P57672 E05922 E05920 E00047 E06658 P0DM71

Protoplybia MP I Mastoparan (Protonectarina-MP) Mastoparan-1 (Mastoparan I) (MP-I) Péptido-I Tachyquinina (PllTkP-I) Polybine-I Péptido Inflamatorio 13a Polybine-2 (Polybine-II) Mastoparan Mastoparan (MP) Eumenitina-R Mastoparan MP Mastoparan Polistes mastoparan Mastoparan-J (Polistes mastoparan) Péptido Antimicrobiano Eumenitina (Er-12) Eumenitina-F Péptido Polybia-MPI Mastoparan-1 (Mastoparan I) (MPI) (MP-1) Polybine-II Péptido Inflamatorio 13b Péptido Veneno, Cd-146 Péptido Cd-146 Mastoparan-V2 Mastoparan PDD-A Mastoparan-V1 Mastoparan V Péptido-II Tachyquinina (PllTkP-II) Pentadeca Péptido Dominulina A Dominulina-A Dominulina B Mastoparan PMM2 Dominulina-B Péptido Mastoparan PMM2 Apidaecina 6 Vespulaquinina-1 [Cleaved into: Vespulaquinina-2] Apidaecina 4 Apidaecina 2 Bradiquinina Polistesquinina Péptido Protopolybiaquinina-II Bradiquinina-related Protopolybiaquinina-2 (Protopolybiaquinina-II)

Avispa Social Neotrópical (Protopolybia exigua) 1582 Avispa Social Neotrópical (Protonectarina sylveirae ) 1.583 Avispa Social Neotrópical (Protopolybia exigua) 1.583 Avispa (Polistes lanio ) 1.604 Avispa Social Neotrópical (polistine wasp) 1610,2 Avispa Social Neotrópical (Polybia paulista) 1613 Avispa Social Neotrópical (Polybia paulista ) 1.617 Avispa (Parapolybia indica ) 1618 Avispa de papel (Parapolybia indica ) 1.619 Avispa Solitaria (Eumenes rubrofemoratus ) 1.624 Avispa (Mischocyttarus phthisicus ) 1630,9 Avispa (Polistes jadwigae ) 1635 Avispa de Papel (Polistes jadwigae ) 1635 Avispa de Papel (Polistes jadwigae ) 1.636 Avispa Solitaria (Eumenes rubronotatus ) 1645 Avispa Solitaria (Eumenes rubronotatus) 1.645 Avispa Solitraia (Eumenes fraterculus) 1.645 Avispa Social Neotrópical (Polybia paulista) 1654 Avispa Social Neotrópical (Polybia paulista) 1.655 Avispa Social Neotrópical (polistine wasp) 1658 Avispa Social Neotrópical (Polybia paulista) 1660,1 Avispa Cazadora Arañas (Cyphononyx dorsalis ) 1692,8 Avispa Cazadora Araña (Cyphononyx dorsalis ) 1.693 Avispa (Vespula vulgaris) 1.731 Avispa de Papel (Polistes dorsalis ) 1757,1 Avispa (Vespula vulgaris ) 1.758 Avispa (Paravespula vulgaris ) 1758,2 Avispa (Polistes lanio ) 1.770 Avispa (Paravespula vulgaris ) 1831,2 Avispa de Papel Europea (Polistes dominula / Vespa dominula) 1854,1 Avispa de Papel Europea (Vespa dominula ) 1.856 Avispa de Papel Europea (Polistes dominula ) 1909,1 Avispa Social Neotrópical (Polistes major) 1909,2 Avispa de Papel Europea (Vespa dominula ) 1.911 Avispa Social Neotropica (Polistes major) 1.911 Avispa Parcita (Coccygomimus disparis ) 1945,3 Avispa (Vespula maculifrons ) 1.960 Avispa Paracita (Coccygomimus disparis ) 1971,3 Avispa Paracita (Coccygomimus disparis ) 1999,3 Avispa (Polistes ) 2097,4 Avispa Social Neotropica (Protopolybia exigua ) 2203,6 Avispa Social Neotropica (Protopolybia exigua) 2.204

ANEXO 3. Tiempos de Retención de Compuestos entre Ideal 45-85 minutos. compuesto m/z 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64

Tiempo Retencion min 1016,7 1019,3 1019,3 1023,3 1025,8 1027,9 1034,4 1034,4 1037,4 1041,1 1041,1 1045,2 1047,8 1047,8 1048,6 1048,6 1052,4 1056,8 1061,5 1067,5

45,3 45,4 46,5 46,6 47 47 48,2 48,7 48,8 49,4 49,7 50,1 50,5 50,7 50,9 51 51,2 51,7 52,1 52,7

compuesto m/z 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Tiempo Retencion min 1073,2 1078,5 1080,1 1080,9 1082,9 1083,4 1085,3 1094,9 1099,8 1099,8 1100,6 1101,7 1101,8 1105,3 1106,3 1106,4 1106,6 1111,7 1112,3 1112,9

52,8 53,2 53,4 53,5 54,6 54,9 55,3 56 56,5 56,6 57 57,1 57,2 57,6 58,1 58,1 58,1 58,4 59,4 59,7

compuesto m/z 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104

Tiempo Retencion min 1114,8 1115,4 1116,4 1116,9 1119,4 1129,6 1130,4 1130,5 1137,3 1137,6 1139,2 1139,5 1139,7 1139,7 1144,5 1146,3 1152,3 1152,9 1153,9 1154

59,9 60,6 60,9 61,8 62,3 62,6 63,1 63,2 63,5 64 64 64,8 65,2 65,3 65,7 65,8 66,4 67,2 67,8 68,5

compuesto m/z 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124

Tiempo Retencion min 1154,2 1161,1 1161,1 1167,8 1167,8 1168,6 1169,4 1169,4 1172,3 1173,9 1175,9 1180,2 1182,1 1182,3 1182,3 1185,1 1185,1 1185,1 1187,1 1189,2

69 69,1 69,6 70,4 70,9 71,1 71,5 71,6 72,7 73 73,9 74,1 74,6 75,2 75,3 76,6 76,7 77,1 77,3 78,2

compuesto m/z 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144

Tiempo Retencion min 1191,3 1192,2 1196,8 1197,3 1198,9 1199,4 1201,6 1203,7 1204 1207,7 1214,2 1215,6 1221,6 1228,3 1230,6 1230,6 1236 1240,2 1242,4 1243,7

78,5 78,8 79,2 79,5 79,8 79,8 80,3 81 81 82,2 82,4 82,9 83,7 84,2 85,8 86,2 86,6 86,7 87,3 88