Determinación de serotipos VP4 y VP7 de rotavirus de humano mediante el uso de anticuerpos monoclonales

1 Rev Biomed 1998; 9:1-6.

Artículo Original

Determinación de serotipos VP4 y VP7 de rotavirus de humano mediante el uso de anticuerpos monoclonales

Guadalupe Ayora-Talavera1, Luis Padilla-Noriega2, Carlos F. Arias2, Susana López2, Fernando I. Puerto1.

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Centro de Investigaciones Regionales "Dr. Hideyo Noguchi". Universidad Autónoma de Yucatán. Mérida, Yucatán, México, 2Departamento de Genética y Fisiología Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México. Cuernavaca, Morelos, México.

RESUMEN. Introducción. Como parte de estudios tendientes a determinar la utilidad de anticuerpos monoclonales para distinguir serotipos de VP4 de rotavirus humanos (RVH), se determinaron los serotipos de P1A y P2 en cepas de campo de RVH, a través de un ensayo inmunoenzimático. Material y Métodos. Se colectaron de Enero a Febrero de 1994, 13 muestras de heces de niños con diarrea aguda, atendidas en la ciudad de Mérida, Yucatán, México, en las cuales se diagnosticó la presencia de rotavirus por electroforesis del RNA viral en geles de poliacrilamida y por un ensayo inmuno-enzimático. Además del serotipo de VP4, a las 13 muestras positivas a rotavirus se les determinó el serotipo de VP7 (G1 a G4) y subgrupo de VP6 (I y II).

Resultados. Doce de las 13 cepas estudiadas (92.3%) fueron serotipo P1A, ninguna P2, y en 2 (7.7%) no fue posible determinar el serotipo de VP4. Así mismo, 9 cepas (69.23%) fueron serotipo G1 y 4 (30.77%) serotipo G3, mientras que 12 cepas (92.3%) fueron subgrupo II, y en una (7.7%) no fue posible determinar el subgrupo. Discusión. Estos resultados demuestran una alta prevalencia del serotipo P1A, y la cocirculación de los serotipos G1 y G3 del subgrupo II de rotavirus en niños con diarrea aguda en la zona geográfica estudiada. (Rev Biomed 1998; 9:1-6) Palabras clave: Rotavirus, Serotipos, anticuerpos monoclonales, diarrea infecciosa aguda.

Solicitud de sobretiros: M. en C. Guadalupe Ayora-Talavera. Centro de Investigaciones Regionales Dr.”Hideyo Noguchi”. Av. Itzáes # 490 x 59. C.P. 97000. Mérida, Yucatán, México. Recibido el 30/Mayo/1996. Aceptado para publicación el 7/Oct./1997.

Vol. 9/No. 1/Enero-Marzo, 1998

2 G Ayora-Talavera, L Padilla-Noriega, CF Arias, S López, FI Puerto. SUMMARY. Serotypes VP4 and VP7 of human rotaviruses are determined using monoclonal antibodies. Introduction. In order to asses the usefulness of monoclonal antibodies to identify the serotype specificity of VP4 from human rotaviruses (HRV), we examined the reactivities of field HRV specimens by an enzyme immunoassay with serotype P1A and P2 specific monoclonal antibodies. Material and methods. For this purpose we collected 13 stool specimens from children with acute diarrhea during January and february of 1994. The samples were tested for rotavirus (RV) by RNA electrophoresis an by enzyme immunoassay. As well as determining the serotype of VP4, we determined the VP7 serotypes G1 to G4, and the VP6 subgroups I and II in the 13 RV positive specimens. Results. Twelve (92.3%) of the 13 RV strains studied were serotype P1A, none P2, and one (7.7%) could not be serotyped for VP4. In addition, 9 strains (69.23%) were serotype G1, 4 (30.77%) serotype G3, whereas 12 (92.3%) strains were subgroup II, and tow (7.7%) could not be subgrouped. Discussion. These results demonstrate a high prevalence of infection with HRV serotype P1A and cocirculation of HRV serotypes G1 and G3, subgroup II, in infants with acute diarrhea in the geographic area studied. (Rev Biomed 1998; 9:16) Key words: Rotavirus, serotype, monoclonal antibodies, acute infectious diarrhea.

INTRODUCCIÓN. Los Rotavirus (RV) del grupo A son uno de los patógenos entéricos más importantes, ya que la infección por este virus es la principal causa de morbilidad y mortalidad por diarrea infecciosa aguda (DIA) (1), causando más de 850,000 muertes anuales en el mundo, específicamente en Revista Biomédica

niños (2,3). Los RV están constituidos por un genoma de 11 segmentos de RNA de cadena doble los cuales tienen pesos moleculares diferentes, característica que le confiere un patrón electroforético. Son monocistrónicos, los cuales codifican seis proteínas estructurales y cinco no estructurales, distribuidas en tres capas concéntricas (núcleo, capa interna y capa externa) (4-6). Estudios tempranos en la clasificación de los RV se basaron en la identificación de subgrupos, epítopes localizados en la proteína VP6. En estos estudios se encontró que los patrones electroforéticos corto y largo, que dependen de la movilidad del segmento 11, se asocian con los subgrupos I y II (7). La capa externa de los RV está formada por dos proteínas, VP4 y VP7, y ambas son capaces de inducir anticuerpos neutralizantes, por lo que la especificidad de serotipo tiene doble clasificación. Se ha llamado serotipo G (por glicoproteína) a los serotipos dependientes de VP7 y P (por proteína sensible a proteasa) a los serotipos que dependen de VP4 (8). Por ensayos de neutralización con sueros hiperinmunes y anticuerpos monoclonales, se han determinado 14 serotipos G, de los cuales 9 infectan a los seres humanos (9-11), pero sólo cuatro de ellos (G1 a G4) tienen relevancia epidemiológica, ya que son los comúnmente encontrados (12-14). Los ensayos de neutralización, detectan anticuerpos tanto contra VP7 como contra VP4, sin embargo, la reactividad predominante es contra los epítopes de VP7, por lo que se han buscado ensayos alternativos o de competencia para determinar la real capacidad de protección que puede tener la proteína VP4. Así, se han producido anticuerpos monoclonales contra proteínas VP4 recombinantes producidas en el sistema de expresión de baculovirus, los cuales han sido capaces de identificar siete serotipos y dos subtipos en VP4 de RV aislados de humanos (RVH) (P1A, P1B, P2A, P3A, P3B, P4, P5A, P6 y P11) (15,16). Por otro lado, se han desarrollado anticuerpos monoclonales (AcM) específicos contra distintos serotipos G, los cuales han

3 Serotipos VP4 y VP7 de rotavirus. permitido llevar a cabo amplios estudios epidemiológicos que nos han permitido conocer la frecuencia de infección por los distintos serotipos G en el mundo (12-14). Sin embargo, como se mencionó anteriormente sólo recientemente se desarrollaron AcM específicos de algunos serotipos P, y éstos no han sido ampliamente usados en estudios epidemiológicos (17,19). El presente trabajo tuvo como objetivo la aplicación de un ensayo inmunoenzimático (ELISA) con AcM específicos contra los serotipos P1A y P2 en muestras de heces fecales de niños con DIA que fueron positivos a RV, para determinar si estos serotipos P están presentes en las muestras analizadas, ya que la literatura menciona que éstos son los serotipos más comunes en niños con DIA y en niños infectados con RVH pero sin DIA, respectivamente.

Serotipo 2 (1 C10), Serotipo 3 (4F8), Serotipo 4 (ST-2G7), Serotipo P1A (1A10), Serotipo P2 (HS6 y HS16), subgrupo I (255/60), subgrupo II (631/9, grupo A (129). Diagnóstico de RV.- Se diagnosticó la presencia de RV en heces por electroforesis del RNA viral en geles de poliacrilamida al 10% seguida de tinción con Nitrato de Plata (21), y por ELISA con AcM proporcionados por H. B. Greenberg (Stanford University, California, E.U.A). Serotipificación de RV.- La determinación de serotipos P, G, grupo A y subgrupo I y II se realizó por medio de un ELISA, utilizando los ACM monoclonales mencionados anteriormente. (13,22). Determinación de serotipos de VP4 y VP7. Se realizó el método de ELISA para determinación de serotipo a las 13 muestras positivas a RV del grupo A por ELISA.

MATERIAL Y MÉTODOS. Recolección de heces.- Se recolectaron 13 muestras de heces positivas a Rotavirus de sendos niños, durante enero y febrero de 1994. Este período coincide con la época del año en la que ocurren la mayoría de las infecciones por RV (13, 20). Estos niños ingresaron por DIA de menos de cinco días de evolución al Hospital regional del ISSSTE en Mérida, Yucatán. En todos los casos se requirió del consentimiento de los padres o tutores. Virus.- Como controles positivos se usaron las siguientes cepas de RV, todas ellas adaptadas a crecer en cultivo de células: K8 (serotipo G1, P3, subgrupo sg 2), Price (G3, P1A, sg2) y ST3 (G4, P2, sg2). Estas cepas fueron propagadas en células MA-104 (células de riñón fetal de rhesus). También se uso la muestra de heces Mex-106, positiva para RV de serotipo G2. Anticuerpos monoclonales.- Los anticuerpos monoclonales fueron obtenidos del Dr. Harry B. Greengerg (División of Gastroenterology, Stanford University, School of Medicine, Stanfor, California U.S.A.) y fueron los siguientes: Serotipo 1 (5E8),

RESULTADOS. Las 13 muestras fueron positivas por electroforésis del RNA viral y positivas a RV por ELISA de grupo A.

Figura 1.- Patrones electroforéticos correspondientes a 9 de las 13 muestras positivas al diagnóstico de RV por la técnica de electroforésis. Las columnas 1-9, corresponden a cada muestra. La última columna corresponde al control positivo. Los números de la izquierda señalan los once segmentos de RNA.

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4 G Ayora-Talavera, L Padilla-Noriega, CF Arias, S López, FI Puerto. De la comparación de los diferentes patrones electroforéticos del RNA viral entre sí (fig. 1) y contra cepas de referencia (datos no mostrados) se pudieron identificar distintos electroferotipos. Todos ellos, correspondientes al llamado patrón largo, sobre todo en los segmentos 7,8 y 9. Doce de las 13 muestras evaluadas (92.3%) fueron positivas al serotipo P1A con base a su reactividad con el AcM 1A10, y ninguna reaccionó con alguno de los dos AcM del serotipo P2. Con respecto a la serotipificación de VP7, 9/13 muestras (64.3%) fueron asignadas al serotipo G1 y 4/13 al serotipo G3 (28.6%), (cuadro 1).

DISCUSIÓN. Se han descrito a la fecha paneles de AcM específicos de los serotipos P1A y P2 (17) y a P1A, P1B y P2 (18), habiéndose determinado la especificidad de estos AcM por ELISA contra cepas de referencia de RVs de serotipo conocido. Sin embargo, este tipo de ensayo no había sido aplicado a muestras de heces positivas a RV, si no sólo a las adaptadas a crecer en cultivo de células. Por lo anterior, resulta clara la necesidad de contar con un ensayo que permita identificar los serotipos de VP4 de muestras de he-

Cuadro 1. Reactividad antigénica en 13 muestras de heces fecales positivas a Rotavirus utilizando anticuerpos monoclonales. Reactividad

n/Total

(%)

VP4/P1A VP4/P2 VP7/G1 VP7/G3 VP7/G2 VP7/G4 VP6/SG II

12/13 0/13 9/13 4/13 0/13 0/13 12/13

(92.3)

Revista Biomédica

(64.3) (28.6)

(92.3%)

ces positivas a RV sin que se hayan adaptado a crecer en cultivo de células in vitro. En este estudio determinamos la reactividad de un grupo de muestras de RV (obtenidas de niños con infecciones sintomáticas por RV), con un AcM específico de serotipo P1A (1A10), y con dos AcM específicos de serotipo P2 (HS6 y HS16). Este es el primer estudio en que se usa el AcM HS16 para este fin. Se determinaron también otras dos características antigénicas de los RV, serotipo de VP7 y subgrupo de VP6, además de la verificación de electroferotipo. Los resultados de este trabajo indican que el serotipo P1A fue detectado en 12 (92.3%) de las muestras estudiadas. Este resultado coincide con otros dos estudios en los que a través de ELISA con AcM se estudió la prevalencia de serotipos de VP4 en diversas localidades de Australia (17) y en Monterrey, México (19), en los que también se identificó que el serotipo P1A es el predominante. La asociación que en este estudio se encontró entre el serotipo P1A de VP4, con los serotipo G1 y G3 de VP7, coincide con la observación de que en cepas de referencia concurren el serotipo P1A con los serotipos G1, G3, G4 ó G9 (15). Asímismo, entre las cepas de serotipo P1A que se encontraron en este estudio, las especificidades de subgrupo II y electroferotipo de patrón largo, coinciden con lo que igualmente se ha reportado para cepas de referencia (7). El análisis de las distintas especificidades antigénicas y genómicas de los RV, como el efectuado en este estudio, permitirá la clasificación antigénica de VP4 de las cepas de RV que circulan en una determinada región de manera constante. Esta propuesta de vigilancia epidemiológica nos permitiría detectar la presencia de cepas atípicas, que podrían dar origen a epidemias con características clínicas más severas que lo usual e incluso infectar y enfermar a personas adultas. Se hace evidente la necesidad de contar con más anticuerpos monoclonales contra la proteína VP4, ya que algunas cepas de RV aisladas

5 Serotipos VP4 y VP7 de rotavirus. de heces fecales no reaccionan contra los que se tienen, lo que nos indica que estos virus cuentan con más determinantes antigénicos en esta proteína, tal como sucedió en una de las muestras. Aunque también es importante señalar que la conservación de la VP4 en la superficie de los virus es muy inestable y fácilmente la pueden perder, al no tener una buena conservación de la muestra antes de su procesamiento (23). AGRADECIMIENTOS. Financiado por CONACYT, según convenio número 3270-N9308.

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