Determinación de coliformes fecales y totales

ARTÍCULOS

Resumen El objeto de! presente trabajo es determinar qué método es más fiable para la determinación de coüformes totales en aguas, tanto tratadas para su potabilización como antes de tratamiento. Para tener un espectro más amplio de casos se han escogido ríos, con una contaminación considerable, manantiales naturales de contaminación reducida y aguas cloradas. El motivo por el cual se ha decidido la elaboración del mismo, es la enorme.disparidad de resultados que se dan en función del medio de cultivo utilizado para la determinación; e incluso con el mismo medio hay bastantes variaciones. ,

TÉCNICOS

Determinación de colorines fecales y totales Comparación entre diversos medios de cultivo Pon Gómez, Mariano; Cabezudo, Dolores; Vázquez, José Luis Laboratorio Central Aquagest Galicia Apartado Correos 853. E-15705 Santiago de Compostela. Tel. 981 - 572723

Palabras clave: Agua superficial. Agua potable, Determinación, Coliformes totales, Coliformes fecales, Medios cultivo.

Summary The determination of faecal and total coliforms. The aim of ¡his study was to determine the most reliable method for determining total coliforms in water both before and after treatment to make it fît for drinking. In order to considera wide spectrum of cases, the sources chosen were rivers with a considerable degree of contamination, natural sprins with very little contamination and chlorinated waters. The reason for this study was the enormous disparity among results depending on the different culture media used and the fact that even with the same medium variations may be quite appreciable.

Keywords:

- v-> »;

Determination, Totalcoliforms; Faecal coliforms, Culture mediai.)~Ä:•••-.•

TECNOLOGÍA DEL AGUA

1. Introdución

A

quagest S. A. es una empresa que lleva 25 años dedicada al tratamiento integrai del agua. En Galicia lleva presente unos 20. En esta comunidad gestiona el scr\ icio de 40 núcleos de población, proporcionando agua a más de 610.000 habitantes. En la actualidad dispone en esta Comunidad de 5 laboratorios, dos dedicados a aguas residuales y dos dedicados a aguas potables, además de uno central que sirve para ambos tipos de agua. La decisión de elaborar este estudio se tomó en Primavera de 1992. cuando tras un estudio comparativo de diferentes medios, se llegó a la conclusión de que el medio que mayor fiabiüdad ofrecía a la hora de determinar coliformes era el medio Endo.

2. Definiciones Se consideran como Coliformes totales a todas aquellas bacterias de morfología bacilar, Gram negativas (G-), aerobias o anaerobias facultativas, citocromo.oxidasa negativas, no esporógenas, que o fermentan la lactosa con producción de gas y ácido a 37 °C en un tiempo máximo de 48 horas y que reducen el nitrato a nitrito. Este grupo comprende ios géneros Escherichia, Citrobacter,

Klebsiella, Enterobacter, Serraba y Edwardsiella pertenecientes a la familia de las Enterobacteriaceae. En 1904, Eijkman propuso que ía producción de gas a partir o de glucosa a 46 °C, podría ser un buen método para la determinación de coliformes de origen fecal. Una modificación de este método sirve aún actualmente para definir las Coliformes fecales, que son aquellas bacterias comprendidas en el grupo anterior que, además, son capaces de o fermentar la lactosa con producción de ácido y gas a 44 °C en un tiempo máximo de 24 horas. Las bacterias incluidas en este grupo son predominantemente Escherichia coli, Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae. aunque otros especies pueden dar resultados positivos. La importancia de la determinación de microorganismos coliformes está en que están siempre presentes en aguas que contienen patógenos entéricos. Por tanto, y dado que su tiempo de supervivencia es muy superior al de microorganismos productores de enfermedades (por ejemplo, señalan Me Feters et alter que mientras un microorganismo coliforme sobrevive una media de 17 horas, una Salmonella typhi tiene una vida media de 6 horas y un Vibrio choleras tiene una vida media de 7,2 horas), puede suponerse

ARTÍCULOS

que en la mayoría de los casos en los cuales el agua no contenga coliformes estará libre de bacterias productoras de enfermedades. Por otra parte, el mejor indicador conocido de contaminación fecal de origen humano o animal es la presencia de coiiformes fecales, ya que las heces contienen dichos microorganismos, presentes en la flora intestinal, y de ellos, entre un 90% y un 100% son Escherichia Coli.

3. Métodos y materiales Para la detección y enumeración de microorganismos coiiformes se usaron tres medios endo diferentes y uno de presencia ausencia. En los tres casos en los cuales se utilizó medio endo, la técnica aplicada fue filtración de membrana, mientras en el caso de P/A fue la adición de un reactivo al agua a analizar. Igualmente, destacar que ias membranas filtrantes fueron siempre las mismas: Millipore HAWG 047. El equipo de filtración se componía de una rampa de filtración Hydrosol de acero inoxidable con 6 puestos para portafiitros de 47 mm (Millipore Ref XX25 047 00) y la bomba de vacío era también de la misma casa, de 220v/50Hz de ref. XX55 22050. Los medios endo utilizados fueron de tres casas distintas y de características diferentes. E! primero era un medio deshidratado, de la casa BBL: Endo-broth con agar granulado (BBL cat num. 1199), que debía prepararse in situ. EI segundo era un medio ya preparado en placas de la casa Bio-Mérieux: Endo gelose/agar (Bio-Mérieux cat num 43 231). El tercero era un método de cartón absorbente y viales preparados del mediode la casa Millipore de ref. M000 050 2E. En los trescasos se consideraron como conformes totales todas las colonias o con brillo metálico verde que aparecían en las placas incubadas a 37 °C y como coiiformes fecales las mismas colonias pero en las placas o incubadas a 44 °C.

TÉCNICOS

En el caso de P/A se utilizó un test basado en la reacción de los microorganismos coiiformes con la ONPG (o-ß-nitrofenil-galactopiranósida) que produce coloración amarilla. La posible presencia de coiiformes fecales se determina por reacción con la MUG (4-rnetilumbeliferil-ß-D-glucoronido), que en presencia de E. coli produce fluorescencia a la luz ultravioleta (366 nm). Este método, aprobado por la EPA en 1989, es el que se usó como referencia de calidad para los otros tres. Como reactivo se usó el Colilert Test (USA patent num 4925/89). Como testigo se usaron cepas de Enterobacter cloacae, suministradas por el SVM (Foundation for the advancement of public health and enviromental protección) holandés, obtenidas dentro del programa: "Development, Improvement and certificationof microbiological reference materiais for examination of water and food" y que sirven como material de referencia. Para confirmar que se trata de dicho microorganismo se identificaron los cultivos obtenidos con un método API, siendo el resultado obtenido de una fiabilidad del 99.7% según ía T de Student.

4. Resultados obtenidos El número total de casos estudiados fue de 243. a cada uno de los cuales se les aplicó el mismo tratamiento: 3 placas incubadas, o una con cada medio, a 37°, 3 placas incubadas, de nuevo una con cada medio a 44° y una incubación con medio colilert®. Se usaron, como ya se

ha mencionado, aguas cloradas y aguas brutas (no depuradadas) para tener presuntos casos de contaminación y de no contaminación. La proporción usada fue de 162 muestras de agua sin depurar y 81 muestras de agua clorada. De los diversos análisis que se pueden hacer, se empieza haciendo un balance total de las muestras que dieron contaminadas y de las que no dieron. El número total de muestran que presentó coiiformes totales en un medio u otro fue de ! 80, en el caso de coiiformes fecales el resultado fue de 45. Si se hace el mismo estudio por medios, se tiene ¡a tabla 1. Como se desprende fácilmente de la tabla 1, en el caso de la deter1 minación de coiiformes totales existe una gran divergencia de resultados, por lo que es más interesante un estudio pormenorizado de las coincidencias medio a medio. Si hacemos una tabla de coincidencias, teniendo en cuenta todos los casos, placas con y sin colonias, el resultado que se obtiene Tabla 2 y Tabla 3..

TECNOLOGIA DEL AGUA

ARTÍCULOS

TÉCNICOS

Coliformes totales Millipore

Bio-Mérieux

Millipore

180

Biagal 1

.I? "

Bio-Mérieux Biogal

En las aguas cloradas ''". la coincidencia fue mucKúitnUmayortaguas

ColÜert

Biogal Colilert

De las tablas anteriores, se deduce que la concordancia, en el caso de coliformes fecales, es muy buena -en ei peor de los casos es de un 96,7%-. Sin embargo, en ei caso de ios coliformes totales dicha concordancia disminuye de forma considerable -aquí, en el mejor de los casos es de un 83,3%-. Esta discrepancia de resultados es la, que se intenta analizaren las conclusiones. 5. Conclusiones Mientras no se mencione lo contrario, las conclusiones que se relacionan son válidas para el caso de la determinación de coliformes totales. Si se hace un estudio estadístico de ios resultados que se obtienen en la tabia 2, se observa que ¡a concordancia de valores oscila entre ei 58,4% de coincidencias entre los medios de Millipore y Coliiert y e! 83,3% en el caso de Bio-Mérieux y Colilert. Si se profundiza más en e! análisis y se hace un estudio de desviaciones estándar, se obtienen los siguientes datos Tabla 4., siendo la desviación estándar entre los distintos casos : a„, =33,06

TECNOLOGIA DELACUA

que son valores excesivamente altos como para hablar de resultados reproducibies. Sin embargo, y aunque parezca paradójico, comparando los resultados con los encontrados en la bibliografía (6,9,15), no se encuentran errores mayores que en los mismos, y tas causas que pueden citarse como causantes de este hecho son: la ambigüedad en ¡a definición de organismo coliforme, ya que existen coliformes que no dan brillo metálico en medio endo (por ejemplo Enterobacter cloacae) y también cepas anaerobias que fermentan la lactosa ( 1 ). Otra causa de dis crepancia está en la composición de los distintos medios Endo en función de la preparación, ya que el medio de Biogal, preparado in situ y el medio en viales de Millipore presentan un mayor número de inhibidores de crecimiento (probablemente esta sea la causa de la buena coincidencia entre estos dos medios) que el suministrado preparado por Bio-B Mérieux,

con lo que el crecimiento de colonias es menor y se reduce e! número de falsos positivos. De todas formas, y para completar el estudio en cuestión se está repitiendo el mismo y procediendo a identificar cada tipo de colonia que se obtiene en un medio'selectivo. para ver si el porcentaje de falsos positivos es lo suficientemente alto como para causar estas grandes variaciones en los resultados. Podría pensarse que ei medio de fluorescencia es el más adecuado, y aunque es de suponer que así sea. dado que se trata de un medio aún en prueba y que no está oficialmente reconocido como medio de referencia, no se puede asegurar que su fiabilidad sea absoluta. De echo, al repasar la bibliografía (11,16), se encuentra que algunas especies de Salmonelle y Shigella pueden dar falsos positivos con el MUG. Igualmente, la ONPG es selectiva para algunos microorganismos de las Enteriobacteriaceae que no se encuentran en eí grupo de las coiiformes. Finalmente, debe destacarse que en el caso de aguas cloradas, ¡a coincidencia fue muchísimo mayor que en las aguas brutas, como era de esperar, ya que se reduce drásticamente el número de falsos positivos, por

ARTÍCULOS

lo que el sistema de incubación se muestra mucho más adecuado para este tipo de aguas. Este caso se puede deducir comparando las tablas I y II. ya que la gran coincidencia de resultados se da en placas que no presentaron colonias, que proceden de aguas cloradas. En el caso de las coüformes fecales sólo comentar la gran coincidencia de resultados, que es muy fácil de explicar debido a la mayor rigurosidad en la definición, con io cual se reduce mucho más el, campo de los falsos positivos y se reduce el número de errores.

3.

4.

5.

ó. Agradecimientos/ Los autores desean expresar su más amplio agradecimiento y felicitación al personal de ta ETAP del Tambre, con mención especial para la técnico de laboratorio Ma Pilar Pena por la ayuda prestada en la elaboración de este trabajo.

6.

7.

7. Bibliografía 1. American Society for testing and materials.(1916) Tentative method for evaluating water testing membrane filters for fecal coliform recovery. Reprinted for annual book of ASTM standars. April 1976. 2. APHA-AWWA-WPCP. Metodos normalizados para el análi-

8.

9.

TÉCNICOS

sis de aguas potables y residuales (Standard methods 7th edition). Madrid 1992. Eijkman, C. Die Garungsprobe bei 46 als Hilfsmittel bei der Trink Wassereruntersuchung. 3Centralbl. Bakteriol. lAbt. I, Orig. 37 742-752 (1904) Feachem, R. G. Enfermedades infecciosas relacionadas con el suministro de agua y los servicios de eliminación de residuos fisiológicos. Agua. Editorial Blume 1988. Barcelona. Geldreich, E. E.; Harold, F. C. y Huff, C. B. Fecal coliform organism medium for the membrane filter technique. JAWWA 57 208-214(1965). Geldreich, E. E.; Jeter, H. L. y Winter M. S. Technical considerations in applying the membrane filter procedure. 3APHA 1966. McFeters. G. A. Et al. Comparative survival of indicator bacteria and enteric pathogen in well water. Appl. Environ. Microbiol.27 1823-829(1974). Millipore. Microbiología de aguas. Manual AB323/P Texto actualizado abril 91. Madrid 1991 Peterson J. Comparison of MF technique and MNP technique for the estimation of coiiforms in water. The Public Health Laboratory 32 1182-193(1974).

10. Power, D. A. y McCuen, P. J. Manual of BBL products and laboratory procedures. Sixth edition. Maryland USA 1988. 11. SioatS.yZielC.Theu.se of indicator organism to assess the safety of public water. Technical information Series-Booklet num. Hach company. Loveland USA 1987. 12. Measuraments & Testing, June 1993 Vol 1 num 1, Commission of the European Communities DG XII Science, Research and Development 13. Reference materials, for water microbiology, Enterobacter cloacae, ISVM&RIVM, Bilthoven. Oktober 1993., 14. Rapi Id 20 E, Catalogue Analytique, Bio-Mérieux s.a., 3é édition. Mai 1992. Marcy-l'Etoile France. 15. Ismail Yaziz, M. A comparison between Millipore liquid bacteriological media and Sartoriu;, dehidrated nutrient media for the detection and enumeration of coliform and fecal coliform in contamined waters. Project for Millipore Asia Limited. University Pertanian Malaysia. March 1991. 16. Feng,P:C:S: and Hartman. P.A.. 1982, "Fluorogenic assays for inmmediate confirmation of Escherichiacoli". Appl. Environ. Microbiol. 43 11320-1329 (1982).

TECNOLOGIA DEL AGUA