ARTÍCULOS ORIGINALES
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES CONTRA VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO TIPO 16 Alba Lucía Cómbita*, Pierre Coursaget**, María Mercedes Bravo*
ABSTRACT Introduction: The L1 capsid protein of HPV, expressed in recombinant systems, self-assembled into virus-like capsids (VLPs). These VLPs have the ability to package irrelevant plasmidic ADN. The pseudovirions obtained have the capacity to transfer the plasmidic ADN into epithelial cells (pseudoinfection), where the reporter gene is expressed. Objetive: In this study our purpose was to analyze the presence of NAbs (neutralizing antibodies) in human sera by using an assay based on the capacity of these antibodies to inhibit VLP-mediated gene transfer. Methods: The presence of NAbs was studied in 30 serum samples from woman with normal cytology report, 31 women with cervical carcinoma, the viral status and the presence of VLPs antibodies being known. Forty-five sera from children were also included. Results: NAbs were not detected in children nor in women negative for HPV DNA and antibodies to VLPs. Women positive for antibodies to VLP but negative for HPV ADN, who could be considered as individuals that cleared viral infection, were also negative. An important proportion of women with cervical cancer presented NAbs.
Conclusions: The employed assay allows the detection of NAbs in a specific way. The frequencies of NAbs increase according to the grade of the lesion; the same tendency has been observed for anti-VLPs antibodies. Key Words: Viral Antibodies, Papillomavirus Human, Virion/genetic, DNA.
RESUMEN Introducción: La proteína mayor de la cápside L1 de los HPV expresada en sistemas recombinantes se autoensambla y conforma partículas semejantes a virus (VLP) que pueden empacar ADN plasmídico irrelevante en su interior. Los pseudoviriones así obtenidos tienen la capacidad de transferir el ADN plasmídico a líneas celulares epiteliales (pseudoinfección), transferencia que se puede detectar por la expresión del gen reportero que porta el plásmido. Objetivo: El propósito en este estudio fue analizar la presencia de anticuerpos neutralizantes (AcsN) para HPV16 en sueros humanos mediante un ensayo basado en la capacidad de estos anticuerpos de inhibir la transferencia de genes mediada por pseudoviriones.
* Grupo de Inmunología, Instituto Nacional de Cancerología ** Laboratoire de Virologie Moléculaire, Faculté de Sciences Pharmaceutiques, Université de Tours, France. Recibido el 1 de febrero de 2003 y aceptado para publicación el 19 de marzo de 2003. Correspondencia: Dra. María Mercedes Bravo, MSc.Grupo de Inmunología INC, ESE Calle 1 No. 9-85 piso 1, Bogotá (Colombia). Correo electrónico:
[email protected] Este trabajo fue financiado por Colciencias (código 2101-04-10255) y por el Instituto Nacional de Cancerología, a través del proyecto de inversión “Definición de variantes de L1 de HPV16 y de la respuesta inmune en pacientes con cáncer de cérvix”.
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Métodos: Se analizó la presencia de AcsN para HPV16 en 30 sueros de mujeres con citología normal, 31 sueros de mujeres con cáncer de cérvix, con estado viral y presencia de anticuerpos anti VLP conocidos, y en 45 sueros de niños. Resultados: No se detectaron AcsN en sueros de niños o de mujeres negativas para ADN viral y para anticuerpos anti-VLP. Estos anticuerpos tampoco fueron detectados en mujeres negativas para ADN viral pero positivas para anticuerpos anti-VLPs, que podrían ser consideradas como individuos que se recuperaron de la infección. Entre las mujeres con carcinoma de cérvix, una proporción importante presentó AcsN. Conclusiones: El ensayo empleado permite detectar AcsN y es específico. Los porcentajes de AcsN observados se correlacionan con los reportados en detección de anticuerpos anti-VLP, puesto que su frecuencia de detección se incrementa en la medida en que se incrementa el grado de la lesión. Palabras clave: Anticuerpos virales, Virus de Papilloma Humano, Virion/genética, ADN.
INTRODUCCIÓN Los virus del papiloma humano son virus ADN de doble cadena que infectan células epiteliales y se asocian con lesiones intraepiteliales cervicales de bajo y alto grado, condilomas y cáncer de cerviz.(1) El cáncer de cérvix ocupa el segundo lugar en el mundo como causa de muerte por cáncer. En mujeres se estima que la incidencia mundial del carcinoma cervical diagnosticado anualmente es de 470.606; 233.372 mujeres mueren anualmente de carcinoma cervical, en gran parte en países en vías de desarrollo(2); en Estados Unidos, los HPV son el patógeno viral de transmisión sexual más común.(3) A la fecha existen más de 100 tipos de HPV descritos. Los tipos denominados de bajo riesgo como el HPV6 y HPV11 se asocian con la producción de verrugas genitales, mientras que los tipos de alto riesgo, como el HPV16 y HPV18, se asocian con el desarrollo de cáncer cervical.(4) Existe importante evidencia epidemiológica de la asociación etiológica de estos virus y el cáncer de cérvix derivada del hecho de que su ADN es detectado en el 99,7% de casos de cáncer de cerviz.(5) El HPV16 es el más prevalente, pues está presente en más del 50% de los tumores del cérvix, en la mayoría de regiones geográficas estudiadas(6) el
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HPV16 y 18, más los tipos 31, 33, 45, 52 y 58, están presentes en más del 90% de carcinomas de cérvix.(7, 8, 9) La proteína mayor de la cápside L1 de los HPV, expresada en levaduras, células de insecto o células de mamífero, se autoensambla y conforma partículas semejantes a virus (VLP) compuestas por 72 pentámeros de L1 en una estructura icosahédrica T = 7.(10,11,12) En varios estudios de modelos animales (conejo, perro, bovinos) se ha demostrado que la inmunización con VLP genera AcsN específicos de tipo y protege de la infección experimental. (13,14,15) Las epítopes conformacionales de las VLP son esenciales en la inducción de estos anticuerpos.(16) La detección de AcsN es importante, de un lado, para el estudio de su papel en la historia natural de la infección por estos virus y, de otra parte, en la evaluación de la inmunogenicidad de las vacunas profilácticas. El estándar de oro para detección de AcsN en infecciones por papilomavirus es el sistema de xenotransplantes en ratones atímicos.(17) En este método, el suero de los individuos es incubado con partículas virales infecciosas y posteriormente adicionado a epidermis aislada de prepucio de neonatos. El tejido es luego implantado bajo la cápsula renal de ratones atímicos. Después de 3 a 4 meses se analizan los tejidos para la presencia de ADN viral y de condilomas. Se considera positiva la presencia de AcsN si la preincubación del inóculo con los sueros reduce o previene la formación de condilomas. La necesidad de múltiples animales y el tiempo que demanda hacen poco práctico este ensayo. Una segunda aproximación para medir estos anticuerpos consiste en generar pseudovirones. En varios estudios se ha demostrado que las VLP tienen la propiedad de empacar ADN plasmídico irrelevante en su interior.(18,19,20) Los pseudoviriones así obtenidos tienen la capacidad de transferir el ADN plasmídico a líneas celulares epiteliales (pseudoinfección), transferencia que se puede detectar por la expresión del gen reportero que porta el plásmido. El Grupo de Virología Molecular, dirigido por Coursaget, en Tours, demostró que la pseudoinfección era inhibida por AcsN generados luego de inmunización con VLP(20); posteriormente, con algunas modificaciones al ensayo inicial, se desarrolló una prueba sensible para detectar la pequeña cantidad de AcsN que se genera luego de una infección natural. En este estudio, el propósito fue analizar, mediante el ensayo basado en pseudoviriones, la presencia de AcsN en sueros de niños y de mujeres con citología normal y con cáncer de cérvix, como una primera aproximación al estudio de estos anticuerpos en relación con la historia natural de la infección.
Cómbita A, Coursaget P, Bravo M.
MÉTODOS Producción de VLP: Las VLP de HPV16 fueron producidas en células de insecto SF-21 infectadas con un baculovirus recombinante que codifica el gen L1 de HPV16 y purificadas según procedimientos descritos previamente.(21)
los pseudoviriones e incubados a 37°C por 30 minutos antes de adicionarlos a las células COS-7. Luego se continuó con el ensayo de transfección descrito en el párrafo anterior. Los resultados se expresaron como porcentaje de inhibición de la actividad de la luciferasa. Se consideró que había presencia de AcsN cuando hubo una inhibición mayor del 80%.(20)
Pacientes y controles: Formación de Pseudoviriones: Se empleó el método de interacción directa. Para esto, 10 µg de VLP de HPV16 y 10 µg de ADN del plásmido p-CMVLuc, que contiene el gen de la luciferasa, fueron mezclados en 40 µl de NaCl 150 mM e incubados durante 30 minutos. Ensayos de transfección: Células COS-7 se cultivaron en placas de 96 pozos en medio D-MEM suplementado con 10% de suero fetal bovino. Luego de 3 lavados con medio libre de suero, los pseudoviriones (VLPs/p-CMVLuc), diluidos en 50 µl, de medio fueron adicionados a cada pozo. Después de una hora de incubación a 37°C, los complejos fueron removidos y reemplazados con 100 µl de medio con suero. Las células se cultivaron 48 horas a 37°C. Finalmente, se midió la expresión de la luciferasa mediante un ensayo quimioluminiscente (Luciferase Gen Reporter Assay de Roche). Para la lectura se empleó un Luminómetro Victor2; Wallace, de Perkin Elmer. La luminiscencia se integró durante 10 segundos. Los resultados se expresaron como cuentas por segundo por pozo.
Se emplearon sueros analizados en un estudio previo para presencia de anticuerpos hacia VLP por ELISA(21), provenientes de mujeres con diagnóstico de carcinoma de cérvix, de mujeres con citología negativa para neoplasia y de niños con edades entre 6 y 12 meses. Se incluyeron: (a-) un grupo de 31 sueros de mujeres con carcinoma de cérvix, de las que 25 eran HPV16 positivas; de estas, 17 eran positivas para anticuerpos a VLP de HPV16 por ELISA y 8 eran negativas; de las 6 negativas para ADN de HPV, una era positiva para anticuerpos anti VLP y 5 negativas; (b-) un grupo de 25 mujeres con citología negativa para neoplasia y para detección de ADN de HPV, de quienes 10 eran positivas para anticuerpos anti-VLP de HPV16 y 15 negativas; (c-) 20 sueros de niños entre 6 y 12 meses de edad, negativos para anticuerpos antiVLP.
RESULTADOS
Detección de AcsN:
La presencia de AcsN en sueros humanos después de la infección natural fue estudiada mediante el ensayo de inhibición de la transferencia de genes. Los resultados obtenidos con los grupos de sueros estudiados se presentan en las Tablas 1 y 2.
La presencia de AcsN en sueros humanos se analizó mediante su capacidad de inhibir la transferencia del gen de la luciferasa a las células COS-7 por parte de los pseudoviriones. Para esto, los sueros diluidos 1 en 20 en buffer fosfato-salino (PBS) se adicionaron a
No se detectaron AcsN en sueros de niños entre 6 y 12 meses de edad. En ninguna de las 25 mujeres con citología negativa para neoplasia se detectaron AcsN, independiente de si eran positivas o negativas para anticuerpos anti-VLP de HPV16 (Ver tabla 1).
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Tabla 1. Detección de AcsN en mujeres de la población general y en niños Grupo
Resultado Anti-VLP
No. positivo para anticuerpos neutralizantes (%)
Niños de 6 a 12 meses de edad
Negativo
0/20 (0,0)
Mujeres con citología negativa para neoplasia y negativas para ADN de HPV16
Positivo
0/15 (0,0)
Mujeres con citología negativa para neoplasia y negativas para ADN de HPV16
Negativo
0/10 (0,0)
En un 39% (12/31) de los sueros de mujeres con cáncer de cérvix analizados se detectaron AcsN. Estos anticuerpos no se detectaron en mujeres negativas para anticuerpos antiVLPs y se presentaron en un 67% de las mujeres positivas para VLPs de HPV16 en ELISA (Tabla 2).
Tabla 2. Detección de AcsN en mujeres con carcinoma de cérvix Grupo
Resultado Anti-VLP
No. positivo para anticuerpos neutralizantes (%)
Mujeres con cáncer de cérvix positivo para ADN de HPV16
Negativo
0/8 (0,0)
Mujeres con cáncer de cérvix positivo para ADN de HPV16
Positivo
11/17 (64,7)
Mujeres con cáncer de cérvix negativas para ADN de HPV16
Negativo
0/5 (0,0)
Mujeres con cáncer de cérvix negativas para ADN de HPV16
Positivo
1/1 (100)
DISCUSIÓN El ensayo de detección de AcsN basado en su capacidad de inhibir la transferencia de genes por las VLP mostró ser específico, ya que no se detectaron estos anticuepos en sueros de niños o de mujeres negativas para ADN viral y para anticuerpos anti-VLP. Sin embargo, no se detectaron AcsN en mujeres negativas para ADN viral pero positivas para anticuerpos anti-VLP, que podrían considerare como individuos que se recuperaron de la infección.
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Entre las mujeres con carcinoma de cérvix, una proporción importante presentó AcsN, tanto entre mujeres positivas como negativas para VLPs (39%). La mayor frecuencia de AcsN se presentó en mujeres con detección de ADN viral en el tumor y anticuerpos anti-VLP (67%) en el suero. Estos resultados se correlacionan con los obtenidos en detección de anticuerpos anti-VLP, puesto que su frecuencia de detección se incrementa en la medida en que aumenta el grado de la lesión.(22,23)
Cómbita A, Coursaget P, Bravo M.
La detección de estos anticuerpos aparentemente está ligada a la presencia de ADN de HPV16 y a la presencia de anticuerpos anti-VLP en estos pacientes. Esos hallazgos también sugieren que los anticuerpos antiVLP detectados en mujeres con citología normal negativos para ADN de HPV16, no son neutralizantes. Puede ser también que los AcsN constituyan una pequeña fracción de los anticuerpos anti-VLP o eventualmente, que el test de AcsN sea menos sensible que el de detección de anticuerpos anti-VLP. Los estudios de AcsN en HPV en relación con la historia natural de la enfermedad son muy escasos en la bibliografía; un reporte de Kawana y colaboradores(24), en el que analizan la presencia de estos anticuerpos en mujeres con citología negativa para neo-
plasia, con neoplasia intraepitelial cervical y con cáncer de cérvix. Ellos emplean también un ensayo de transferencia de genes, con el gen de la ß-galactosidasa como reportero. Estos investigadores informaron 6 de 7 casos de positivos para AcsN en mujeres con citología negativa para neoplasia y presencia de ADN de HPV16. No analizaron mujeres con citología negativa para neoplasia y para detección viral que fue el grupo analizado por nosotros. Contrariamente a nuestros resultados, no detectaron AcsN en 13 mujeres con carcinoma de cérvix positivas para HPV16. En parte, estas diferencias podrían explicarse por el empleo de métodos de detección diferentes. Es necesario hacer estudios más amplios e incluir mujeres con infección persistente, de manera que se pueda tener una mayor claridad sobre el papel de estos anticuerpos en la infección natural.
REFERENCIAS
1. McGlennen RC. Human papillomavirus oncogenesis. Clin Lab Med 2000;20:383-406. 2. Ferlay J, Bray F, Pisani P, Parkin DM. GLOBOCAN 2000: Cancer incidence, mortality and prevalence worldwide. Version 1.0. IARC CancerBase No. 5. Lyon, IARC Press 2001. 3. Phelps WC, Alexander KA. Antiviral therapy for human papillomaviruses: rational and prospects. Ann Intern Med 1995;123:368-382. 4. Lorincz AT, Reid R, Jenson AB, Greenberg MD, Lancaster W, Kurman RJ. Human papillomavirus infection of the cervix: relative risk associations of 15 common anogenital types. Obstet Gynecol 1992;79:328-37. 5. Walboomers JM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA, Shah KV et al. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol 1999;189:12-19. 6. Bosch FX, Manos MM, Muñoz N, Sherman M, Cansen A, Peto J et al. Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective. International biological study on cervical cancer (IBSCC) Study Group. J Natl Cancer Inst 1995;87:796-802.
7. Koutsky LA, Holmes KK, Critchlow CW, Stevens CE, Paavonen J, Beckmann AM et al. A cohort study of the risk of cervical intraepithelial neoplasia grade 2 or 3 in relation to papillomavirus infection. N Engl J Med 1992;327:1272–1278. 8. Remmink AJ, Walboomers JM, Helmerhorst TJ, Voorhorst FJ, Rozendaal L, Risse EK. The presence of persistent high-risk HPV genotypes in dysplastic cervical lesions is associated with progressive disease: natural history up to 36 months. Int J Cancer 1995;61:306-311. 9. Schiffman, MH, Bauer HM, Hoover R. Epidemiologic evidence showing that human papillomavirus infection causes most cervical intraepithelial neoplasia. J Natl Cancer Inst 1993;85:958-964. 10. Zhou J, Sun XY, Stenzel DJ, Frazer IH. Expression of vaccinia recombinant HPV16 L1 and L2 ORF proteins in epithelial cells is sufficient for assembly of HPV virion-like particles. Virology 1991; 185:251-257. 11. Hofmann KJ, Cook JC, Joyce JG, Scultz LD, George HA, Rosolowsky M et al. Sequence determination of human papillomavirus type 6a and assembly of virus-like particles in Saccharomyces cerevisiae. Virology 1995;209:506-518.
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12. Sasagawa T, Pushko P, Steers G, Grschmeissner SE, Hajibagheri MA, Finch J et al. Synthesis and assembly of virus-like particles of human papillomaviruses type 6 and type 16 in fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Virology 1995; 206:126-135. 13. Breitburd F, Kirnbauer R, Hubbert NL, Nonnenmacher B, Desmaret C, Orth G et al. Immunization with virus like particles from cottontail rabbit papillomavirus (CRPV) can protect against experimental CRPV infection. J Virol 1995; 69:3959–3963. 14. Suzich JA, Ghim SJ, Palmer-Hill FJ, White WI, Tamura JK, Bell JA et al. Systemic immunization with papillomavirus L1 protein completely prevents the development of viral mucosal papillomas. Proc Natl Acad Sci 1995;92:11553-11557. 15. Jarrett WF, Smith KT, O’Neil BW, Gaukroger JM, Chandrachud LM, Grindlay GJ et al. Studies on vaccination against papillomaviruses: prophylactic and therapeutic vaccination with recombinant structural proteins. Virology 1991;184:33-42. 16. Christensen ND, Kirnbauer R, Schiller JT, Ghim SJ, Schlegel R, Jenson AB et al. Human papillomavirus types 6 and 11 have antigenically distinct strongly immunogenic conformationally dependent neutralizing epitopes. Virology 1994; 205:329–335. 17. Bonnez W, Rose RC, Da Rin C, Borkhuis C, De Mesy Jensen KL, Reichman RC. Propagation of human papillomavirus type 11 in human xenografts using the severe combined immunodeficiency (SCID) mouse and comparison to the nude mouse model. Virology 1993; 197:455-458. 18. Kawana KH, Yoshikawa Y, Taketani K, Yoshiike K, Kanda T. In vivo construction of pseudovirions of human papillomavirus type 16: incorporation of
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REVISTA COLOMBIANA DE CANCEROLOGÍA
plasmid ADN into reassembled L1/L2 capsids. J Virol 1998;10298-10300. 19. Roden RB, Greenstone HL, Kirnbauer R, Booy FP, Jessie J, Lowy DR et al. In vitro generation and type-specific neutralization of a human papillomavirus type 16 virion pseudotype. J Virol 1996;70:5875-5883. 20. Touzé A, Coursaget P. In vitro gene transfer using human papillomavirus-like particles. Nucleic Acids Res 1998;26:1317–1323. 21. Cómbita AL, Touzé A, Coursaget P, Bravo MM. Respuesta serológica hacia las cápsides de los papilomavirus oncogénicos tipos 16, 18, 31, 33, 39, 58 y 59 en mujeres colombianas con cáncer de cérvix invasivo. Rev Col Cancerología 2003;7:26-34. 22. De Gruijl TD, Bontkes HJ, Walboomers JMM, Schiller JT, Stukart MJ, Groot BS et al. Immunoglobulin G responses against human papillomavirus type 16 virus-like particles in a prospective nonintervention cohort study of women with cervical intraepithelial neoplasia. J Natl Cancer Inst 1997; 89:630-638. 23. De Gruijl TD, Bontkes HJ, Walboomers JMM, Coursaget P, Stukart MJ, Dupuy C et al. Immune responses against human papillomavirus (HPV) type 16 virus-like particles in a cohort study of women with cervical intraepithelial neoplasia (CIN I). differential T-helper and IgG responses in relation to HPV infection and disease outcome. J Gen Virol 1999;80:399-408. 24. Kawana K, Yasugi T, Kanda T, Kawana Y, Hirai Y, Yoshikawa H et al. NAbs against oncogenic human papillomavirus as a possible determinant of the fate of low-grade cervical intraepithelial neoplasia. Biochem Biophys Res Commun 2002;9;296 (1):102-105.
