FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
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L.Gómez, O. Guevara. J. Narváez.
Caracterizacion morfológica y capacidad germinativa de semillas de L.mutabilis
CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y CAPACIDAD GERMINATIVA DE SEMILLAS DE Lupinus mutabilis Sweet.
L.Gómez, O. Guevara, J. Narváez.
aUniversidad de Nariño-Sede Pasto.bDepartamentos de Biologìa
Programa de biolgia
Resumen
En este trabajo se determinó la morfología y se evaluó la capacidad germinativa de las semillas de Lupino (Lupinus mutabilis Sweet) bajo diferentes tratamientos de escarificación (químico: inmersión en ácido sulfúrico a 10%, 30% durante 5, 10 min; mecánica: papel lija (factor 150) y control). El peso de 10 lotes de 50 semillas de fue de 12,608 g, el diámetro longitudinal varía entre 9.8410 mm, con una desviación estándar de 0.6399 mm y el diámetro transversal varía entre 7.7915 mm, con una desviación estándar de 0.5341 mm; la viabilidad fue de 96,6666% (prueba de flotabilidad) y 84.6666% (prueba de tetrazolio). Para la velocidad de germinación, se realizó un análisis de varianza multifactorial y la prueba de múltiples rangos Tukey HSD en el programa para computadora STAT GRAPHICS Centurion XVI. No se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos, se presentó una germinación rápida y uniforme, que permiten concluir que las semillas de L. mutabilis no presentan latencia.
Palabras claves: Escarificación química, escarificación mecánica, germinación, Lupino.
Introducción
El páramo es un ecosistema que se ubica generalmente por encima de los 3.000 m de altitud, el cual posee una unas condiciones fisicobióticas que lo convierten en fuente permanente de agua. (Humboldt, 2007). Esta característica, junto con su gran capacidad de almacenamiento y captación de carbono atmosférico a través de la retención de materia orgánica en sus suelos y la absorción del mismo por parte de las plantas en crecimiento (Hofstede et al., 2003), hacen del páramo un ecosistema estratégico de amplia importancia nacional e internacional, el cual se ha degradado con el paso del tiempo, debido a diversos factores, como incendios forestales, sobrepastoreo, tala ilegal, plagas, enfermedades, sequía, heladas, cambio de uso del suelo, entre otros que han afectado en diferente escala los recursos naturales. (Martín, 2005).Por tal motivo, para la restauración de estos ecosistemas es importante considerar especies con capacidad de fijar nitrógeno al suelo para contribuir en la aceleración de la sucesión ecológica. (Pedersen et al. 1986)
Para este fin, existen múltiples especies a elegir, una de las alternativas es el género Lupinus (Mattson, 2007), el cual se encuentra ampliamente distribuido en casi todo el mundo (Eastwood R. et al., 2008). La importancia de éste, radica en el gran potencial que tiene para la alimentación animal y humana, además del efecto positivo sobre la fertilidad y mejoramiento de los suelos, pues es capaz de fijar nitrógeno atmosférico a través de una particular simbiosis con bacterias fijadoras Bradyrhizobium-Lupinus, que lo hacen especialmente tolerante al estrés abiótico; como sequía, suelos ácidos, herbicidas, nitratos, salinidad y metales pesados. (Fernández Pascual et al., 2007).
Sin embargo, estas especies pioneras han desarrollado semillas con cierta características evolutivas de tipo fenotípico con tamaño pequeño, testa dura y forma redonda, junto con otras de tipo fisiológico como dormancia condicional que les permite permanecer por largos periodos de tiempo en el suelo, hasta cuando un disturbio proporciona las condiciones ambientales favorables para que ocurra su germinación y establecimiento.( Leck et al. 1989; Baskin & Baskin 1989; Baker 1989; Garwood 1989; Fenner 1995; Thompson et al, 1998; Ghersa & Martinez- Ghersa 2000).
De aquí que los factores naturales y la intervención del hombre para estimular este proceso son de gran importancia. Rodríquez y Rojo en 1997, determinaron que la semilla del genero Lupinus germina mejor después de aplicarle tratamientos pregerminativos escarificatorios destinados a reblandecer la cubierta seminal (Rodríguez y Rojo, 1997; Acosta y Rodríguez, 2005). Por tal razón, el presente trabajo, pretende hallar estrategias adecuadas para estimular la germinación de Lupinus mutabilis sweet analizando los efectos de factores mecánicos y químicos de escarificación, y de esta manera contribuir en la restauración de nuestros ecosistemas naturales.
Metodología
Colecta de la semilla
Las semillas se colectaron en el municipio de Ipiales (Nariño), en la vereda Yaramal, ubicada a una altura de 2755 m.s.n.m. Las coordenadas geográficas fueron, al Norte: 00°46'37.0" y al Oeste 77°38'22.9".
Análisis de la Semilla
En el proceso de análisis de la semilla se siguieron las normas de ISTA, citadas por Bonner (1974), considerando los siguientes elementos.
Características Físicas: Se describió la morfología de 50 semillas de L. mutabilis, de las cuales se tomaron mediciones de peso y diámetro de las semillas, usando una balanza electrónica y un calibrador (pie de rey) respectivamente.
Viabilidad: Se determinó mediante el procedimiento de flotación. Se colocaron en un recipiente con agua 50 semillas durante 24 horas; el criterio para evaluar la viabilidad de las semillas era que aquellas semillas que se sumergían se consideraban viables. Se utilizó el modelo:
% viabilidad=semillas germinablex100total de semillas
La viabilidad de las semillas de L. mutabilis, se evaluó mediante la Prueba Topográfica por Tetrazolio (PTT), para lo cual se tomaron 50 semillas (previamente imbibidas), a las cuales se les removió la cubierta seminal, lo que permitió que el embrión quede expuesto. En una caja Petri se vertió 10ml de cloruro de trifenil-tetrazolium al 1% y sobre esta solución se colocaron 50 mitades de las semillas (3 lotes). Posteriormente, se cubrieron las cajas con papel aluminio aproximadamente por tres horas a 36° C en incubadora.
Tratamientos pregerminativos: Este estudio se llevó a cabo en cámara húmeda, para ello se colocaron en las cajas Petri una doble capa de papel filtro (Baskin y Baskin 2001) y agua destilada humedeciendo las capas del papel filtro y colocando las semillas (medio estándar de germinación). Se registró la germinación diariamente, considerando germinadas las semillas cuando la radícula alcanzó un tamaño de 0,1 mm. Se usaron 50 semillas por cada unidad experimental, con tres repeticiones para cada tratamiento, y se analizaron diferentes factores de respuesta de la semilla, como son el porcentaje y velocidad de germinación.
Escarificación con H2SO4: Los tratamientos consistieron en la escarificación química de semillas de L. mutabilis con ácido sulfúrico al 10% y al 20%, durante 5 y 10 minutos. Para ello se utlizaron 50 semillas por cada tratamiento. Las semillas fueron depositadas en un Beaker de 50 ml, agregando el ácido hasta que estas quedaban completamente sumergidas, manteniéndolas en agitación continua. Una vez transcurrido el tiempo de cada tratamiento, las semillas fueron retiradas del beaker y colocadas en un colador plástico. Inmediatamente después las semillas se lavaron con agua corriente por 1 minuto para eliminar los residuos de ácido presentes en la semilla.
Escarificación mecánica: Se realizó un desgaste de la testa de la semilla de L. mutabilis empleando papel lija (factor 150) como un abrasivo, para ello se tomaron 50 semillas.
Porcentaje de Germinación: El porcentaje de germinación se determinó con la siguiente formula:
% viabilidad=semillas germinablex100total de semillas
Velocidad de Germinacion: La velocidad de germinación de las semillas se calculo con la fórmula:
V=Dias x numero de semillas germinadasNumero total de semillas
Análisis estadístico
Se realizó un análisis de varianza multifactorial con el fin de determinar si había o no diferencias significativas entre las medias a diferentes niveles de los factores y si hay o no interacciones entre velocidad de germinación y tratamientos. Complementándose con la prueba de múltiples rangos Tukey HSD.
Se realizaron gráficos de medias con el fin de establecer la presencia de diferencias significativas entre las variables analizadas teniendo en cuenta los límites de confianza dados por el programa STATGRAPHICS Centurion.
Resultados y discusión
El chocho o tarwi (Lupinus mutabilis Sweet) es una leguminosa de origen andino, de importancia estratégica en la alimentación por su alto contenido de proteína (40%), sus características agronómicas, y su capacidad de fijación de nitrógeno y adaptabilidad a diferentes medios ecológicos, ubicados entre 2800 y 3600 msnm. (Rivera 1998).
Características Físicas
La semilla de L. mutabilis posee un color blanco opaco y una forma ovoide con longitudes variables en sus dimensiones.
Peso de la semilla: La semilla está conformada por dos cotiledones y una radícula embrionaria equivalente a 88.97% del peso total. Estos son de color amarillo oscuro debido al contenido de grasas y carotenoides (Ortega E. et al, 2010).
Figura 1. Grafica de comparación de los pesos de las semillas de Lupinus mutabilis. La grafica 1 presenta mayor peso en los lotes 4, 7 y 10, el peso promedio de los 10 lotes de 50 semillas es de 12,608g.
Diámetro de la semilla Lupinus mutabilis: El diámetro promedio longitudinal es de 9.8410 mm, con una desviación estándar de 0.6399 mm. El diámetro promedio transversal es de 7.7915 mm, con una desviación de estándar de 0.5341 mm (anexo 2); y un promedio en el diámetro longitudinal de 9,8435mm.
Tabla 1. Diámetro longitudinal y diámetro transversal de las semillas de Lupinus mutabilis.
Este tamaño de la semilla se considera intermedio si se compara con el tamaño de otras semillas leguminosas como fríjol y arveja que tienen un diámetro de 10.2 y 6.6 mm respectivamente (Codex Stand, 1989). La semilla de Lupinus mutabilis sweet posee un 17% más de diámetro en comparación con la semilla de soya (6.3 mm). El mayor tamaño del lupino frente a otras semillas es un indicador de la mayor capacidad de nutrientes que puede almacenar. (Ortega E et al, 2010).
Viabilidad por flotación: Se encontró que el porcentaje por flotabilidad es alto, con un porcentaje de 96,67% (Tabla 2).
Lotes
Porcentaje
1
100
2
94
3
96
PROMEDIO
96,67
Tabla 2. Porcentaje de viabilidad por flotación de las semillas de Lupinus mutabilis.
El fundamento del método se basa en que las semillas vacías es decir las que no han desarrollado convenientemente el embrión y el endosperma flotan en agua, (Capisto C. 2004) por tal razón se consideraron no viables, en general las semillas analizadas presentaron una viabilidad alta, lo que indica que las semillas de Lupinus mutabilis, son de buena calidad.
Viabilidad por prueba de Tretrazolio
El criterio para la evaluación por tetrazolio de las semillas de Lupinus mutabilis, se basó en la coloración tanto del embrión como del cotiledón. Cuando el embrión y el cotiledón se tiñeron completamente de color rojo carmín o rasado intenso, se podía denominar las semillas como viables, pero cuando estas presentaban porciones sin teñir tanto en el embrión y el cotiledón, se clasificaban como no viables. De acuerdo a los criterios anteriores se realizó un mapa topográfico (imagen 1).
Las semillas analizadas presentaron un porcentaje de viabilidad de 84,66% (Tabla 3), lo que indica que las semillas de L. mutabilis, presentan una alta viabilidad, que representa una alta probabilidad de germinación.
REPLICA
VIABLES %
NO VIABLES %
1
76
24
2
87
13
3
91
9
Promedio
84,6666667
15,33333333
Tabla 3. Porcentaje de viabilidad por prueba de Tetrazolio de las semillas de Lupinus mutabilis.
En la Imagen 1, se puede observar los tres casos presentados para la prueba de viabilidad por tetrazolio. Las semillas muestran distintos aspectos cuando son expuestas a esta prueba. La figura A y B, presentan porciones sin teñir (embrión y el cotiledón) y se clasifiron como no viables. La figura C muestra tanto el embrión y el cotiledón teñidos completamente.
Imagen 1. Casos registrados para las semillas de L. mutabilis.
La solución incolora de la sal cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio funciona como un indicador de varios procesos de reducción que ocurren en las células vivas. Luego que la solución de tetrazolio es embebida por la semilla, en las células vivas de los tejidos se lleva a cabo una reacción química de óxido-reducción en la cual participan las enzimas deshidrogenasas presentes en los tejidos vivos. En esta reacción, los protones hidrógeno liberados en el proceso de respiración reducen a la sal de tetrazolio a formazan, esta es una sustancia estable, no difusible, de coloración rojiza, que permite distinguir las áreas vivas de las semillas (áreas de color rojo o rosado según la concentración empleada de la sal), de las zonas muertas (de color blanco) (Hampton y Tekrony, 1995).
Tratamientos pregerminativos
Porcentaje de Germinación
Se observa que el mayor porcentaje de germinación es el correspondiente al tratamiento pregerminativo de la escarificación química tres (EQ 3 10%- 10 min) con un porcentaje del 94%, seguido de la prueba control tres (control 3) con un porcentaje del 84%. El porcentaje más bajo de germinación en la prueba control uno (control 1) con un porcentaje del 22%.
TRATAMIENTO Y REPLICAS
porcentaje de germinación
EQ 1 30%- 5 MIN
44%
EQ 2 30%- 5 MIN
44%
EQ 3 30%- 5 MIN
48%
EQ 1 30%- 10 MIN
58%
EQ 2 30%- 10 MIN
26%
EQ 3 30%- 10 MIN
50%
EQ 1 10%- 5 MIN
32%
EQ 2 10% -5 MIN
58%
EQ 3 10%- 5 MIN
26%
EQ 1 10%- 10 MIN
48%
EQ 2 10%-10 MIN
42%
EQ 3 10% -10MIN
94%
EM 1
44%
EM 2
52%
EM 3
28%
CONTROL
22%
CONTROL
34%
CONTROL
84%
Tabla 4. Porcentaje comparativo de germinación entre los diferentes tratamientos, sus réplicas y el control.
Los porcentajes de germinación obtenidos pueden explicarse por la fermentación que presentan las semillas de Lupinus mutabilis sweet con esporas del moho perteneciente al género Rhizopus (Villacres E, et al, 2006), estos fitopatógenos inciden sobre su germinación (Montoya C. y Cataño J., 2011) algunas especies de este género son por lo general saprofitos, contaminantes de semillas en numerosas especies vegetales [Neergaard, 1988], que afectan negativamente la germinación y están asociados al desarrollo anormal de semillas [Ismail et al., 2012], lo que corrobora los datos obtenidos.
Velocidad de germinación
De la prueba ANOVA Multifactorial con un valor P= 0,6927 se encontró que no existen diferencias significativas entre los tratamientos pregerminativos y el control, para determinar la velocidad de germinación, este resulta se corrobora con el análisis de rangos multiples de la prueba de Tukey (anexos Tabla 6)
Figura 5. Gráfico de medias para el análisis de velocidad de germinación. Velocidad de germinación por tratamiento.
En las Figura 5 puede apreciarse no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos, como se muestra en Anexos (Tabla 6). Esto puede explicarse debido a que el tratamiento de escarificación química con H2SO4, a diferentes concentraciones (10% y 30) y diferentes tiempos de aplicación del ácido, si bien es eficiente en muchos casos para romper el letargo físico, presenta también ciertas desventajas, como ocasionar serios daños a la semilla (Willan, 1990). Posiblemente en algunos casos, el ácido haya penetrado causando daños al embrión, y en consecuencia se haya reducido el porcentaje de germinación (Willan, 1990). Al igual, la escarificación mecánica se usó con el fin de desgastar la testa de la semilla y de esta manera permitir la entrada de humedad una vez que se haya sembrado. Posiblemente la escarificación mecánica con lija no fue suficiente para reducir la testa de las semilla por lo cual no pudo ocurrir el proceso de germinación ya que el letargo de algunas semillas se debe a que poseen una capa externa impermeable, y no germinarán hasta que esta capa se vea alterada mediante alguna de estas acciones (Patiño et al. 1983, Hartmann y Kester, 1988). Otra posibilidad por la cual no se presentó germinación, puede ser que durante el proceso de desgaste de la testa de la semilla se causó daños al embrión (Willan, 1990). Por ultimo, cabe resaltar, que en un estudio llevado a cabo por Gross, R, en 1982, acerca de Lupinus mutabilis, el cual es un desconocido silvestre en la naturaleza y exhibe muchos de los rasgos típicos de domesticación encontró que esta especie presenta indehiscencia de las vainas, semillas grandes, y una germinación rápida y uniforme, corroborando los resultados obtenidos, en los cuales, los efectos de la escarificación en la germinación, tanto con ácido como con papel de lija, permiten comprobar que las semillas de Lupinus mutabilis no presentan latencia.
Conclusiones
Las semillas de Lupinus mutabilis presentan un porcentaje de viabilidad superior al 80% en las pruebas realizadas.
Los resultados obtenidos determinaron que las semillas de Lupinus mutabilis presentan germinación uniforme independientemente del tratamiento pregerminativo aplicado.
Se observó que la contaminación por fitopatógenos (Hongos) disminuyo la viabilidad de las semillas y el porcentaje de germinación.
No se encontró un tratamiento pregerminativo que aumente considerablemente la velocidad en la germinación de las semillas de Lupinus mutabilis Sweet.
Recomendaciones
Realizar estudios en medios adecuados para la germinación de las semillas que permitan controlar la contaminación por hongos y de esta manera obtener mejores resultados.
Realizar análisis fisicoquímicos a las semillas para determinar sustancias que alteren la germinación.
Bibliografia
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Anexos
Análisis de la semilla
Tabla 5. Diámetro promedio longitudinal y transversal. Desviación y error estándar.
Tabla 6. Análisis de varianza para velocidad de germinación
Fuente
Suma de Cuadrados
Gl
Cuadrado Medio
Razón-F
Valor-P
EFECTOS PRINCIPALES
A:TRATAMIENTO
0,572055
5
0,114411
0,61
0,6927
B:DIAS
10,9621
10
1,09621
5,84
0,0000
RESIDUOS
9,37928
50
0,187586
TOTAL (CORREGIDO)
20,9135
65
Tabla 7. Pruebas de múltiple rangos para velocidad de germinación por tratamiento.
Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD
TRATAMIENTO
Casos
Media LS
Sigma LS
Grupos Homogéneos
EM 1
11
0,310909
0,130588
X
EQ 1 10%- 5 MIN
11
0,360636
0,130588
X
CONTROL
11
0,374545
0,130588
X
EQ 1 30%- 10 MIN
11
0,378727
0,130588
X
EQ 1 30%- 5 MIN
11
0,441182
0,130588
X
EQ 1 10%- 10 MIN
11
0,601182
0,130588
X
Contraste
Sig.
Diferencia
+/- Límites
CONTROL - EM 1
0,0636364
0,547235
CONTROL - EQ 1 10%- 10 MIN
-0,226636
0,547235
CONTROL - EQ 1 10%- 5 MIN
0,0139091
0,547235
CONTROL - EQ 1 30%- 10 MIN
-0,00418182
0,547235
CONTROL - EQ 1 30%- 5 MIN
-0,0666364
0,547235
EM 1 - EQ 1 10%- 10 MIN
-0,290273
0,547235
EM 1 - EQ 1 10%- 5 MIN
-0,0497273
0,547235
EM 1 - EQ 1 30%- 10 MIN
-0,0678182
0,547235
EM 1 - EQ 1 30%- 5 MIN
-0,130273
0,547235
EQ 1 10%- 10 MIN - EQ 1 10%- 5 MIN
0,240545
0,547235
EQ 1 10%- 10 MIN - EQ 1 30%- 10 MIN
0,222455
0,547235
EQ 1 10%- 10 MIN - EQ 1 30%- 5 MIN
0,16
0,547235
EQ 1 10%- 5 MIN - EQ 1 30%- 10 MIN
-0,0180909
0,547235
EQ 1 10%- 5 MIN - EQ 1 30%- 5 MIN
-0,0805455
0,547235
EQ 1 30%- 10 MIN - EQ 1 30%- 5 MIN
-0,0624545
0,547235
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