Caracterización molecular de Olluco empleando la técnica de AFLP

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ESTO ES UNA REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA NO UNA INTRODUCCIÓN.

La introducción debe contener:

EL problema
Justificación
Importancia
Hipótesis y
Objetivo del trabajo realizado

Todo esto en dos páginas como máximo.
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR (AFLP) DE OLLUCO (Ullucus tuberosus C.) COLECTADA EN CUSCO, PERÚ
Ochoa M.
MOLECULAR CHARACTERIZATION (AFLP) OF OLLUCO (Ullucus C. tuberosus) COLLECTED IN CUSCO, PERU
Ochoa M.
RESUMEN
La investigación fue para caracterizar molecularmente muestra de "Olluco" (Ullucus tuberosus C.) provenientes de la región Cusco y determinar el grado de polimorfismo y relación genética. Se tomaron 30 muestras escogidas al azar para realzar la extracción de ADN a partir de sus hojas frescas, para que luego sea aplicada la técnica de AFLP que implica digestión, ligación, pre-amplificación y amplificación selectiva del ADN. La calidad y concentración de ADN obtenido fue alto, el porcentaje de bandas polimórficas fue de 30.76%; siendo E12M32 la combinación que presento mayor numero de bandas polimórficas de las 3 combinaciones utilizadas por otro lado el análisis de clusters dio como resultado 4 grupos.
Palabras clave: Polimorfismo, diversidad genética, digestión, ligación.
ABSTRACT
The research was to molecularly characterize sample "Olluco" (Ullucus C. tuberosus) from the Cusco region and determine the degree of polymorphism and genetic relationship. 30 random samples to enhance the extraction of DNA from fresh leaves, which then is applied to the AFLP technique involves digestion, ligation, preamplification and selective amplification of DNA were taken. The quality and concentration of DNA obtained was high, the percentage of polymorphic bands was of 30.76%; E12M32 being the combination showed higher number of polymorphic bands of the 3 combinations used on the other cluster analysis resulted in 4 groups.
Keywords: polymorphism, genetic diversity, digestion, ligation.

INTRODUCCION
La caracterización molecular es una técnica que ayuda al estudio de la diversidad genética entre y dentro de las variedades de una especie, con el fin de conservar y aprovechar estos recursos, una de las especies más estudiadas es la papa en un estudio que se caracterizo 168 variedades de papas (Solanum spp) cultivadas en el Perú empleando la técnica de microsatélites se determino que la mayor diversidad genética estaba en la región sur del Perú mientras que la mayor fuente de variación genética es interna entre las regiones, y la mayor variación genética interregional se dio entre Norte y Centro. Por otro lado, se apreció que las variedades nativas tienen una mayor diversidad genética que las mejoradas y la variación genética entre ellas es considerable (Ponce et al 2013). En otro estudio realizado en camote (Ipomoea batatas L.) empleando también la técnica de microsatélites encontró que el enriquecimiento de las librerías genómicas alcanzó el 1.59 % de un total de 2900 colonias evaluadas por diferentes métodos de selección, como White/blue, Colony lift y Southern blot. Por otro lado quince pares de iniciadores fueron diseñados y ocho de ellos mostraron polimorfismo en un total de once accesiones de camote, provenientes de diversos lugares del mundo, mantenidas en el banco de germoplasma en el Centro Internacional de la Papa (CIP) (Yañes et al 2002). En un estudio realizadoen arroz (Oryza sativa L.) mediante AFLP para evaluar la diversidad genética de variedades de arroz venezolanas donde se 220 bandas desde 25 a >300pb, de las que 60 (27,27%) resultaron polimórficas, con promedio de 12 bandas por combinación; además el índice de diversidad de Shannon para cada combinación varió de 0,17 a 0,41 con promedio de 0,29 ±0,10. Dicho índice mostró un moderado nivel de polimorfismo genético entre las variedades, líneas élites y arroz rojo (Yorman et al 2008).
El olluco (Ullucus tuberosus C.) es un tubérculo con un protagonismo en la canasta peruana considerable, y eso la hace una especie atractiva para un estudio de su diversidad genética con miras a la conservación y buen aprovechamiento de sus recursos. En el presente trabajo se realizo la caracterización molecular del Olluco (Ullucus tuberosus c.) traídos del Cusco empleando la técnica de AFLP, con el cual se obtendrá un alto polimorfismo entre la población a evaluar. La técnica modificada que se empleo para la extracción de ADN dio buenos resultados por la calidad y la concentración obtenida en trabajos similares realizados por Cóndor (2012) y por López (1995) se obtuvo resultados muy iguales. Con respecto al porcentaje de bandas polimórficas fue de 39.76 % que es considerable ya que se trabajo con una población no muy grande (30 individuos escogidos al azar) a diferencia del trabajo realizado por Cóndor (2012) que obtuvo un porcentaje de bandas polimórficas menor a la nuestra a pesar de trabajr con una población mucho mas numérica.

MARCO TEORICO
Antecedentes
La caracterización molecular es una técnica que ayuda a conocer la diversidad genética entre y dentro de las variedades de una especie, así como la relación genética entre las variedades. Así tenemos que Ponce (2013) caracterizó 168 variedades de papas cultivadas (Solanum spp) del Perú usando microsatélites y encontró que la mayor diversidad genética estaba en la región Sur del Perú; mientras que la mayor fuente de variación genética es interna entre las regiones, y la mayor variación genética interregional se dio entre Norte y Centro. Por otro lado, se apreció que las variedades nativas tienen una mayor diversidad genética que las mejoradas y la variación genética entre ellas es considerable. En el análisis de agrupamiento se observó una tendencia de las papas diploides a formar un grupo distinto al de las tetraploides y que las variedades mejoradas tienden a formar un grupo estructurado en el dendrograma. Estos resultados sugieren que la diversidad genética se mantiene entre las regiones, que las frecuencias alélicas de las variedades diploides se diferencian de las tetraploides y que la mayor fuente de variación genética poblacional es interna.
Otro ejemplo es la caracterización molecular de Camote (Ipomoea batatas L.) usando la técnica de Microsatélites por Yañes (2002) para generar mayor cantidad de microsatélites con el objetivo de construir dos librerías genómicas utilizando el ADN del cultivar africano "Tanzania". Su búsqueda se baso en hallar microsatélites trinucleotidos los cuales cuentan con la particularidad de reducir considerablemente la presencia de "bandas tartamudas" en comparación con los microsatélites dinucleotidos y encontró que el enriquecimiento de las librerías genómicas alcanzó el 1.59 % de un total de 2900 colonias evaluadas por diferentes métodos de selección, como White/blue, Colony lift y Southern blot. Por otro lado quince pares de iniciadores fueron diseñados y ocho de ellos mostraron polimorfismo en un total de once accesiones de camote, provenientes de diversos lugares del mundo, mantenidas en el banco de germoplasma en el Centro Internacional de la Papa (CIP).
Otro ejemplo es la identificación de marcadores moleculares en la introgresión de líneas mejoradas F5 con resistencia a la roya del café usando la técnica de AFLP de García (2012) El cual identifico marcadores ligados a la introgresión foránea de C. canephora dentro de Coffea arabica principalmente en componentes resistentes de la variedad Castillo. Empleo 36 pares de combinaciones de primers AFLPs (amplied fragment length polymorphism) en una muestra que incluye un total de 74 individuos entre introgresados y no introgresados distribuidos en bulks con lo que logró identificar 28 fragmentos correspondientes a posibles marcadores de introgresión; en adición once de estos marcadores presentaron un porcentaje de 38 a 66% de homología con posibles proteínas involucradas en resistencia.
Otro trabajo es la caracterización molecular de Arroz (Oryza sativa L.) mediante AFLP por Yorman (2008). Para evaluar la diversidad genética de variedades de arroz venezolanas y de líneas élites provenientes del Plan Nacional de Mejoramiento Genético de Arroz (INIA y otras instituciones), de la Fundación Danac y de Productores Asociados Chispa, usando cinco combinaciones de iniciadores AFLP. Además se incluyeron dos arroces rojos con lo que registraron 220 bandas desde 25 a >300pb, de las que 60 (27,27%) resultaron polimórficas, con promedio de 12 bandas por combinación; además el índice de diversidad de Shannon para cada combinación varió de 0,17 a 0,41 con promedio de 0,29 ±0,10. Dicho índice mostró un moderado nivel de polimorfismo genético entre las variedades, líneas élites y arroz rojo. Por otro lado el análisis de agrupamiento permitió identificar cinco grupos, a una distancia de ~0,50 unidades ultramétricas. El primer grupo quedó conformado solo por arroces rojos; los grupos restantes estuvieron constituidos tanto por variedades como por líneas experimentales avanzadas. Con lo que se concluyo que las combinaciones AFLP permitieron la diferenciación de todos los materiales, observándose asociación entre los agrupamientos generados y la constitución genética de los genotipos. Este trabajo corrobora la utilidad de los AFLP como herramienta para discriminar entre individuos altamente emparentados.

Posición taxonómica del Olluco
Reino
Plantae
División
Magnoliophyta
Clase
Magnoliopsida
Orden
Caryophyllales
Familia
Basellaceae
Genero
Ullucus
Especie
Ullucus tuberosus








Origen y Distribución
Ullucus tuberosus es una planta originaria de la región andina y crece en sitios templados y frígidos, entre los 2 900 a 3 900 m. desde Bolivia, Perú central, Ecuador y Colombia. El olluco posiblemente procede de una planta silvestre Ullucus tuberosos Caldas subps. aborigeneus, que se encuentra en Peru, Bolivia y norte de Argentina (Fernández A. et al. 2007).
Usos
El olluco al igual que la papa, son parte de la dieta del poblador especialmente andino. Se consume en guisos, sopas, se seca para la preparación de hojuelas y se almacena para utilización posterior. Sus hojas tienen un alto contenido de proteínas, calcio y caroteno, se le consume en ensaladas. Expuestos los tubérculos al sol y frio forma el "chuño" o "digli" que se usa para la elaboración de sopas (Fernández A. et al. 2007).
Marcadores Moleculares AFLP
AFLPs son fragmentos de DNA (80 - 500 pb) obtenidos por restricción con endonucleasas y amplificadas por PCR. La técnica involucra tres etapas: (i) restricción del DNA y ligación de los oligonucleótidos adaptadores; (ii) amplificación selectiva de los grupos de los fragmentos de restricción; (iii) análisis de gel de los fragmentos amplificados. Amplificación PCR de los fragmentos de restricción se logra usando el adaptador y secuencias de sitios de restricción como sitios blancos para el anclaje del iniciador. La amplificación selectiva se logra por el uso de iniciadores que extienden dentro de los fragmentos de restricción, amplificando solamente estos fragmentos flanqueados. Usando este método, grupos de los fragmentos de restricción pueden ser visualizados por PCR sin conocer la secuencia de nucleótidos. El método permite la co-amplificación específica de números altos de los fragmentos de restricción. Generalmente 50 - 500 fragmentos de restricción son amplificados y detectados sobre geles de poliacrilamida (Vos et al., 1995; McClean, 1996) (Figura 1).











Figura 1. Principio de la técnica AFLP (adaptado de De Viene, 1998).
OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GENERAL
Caracterización molecular empleando marcadores moleculares AFLPs en Ullucus tuberosus C. colectados en Cusco.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Estimar el grado de polimorfismo de cada individuo.
Determinar el grado de relación genética (distancia genética) entre las diferentes muestras de la comunidad en estudio.
FLUJOGRAMA DE ESTUDIO
Muestra BiológicaExtracción de ADNPurificación Calidad y Cuantificación ADN (Electroforesis horizontal en Agarosa 1%)ADNDilución Análisis de AFLPDigestiónLigaciónPre- amplificaciónAmplificación SelectivaE13M32E12M32E32M32E32M35E45M32E32M40E45M41E13M41Screening (Electroforesis vertical en poliacrilamida)E32M35E45M32E12M32ScoreoDendogramaData de bandas PolimórficasMuestra BiológicaExtracción de ADNPurificación Calidad y Cuantificación ADN (Electroforesis horizontal en Agarosa 1%)ADNDilución Análisis de AFLPDigestiónLigaciónPre- amplificaciónAmplificación SelectivaE13M32E12M32E32M32E32M35E45M32E32M40E45M41E13M41Screening (Electroforesis vertical en poliacrilamida)E32M35E45M32E12M32ScoreoDendogramaData de bandas Polimórficas
Muestra Biológica
Extracción de ADN
Purificación
Calidad y Cuantificación ADN (Electroforesis horizontal en Agarosa 1%)
ADN
Dilución
Análisis de AFLP
Digestión
Ligación
Pre- amplificación
Amplificación Selectiva
E13M32
E12M32
E32M32
E32M35
E45M32
E32M40
E45M41
E13M41
Screening (Electroforesis vertical en poliacrilamida)
E32M35
E45M32
E12M32
Scoreo
Dendograma

Data de bandas Polimórficas
Muestra Biológica
Extracción de ADN
Purificación
Calidad y Cuantificación ADN (Electroforesis horizontal en Agarosa 1%)
ADN
Dilución
Análisis de AFLP
Digestión
Ligación
Pre- amplificación
Amplificación Selectiva
E13M32
E12M32
E32M32
E32M35
E45M32
E32M40
E45M41
E13M41
Screening (Electroforesis vertical en poliacrilamida)
E32M35
E45M32
E12M32
Scoreo
Dendograma

Data de bandas Polimórficas


















MATERIALES Y METODOS
Diseño Experimental
Para el análisis estadístico se determinó un diseño factorial evaluando tres combinaciones de primers (niveles) en una población de 30 individuos (factores), para determinar el número de marcadores por individuo evaluado, el índice de similaridad (genético), coeficiente Simple Machine (SM), Análisis de clusters SHAN empleando el Método de Grupos de Pares no Ponderados con la Media Aritmética (UPGMA), la variabilidad genética y el poder discriminatorio de los pares de iniciadores utilizados evaluando el contenido de información polimórfica (PIC) tomando los valores significativos mayores al 0.05 y menores a 0.5.
Colección de muestras biológicas:
De una población de 150 individuos se escogieron al azar 30 plantas las cuales fueron sometidas a todos los procesos descritos a continuación.
Extracción de ADN (Método de Doyle & Doyle modificado de acuerdo al Laboratorio del IBT de la UNALM)
La extracción de ADN se realizó mediante el método de CTAB (Bromuro de hexadeciltrimetilamonio) a pequeña escala, se empleó el protocolo de Doyle & Doyle et al. 1987 con algunas modificaciones adaptados en el Instituto de Biotecnología de la UNALM. La extracción de ADN consistió en los siguientes pasos:
Se procedió a obtener aproximadamente 3 o 4 g de tejido foliar en buen estado, fue colocado en un mortero limpio y estéril luego se procedió a enfriarlo con nitrógeno líquido en una cantidad suficiente hasta enrazar el mortero, luego se esperó hasta que se evapore el nitrógeno líquido por completo dejando la hoja completamente fría y lista para ser molida de una forma homogénea y rápida para obtener un polvo y evitar su oxidación.
Luego se dejó enfriar los eppendorf con el nitrógeno líquido luego se vació del mortero de frente al eppendorf previamente enfriado por completo para evitar que la molienda se pegue al borde y se pierda muestra. Se añadió 700 uL de buffer CETAB 2X mercapto se dejó a 4 °C hasta el día siguiente.
Se saco las muestras y se las puso a baño maría a 65 °C por 30 minutos; se mezclo ocasionalmente de manera suave cada 10 minutos transcurridos.
Transcurrido el tiempo de incubación, se dejo enfriar los tubos eppendorf, se añadió 700 uL cloroformo/OHisoamílico (24:1) y se mezclo suavemente hasta una disolución total.
Luego son llevados a centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos, terminada la centrifugación se observaran dos fases en los eppendorf se procedió a extraer el sobrenadante en otro eppendorf estéril y se le agrego 50 uL de CTAB 10X –NaCl 7M, y se mezclo suavemente. Al mismo tubo eppendorf se añadió 700 uL de cloroformo/OHisoamilico (24:1) y se mezclo hasta lograr una disolución total, se llevo a centrifugar por 10 minutos a 14000 rpm.
Se transfirió el sobrenadante a nuevos tubos eppendorf estériles y se añadió un volumen de 500 uL de propanolisoamilico y se dejó precipitar durante 30 minutos hasta que se forme la medusa de ADN.
Se centrifugo por 15 minutos a 14000 rpm se voto el sobrenadante y nos quedamos con el pellet.
Al pellet se le agrego 500 uL de etanol al 70% y se centrifugo por 15 minutos a 10000 rpm, se vuelve a descartar el sobrenadante y nos quedamos pellet este paso se realizo 2 veces.
Al pellet se le volvió agregar 500 uL de etanol pero al 90% se centrifuga y se descarto el sobrenadante, se dejo secando aproximadamente 30 minutos luego se le agrega 30 uL de Agua MiliQ esterilizada se homogenizo y se le agrega 1 uL de ARNasa y se incubo a 37 °C por 30 minutos. Y se almaceno a -20 °C.
Pruebas de Calidad y Cuantificación de ADN:
La calidad de ADN se midió por electroforesis, con geles de agarosa al 1% en un buffer TBE 1X. Se corrieron 1 uL de ADN más 9 de SalB 1X se hace una dilusion del stock de SalB 10X (Bromofenol blue 75 mg, Xilene cyanol 75 mg, Orange G 100 mg, TBE 10X 2.5 ml, sucrosa 30 gr agregar primero 10 ml de agua MiliQ esteril mezclar y luego enrazar hasta 50 ml) 1:10 con agua MiliQ. La electroforesis se realizo en un equipo horizontal (Sub-Cell Model 192 BioRAd) a una carga de 90 voltios durante 40 minutos. Se uso como marcador de peso molecular el λ DNA digerido con Pst I (presentando la primera banda 280 ng/uL que representa 14000 pb). La cuantificación se realizó mediante una comparación de intensidad de fluorescencia del ADN de cada muestra con la intensidad de fluorescencia del marcador λ ADN, lo que nos permitió estimar la concentración de ADN en cada muestra. Luego de acuerdo al cálculo se diluye hasta 50 ng/uL.
Analisis de AFLP:
El análisis de AFLP, se realizó según el procedimiento descrito por Vos et al. (1995) en el manual del Kit AFLP de invitrogen (2003) pero con algunas modificaciones adaptadas al laboratorio de Biología Molecular del IBT.

Digestión:
Se prepara el master mix de la digestión H2O MiliQ esteril (0.7 uL), de buffer 10X NEB #2 (2 uL), BSA 10X (2 uL), EcoRI NEB 20 u/uL (0.2 uL), MseI NEB 5 u/uL (0.1 uL), los volúmenes empleados fueron multiplicados de acuerdo al número de muestras procesadas que fueron 30; luego se dispenso el master mix en una placa de PCR (5 uL por pocillo) y se le agrego 5 uL de ADN del stock de las diluciones que están a una concentración de 50 ng/uL. Y se dejó incubando a 37 °C de un dia para otro.
Preparación de Adaptador EcoRI:
Se mezcló 10 uL de la cadena EcoRI adapter 1 y 10 uL de la cadena EcoRI adapter 2, y se adiciono 80 uL de agua MiliQ esterilizada para completar los 100 uL, luego la mezcla fue llevada al termociclador y fue sometida a 95°C por 5 minutos. La concentración de los adaptadores EcoRI fue de 100 mM.
Preparacion de adaptador MseI:
Se mezcló 33.3 uL de la cadena MseI adapter 1 y 33.3 uL de la cadena MseI adapter 2, y se adiciono 33.3 uL de agua MiliQ esteril para completar los 100 uL; los adaptadores estaban a una concentración de 100 mM. Los adaptadores fueron sometidos a la misma temperatura a la que fue sometido los adaptadores de EcoRI, 95°C por 5 minutos.
Ligación:
Para realizar la ligación de adaptadores complementarios a los cortes de cada una de las enzimas de restricción, se prepararon mezclas de reacción de ligación con los siguientes componentes: H2O MiliQ estéril libre de nucleasas (0.1 uL), Buffer de ligasa NEB (1.25 uL), adaptador EcoRI (0.5 uL), adaptador MseI (0.5 uL), T4 ADN ligasa (0.15 uL) estos volúmenes empleados fueron multiplicados según el número de muestras procesadas que fueron 30; una vez mezclados estos componentes son dispensados en placas de PCR esteriles dispensando 2.5 uL por pocillo; se le agrega 20 uL de ADN genómico digerido a cada pocillo con la mezcla del master mix. Luego esta mezcla de reacción de digestión/ ligación (DL) se mezcló, centrifugo y se incubo a Temperatura ambiente por 16 horas. Finalizando la incubación, se realizó una dilución de 1:5 de la mezcla digestión/ligación (DL) con solución tampón TE (10Mm, Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 nM EDTA), tomando 5 uL y 20 uL respectivamente.
Pre amplificación (+1/+1):
Para la pre amplificación (+1/+1) en un eppendorf estéril se preparó el master mix con los siguientes componentes: 11.55 uL de H2O MiliQ esterilizada libre de nucleasas, 2.5 uL 10X PCR buffer, 1.25 uL de mezcla de dNTPs (5 mM), 1 uL EcoRI+1 primer (50 ng/uL), 1 uL MseI+1 primer (50 ng/uL), 2.5 uL de MgCl, 0.2 uL de Taq polimerasa por muestra; por eso se multiplicaron los volúmenes empleados según el número de muestras que fueron 30; se mezcló el master mix y fue dispensado en otra placa de PCR estéril 20 uL por pocillo y se le agrego 5 uL de la dilución de 1:5 de ADN digerido/ligado a cada pocillo.
Todas las reacciones de amplificación llevadas a cabo en este estudio se realizaron en un termociclador. El perfil de temperatura utilizado para el PCR +1/+1 fue el siguiente:
1: 72 °C por 2 minutos
2: 94 °C por 4 minutos
3: 94 °C por 30 segundos
4: 56 °C por 1 minuto
5: 72 °C por 1 minuto
6: repetir desde el paso 3 al 5 (22 ciclos)
7: conservar a 4 °C
Amplificación Selectiva (+3/+3):
Para la amplificación selectiva (+3/+3) se empleó el mismo procedimiento que se aplicó para la pre amplificación pero con la variación de los primers; se preparó el master mix en un eppendorf estéril con los siguientes componentes: 2.75 uL H2O MiliQ, 1.1 uL 10X PCR Buffer, 0.6 uL dNTPs (5mM), 2.0 uL EcoRI+3 primer (50 ng/uL), 0.3 uL MseI+3 primer (50 ng/uL), 1.1 uL de MgCl, 0.15 uL de Taq polimerasa se multiplico a estos volúmenes según el número de muestras (30) se mezcló bien y se dispenso en otra placa de PCR estéril un volumen de 8 uL por pocillo y se le agrego 2 uL de la pre amplificación diluida 1:20, se mezcló y se centrifugo y luego fue llevado al termociclador para que se dé la amplificación.
El programa utilizado para la amplificación selectiva fue el siguiente:
1: 94 °C por 4 minutos
2: 94 °C por 20 segundos
3: 65 °C por 30 segundos
4: 72 °C por 2 minutos
5: 94 °C por 20 segundos
6: 65 °C por 30 segundos bajando a 1 °C por ciclo
7: 72 °C por 2 minutos
8: repetir desde el paso 5 al 7 10 ciclos
9: 94 °C por 20 segundos
10: 56 °C por 30 segundos
11: 72 °C por 2 minutos
12: repetir desde el paso 9 al 11 20 ciclos
13: 60 °C por 30 minutos
14: 4 °C
Para este estudio se realizó un ensayo con 8 combinaciones de iniciadores AFLPs con 8 muestras escogidas al azar. Para elegir las combinaciones que generen mayor polimorfismo este procedimiento es más conocido como Screening.
Tabla 1: Combinaciones de iniciadores AFLPs utilizados en la selección de mejores combinaciones.



Combinacion de iniciadores AFLPs
EcoRI
MseI
E13M32
E13
AG-3
M32
AAC-3
E12M32
E12
AC-3
M32
AAC-3
E32M32
E32
AAC-3
M32
AAC-3
E32M35
E32
AAC-3
M35
ACA-3
E45M32
E45
ATG-3
M32
AAC-3
E32M40
E32
AAC-3
M40
AGC-3
E45M41
E45
ATG-3
M41
AGG-3
E13M41
E13
AG-3
M41
AGG-3







Separación de los productos de AFLP en geles de poliacrilamida al 6%.
Los productos de amplificación selectiva (+3/+3) fueron separados con un equipo de electroforesis vertical en geles denaturantes de poliacrilamida al 6%. Se mezcló el producto de la amplificación selectiva con 6 uL de amortiguador de carga
RESULTADOS
Calidad y cuantificación de ADN
Se observó un buena calidad y concentración de ADN en la mayoría de la muestras analizadas que presentan concentraciones que van de 40 ng/uL hasta 160 ng/uL (figura 2). Se realizo una nueva extracción de la muestra 18 y se obtuvo una concentración de 50 ng/uL (figura 3).



Figura 2. Gel de agarosa mostrando la calidad de ADN y concentración con respecto al marcador λ (M) digerido con PstI.






Figura 3. Gel de agarosa mostrando la calidad y concentración de ADN de la segunda extracción de la muestra 18.


Selección de combinaciones de iniciadores de AFLP y marcadores AFLPs detectados:
Con respecto al análisis molecular se realizó un Screening para escoger las combinaciones de iniciadores que generan mayor polimorfismo; de las 8 combinaciones se escogieron 3 que produjeron mayor polimorfismo las cuales fueron: E32M35, E45M32, E12M32.
Estas combinaciones generaron 166 bandas de ADN. El número de bandas vario de 52 (E32M35) a 56 (E12M32), con un promedio de 55 bandas por combinación. Alrededor del 39.76 % de las bandas mostraron polimorfismo, y el número de bandas polimórficas por combinación vario de 20 (E32M35) a 24 (E12M32) (Tabla 2.). La detección de bandas polimórficas se realizó en un rango de 900 – 200 pb.
Tabla 2. Marcadores monomórficos y polimórficos obtenidos con cada combinación de iniciadores en el análisis de AFLP en Olluco.
Combinacion de primers
Total de bandas
N° de bandas monomorficas
N° de bandas polimorficas
Porcentaje de bandas polimorficas (%)
E32M35
52
32
20
30.30
E45M32
58
36
22
33.33
E12M32
56
32
24
36.36
Total
166
100
66
100
Promedio
55
33
22

%
100
60.24
39.76








En las muestras evaluadas se observó que la combinación E45M32 mostro ser el más discriminante por tener un índice de iniciador igual a 7.3 con un promedio de PIC de 0.36, no muy lejos esta la combinación de iniciadores E45M32 con un índice de 7.14 y un promedio de PIC de 0.32 y finalmente la combinación de iniciadores E12M32 con un índice de 7.05 y un promedio de PIC de 0.29.
Tabla 3. Promedio de contenido de información polimórfica (promedio PIC) e índices de indicadores empleados en el análisis de marcadores AFLPs en Olluco.
Combinación de iniciadores AFLPs
PIC e Índices
Cusco
E32M35
Índice de indicadores
7.3

Promedio de PIC
0.36
E45M32
Índice de indicadores
7.14

Promedio de PIC
0.32
E12M32
Índice de indicadores
7.05

Promedio de PIC
0.29

El coeficiente de similaridad genética para las 30 muestras analizadas estuvo en un rango de 0.6 a 1 con un promedio de 0.66. Resultados que sugieren niveles medios de diversidad entre las 30 muestras biológicas. El dendograma elaborado por medio del análisis de clusters o grupos, a partir de los datos obtenidos de los valores de similitud se puede visualizar cuatro grupos esto es mostrado en la figura 4.


















Figura 4. Dendograma de caracterización molecular obtenidos por AFLP (marcadores moleculares).
DISCUSIONES
El método modificado que se aplicó para la extracción de ADN produjo un buen resultado en la mayoría de las muestras analizadas, ya que no se observó ADN degradado ni contaminación con ARN; se obtuvieron concentraciones que van desde 40 ng/uL hasta 160 ng/uL. En la muestra número 18 se observó una concentración menor a 50 ng/uL (40ng/uL) por lo que condujo a realizar una nueva extracción del material de reserva; se logro obtener una concentración mínima de 50 ng/uL que se requiere para la aplicación del protocolo de generación de bandas AFLP, resultados similares fueron obtenidos por Cóndor (2012) y por López (1995).
Con respecto al análisis molecular se realizó un Screening para escoger las combinaciones de iniciadores que generan mayor polimorfismo; de las 8 combinaciones se escogieron 3 que produjeron mayor polimorfismo las cuales fueron: E32M35, E45M32, E12M32. En el trabajo realizado por Cóndor et al. 2012 obtuvo 8 combinaciones polimórficas esto probablemente se debió a que trabajo con una población mayor (175 muestras) a diferencia de nosotros que trabajamos con 30 muestras.
De acuerdo a Wolfe y Liston et al. 1998, una de las características resaltantes de la técnica AFLP, es que detecta grandes cantidades de bandas polimórficas lo cual se constato en la presente investigación,
Muller y Wolfenbarger et al. 1999, indican que la técnica AFLP es altamente reproducible, ya que las amplificaciones son dirigidas bajo condiciones de alta selectividad, mostrando casi una perfecta replicabilidad lo cual se constato en la presente investigación.
En el trabajo realizado por Cóndor et al. 2012 genero un mayor número de bandas (438) entre polimórficas y monomórficas pero el porcentaje de bandas que presentaron polimorfismo fue menor (33.11 %) a diferencia de nosotros generamos menor número de bandas pero a pesar de ello se obtuvo mayor porcentaje de bandas polimórficas (39.76 %).
En nuestro trabajo la combinación de iniciadores que genero mayor porcentaje de bandas polimórficas fue E12M32 a diferencia del trabajo realizado por Cóndor et al. 2012, en el que su mayor porcentaje de bandas polimórficas lo presento la combinación E13M32.
En el trabajo realizado por Cóndor et al. 2012, en sus muestra provenientes de Cusco la combinación de iniciadores que mostro ser mas discriminante fue la E32M35 por tener un índice de indicador igual a 6.85 con un promedio de PIC igual a 0.36 y en sus muestras provenientes de Huánuco la combinación de indicadores que mostro ser mas discriminante fue la E12M32 con un índice de indicador igual a 9. 96 con un promedio de PIC igual a 0.43; en nuestro caso la combinación que mostro ser mas discriminante fue la E45M32 con un índice de indicador igual a 7.3 y un promedio de PIC igual a 0.36 a pesar de ser también muestras traídas de Cusco presentan gran diferencia de las trabajadas por Cóndor et al. 2012, en el análisis polimórfico probablemente se podria deber a que se trabajo con una población mucho menor.
En el análisis de clusters que realizamos para la elaboración del dendograma obtuvimos cuatro grupos a diferencia de nosotros en el trabajo realizado por Cóndor et al. 2012, para su población de Cusco obtuvo ocho grupos y para su población de Huánuco obtuvo cinco grupos las diferencias se pueden deber al lugar de procedencia de la muestra biológica y al número de muestras analizadas por cada lugar de donde se extrajo.
CONCLUSIONES

El método modificado que se aplico para la extracción de ADN resulto efectivo y dio buenos resultados.

La combinación E12M32 presento mayor porcentaje de bandas polimórficas.
El porcentaje total de bandas polimórficas fue 39.76 % y los PIC fueron mayor a 0.05 por lo que se demuestra diferencias marcadas entre individuos y no hay presencia de clones.

Se identificaron 4 grupos con una distancia de 0.64 que es considerable.

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