Caracterización de la expresión de la proteína GFAP en un curso temporal post lesión medular inducido en ratones ICR-CD1

Caracterización de la expresión de la proteína GFAP en un curso temporal post lesión medular inducido en ratones ICR-CD1

Castro Valencia Fabián L.1

1 Grupo de investigación en enfermedades neurodegenerativas, Facultad de medicina veterinaria, Universidad del Tolima, Ibagué, Colombia.

Resumen:
Posterior a la lesión medular, el proceso de gliosis tiene gran importancia debido a las repercusiones que tiene sobre las poblaciones celulares en el foco de la lesión. En este estudio, se planteó evaluar la modulación de la proteína GFAP en lesión medular en fase aguda, asociada a la migración de astrocitos. Para ello, se emplearon 6 ratones machos ICR-CD1 los cuales se sometieron a la inducción de la lesión medular mediante punción. Las muestras de médula espinal se obtuvieron a los 0, 30, 60, 120 y 240 minutos de generada la lesión, además de un ultimo ratón no lesionado como control. La expresión de GFAP fue evaluada mediante análisis de proteínas por western blot y análisis densitométricos de las señales. Se evidenció cambios en la expresión de la proteína en los segmentos medulares anterior y medio, con variaciones correspondientes a los diferentes eventos celulares que se presentan a causa de la lesión. Estos cambios sugieren la participación de la astroglia en los procesos post lesión medular, así como la incidencia de los estos sobre las poblaciones astrocitarias circundantes.

Palabras clave: GFAP (Proteína acídica fibrilar glial), Astrocitos, Lesión medular, Migración celular.

Abstract:
After spinal cord injury, gliosis process is a very important because of the implications it has over the cell populations at the site of injury. In this study, It arises evaluate modulation of GFAP protein in acute spinal cord injury associated with astrocyte migration. For this purpose, 6 male ICR-CD1 mice which were subjected to induction of spinal cord injury by puncturing is used. Spinal cord samples were obtained at 0, 30, 60, 120 and 240 minutes of the lesion generated, and a last uninjured mice as control. GFAP expression was assessed by protein analysis by western blot and densitometric analysis of the signals. It evidenced changes in protein expression in the anterior and middle spinal segments, with variations for the different cellular events that occur due to injury. These changes suggest the involvement of astroglia in the post SCI processes and the impact of these on surrounding astrocytic populations.

Keyworks: GFAP (Glial fibrillary acidic protein), Astrocytes, Spinal Cord Injury, Cell migration.


Introducción

La lesión medular es producida por infecciones, traumatismos, neoplasias o enfermedades congénitas, que generan afecciones a nivel motor y sensitivo (Varela, Gonzáles, Regueira, Martínez, & Azevedo, 2010). Posterior a la lesión, se presentan eventos secundarios en los que las neuronas de los axones comprometidos modifican la expresión de proteínas para modular diferentes respuestas de tipo inflamatorio, apoptótico, excitotoxico, prosupervivencia, entre otras (Sandrow & Houlé, 2015). Estos procesos tienen como objetivo restablecer la homeostasis fisiológica, estabilizar el tejido lesionado y compensar los eventos subsecuentes a la lesión (Yokobori, et al., 2015).

Además de las neuronas, otras poblaciones celulares del sistema nervioso pueden verse afectadas, y de igual forma presentar una respuesta frente a la lesión. Es el caso de las células gliales, las cuales proliferan y migran al área de la lesión aumentando la expresión de múltiples proteínas (Levine, 2015). Las células gliales cumplen una función de sostén y nutrición de otras células nerviosas (Rojas, 2014), y durante un proceso de injuria, cambian su condición a glía reactiva, incrementando su tamaño aumentando número de filamentos intermedios en su estructura celular (León, 2012). De esta forma, la glía participa en eventos de compensación que buscan reparar los daños generados por la lesión (Rojas, 2014; León, 2012).

La proteína acídica fibrilar glial (GFAP), es un tipo de filamento intermedio de células gliales, principalmente de astrocitos y células de schwann (Abou-Donia, 2015). Ésta proteína tiene como función dar soporte y rigidez a la membrana celular, estando involucrada en la estructura y la función del citoesqueleto (Lawrence & Ling, 2004). La estrecha relación de GFAP con el citoesqueleto, ha vinculado la proteína al ciclo de división celular, en el que participa modificando la membrana plasmática durante la mitosis (Tardy, Le Prince, Babajko, Riol, Fages, & Rolland, 2013). De igual forma, se le ha asociado al mantenimiento de la barrera hematoencefálica (Kettenmann & Ransom, 2005), y al reclutamiento de la glía durante los sucesos posteriores a daños en el sistema nervioso central, evento denominado reactividad glial (León, 2012; Rodríguez & Vaquero, 2009; Abou-Donia, 2015).

Sandrow & Houlé (2015) y Levine (2015) han demostrado, que GFAP es sobreregulada frente a una lesión medular, siendo importante para la reparación del área lesionada, mediante la formación de la cicatriz glial (proceso favorecido por la glía reactiva). Dado que la reactividad glial, es uno de los primeros eventos que anteceden a una lesión medular (junto con la inflamación) (Sandrow & Houlé, 2015), y teniendo en cuenta que en la actualidad se ha planteado el uso de la proteína GFAP como un biomarcador de diagnóstico de lesión medular en fase aguda (Yokobori, et al., 2015; Abou-Donia, 2015), como un primer ensayo es importante determinar de que forma se está modulando la proteína en la medula espinal en los diferentes momentos posteriores a la lesión.

Materiales y métodos

Animales de experimentación

Se utilizaron 6 ratones ICR-CD1 macho con 35±2,36 g de peso y 17 semanas de edad, obtenidos del bioterio del Instituto Nacional de Salud (Bogotá, Colombia); mantenidos bajo condiciones de ciclos de 12 horas de luz y oscuridad, agua con dextrosa (5mg/100mL) ad libitum y ración de alimento de 4-5 g/animal/día. Los animales fueron tratados de acuerdo a la Ley 84 de 1989 de protección animal en Colombia y la resolución 8430 de 1993. Los experimentos fueron aprobados por Ángel E. Céspedes Rúbio, PhD. director del laboratorio de Toxicología y del grupo de investigaciones en enfermedades neurodegenerativas (END). El diseño experimental se muestra a continuación:

Tabla 1. Diseño experimental del curso temporal de la lesión medular.

Grupo
Tiempo (min)*
Número de individuos
Control
- -
1
Lesionado
0
1

30
1

60
1

120
1

240
1
Total
6
*Tiempo transcurrido desde la lesión hasta el sacrificio.

Procedimiento quirúrgico

Los procedimientos quirúrgicos fueron realizados bajo anestesia somática profunda mediante la mezcla de Xilacina 2% Rompun® (8 mg/kg) y Ketamina HCl Rotexmedica (100 mg/kg) por vía intraperitoneal. También se suministró 0,02 mL de Atropina-Zoo® 1:1000 vía subcutánea, como protector del miocardio y vagolítico. Al entrar en plano, se administró 1 mL de solución salina vía intraperitoneal para compensar la perdida de fluidos.

La columna vertebral se expuso mediante incisión cutánea de 2 cm a lo largo de la línea media dorsal en la región torácica, separando los músculos dorsales. Se realizó laminectomía en el área dorsolateral posterior izquierda de la vertebra T-10 con fresa de diamante dental TENG YUAN acoplada a moto-tool tipo lápiz, para permitir el paso de una aguja hipodérmica BD PrecisionGLIDEMT calibre 23, la cual fue retirada 1 minuto después de generada la lesión. Se suministró 0,02 mL de Adrenalina (1 mg/mL) durante la lesión para prevenir hemorragias. Posteriormente, se dispuso una porción de gelfoam esponja sobre la vertebra laminectomisada y se suturaron los tejidos con nailon quirúrgico 4/0.

El tiempo de cirugía fue de 20 minutos en promedio, después de lo cual los animales se dispusieron en cajas de recuperación en cama térmica.

Para realizar el sacrificio, se inyectó vía intraperitoneal una mezcla de pentobarbital Penthal® (140 mg/kg) y Xilacina (8 mg/kg), induciendo anestesia profunda, depresión del centro respiratorio, apnea y finalmente fallo cardiaco.

Análisis de proteínas por Western blotting

Los animales se sacrificaron mediante decapitación, diseccionando rápidamente la columna vertebral. Con ayuda de una jeringa de 50 mL se extrajo la medula espinal procurando dejar una porción de medula en la región anterior y posterior respecto al foco de lesión. Se dividió la médula espinal en tres secciones de igual tamaño (3 mm aproximadamente): médula anterior, médula media (foco de lesión) y médula posterior. Cada segmento se homogenizó en tampón de lisis (NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Tris HCl 50 mM, NaF 0,5 M, ortovanadato de sodio 100 µM, Triton 100x al 2%, e inhibidores de proteasas SigmaFast). Los extractos fueron fraccionados mediante centrifugación a 13.000 rpm a 4ºC durante 10 minutos. El sobrenadante (proteína soluble) fue separado y almacenado a -80ºC. Se realizó la cuantificación de proteínas empleando el método de Bradford.

La electroforesis se realizó mediante la técnica de SDS-Page con geles del 8%, cargando un total de 8 μg de proteína por muestra. Las proteínas separadas fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa Bio Rad® de 0,45 μm de grosor, a 300mA durante 2 horas. Las membranas se bloquearon con TBS-T pH 7,5 (Tris HCl 25 mM, NaCl 150 mM , Tween20 al 0,05% para incubación y 0,1% para lavados) y 5% de suero fetal bovino (BSA) por 30 minutos. La incubación de los anticuerpos primarios se realizó durante toda la noche a 4ºC: GFAP (1:500, anticuerpo policlonal de conejo G9269, Sigma-Aldrich®) y β-Actina (1:1000, anticuerpo monoclonal de ratón AC-15-A1978, Sigma-Aldrich®) como control de carga. Las membranas se lavaron e incubaron por 1 hora con anticuerpos secundarios acoplados a HRP (1:5000, anticuerpos de cabra anti-conejo abcam®, ab6721; y anti-ratón abcam®, ab6789; según corresponda). Finalmente se lavaron las membranas y se revelaron con el método de quimioluminiscencia empleando el kit ECL Prime de Amersham (GE Healthcare Wolrdwide).

La señal de las proteínas marcadas fue capturada con una cámara fotográfica canon EOS rebel T3i, mediante fotografías de larga exposición. Las imágenes fueron analizadas por densitometría utilizando el programa Imagej 1.49v, del instituto nacional de salud (NIH, USA).

Resultados

Se evaluó el efecto de la lesión medular sobre la modulación de la proteína GFAP a diferentes
















Figura 1. Modulación de la proteína GFAP en medula espinal de 6 ratones en un curso temporal a 0, 30, 60, 120 y 240 minutos de inducida la lesión medular, para la región anterior (MA), media (MM) y posterior (MP) de la medula espinal. MA: Médula anterior, MM: Médula media, MP: Médula posterior.
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GFAP
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ACTINA
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GFAP
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ACTINA
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Figura 2. Fotografías de las señales de la proteína GFAP en los segmentos anterior (a), medio (b) y posterior (c) de la médula espinal, y modulación de la proteína en unidades relativas (UR).

momentos después de inducida la injuria en los segmentos anterior, medio y posterior de la medula espinal de los ratones. Como es de esperarse, la modulación entre los segmentos en el ratón control presentó una expresión relativamente homogénea, con niveles de la proteína similares entre los segmentos. Durante la primera hora después de inducida la lesión, no se evidenciaron mayores cambios en la modulación de la proteína, con excepción de un pico a los 30 minutos de generada la lesión en la sección anterior de la médula (Figura 1). En la segunda hora se evidencia una disminución en la expresión de GFAP tanto en el segmento anterior como en el segmento medio, con un posterior incremento a partir de la cuarta hora después la lesión (Figura 2a,b).

Como se observa en la figura 2c, los segmentos posteriores de las médulas presentaron una expresión de GFAP similar, con poca variación entre los diferentes tiempos y el control.

Discusión

La literatura indica que la expresión proteína GFAP varía en cierta medida como respuesta a una lesión medular, debido a eventos de reclutamiento de células gliales y migración celular al foco de la lesión (León, 2012; Levine, 2015). En este caso, los resultados evidencian que existe una variación a partir de las dos horas de inducida la lesión. Sin embargo, McDonough et al. (2013) reportaron variaciones en los niveles de GFAP a partir del día 3, con un pico máximo de expresión en el día 5. Esto puede deberse a que las células precursoras restringidas a la glía o células precursoras de oligodendrocitos (OPCs) presentan un aumento a partir del segundo día de generada la lesión (Levine, 2015; Zai & Wrathall, 2005), por lo que los eventos de gliosis favorecidos por las OPCs se evidenciarían a partir de este punto, en el que aparecen los astrocitos reactivos (Nieto, 2003; Rodríguez & Vaquero, Traumatismo Raquimedular, 2009).

Sin embargo, posterior al proceso de injuria, la disrupción de la glía limitans y la barrera hematoencefálica (BBB) permiten la migración de células hacia el foco de la lesión desde el liquido encefaloraquideo (Nieto, 2003), permitiendo además el paso de microglia y la migración de astrocitos cercanos al área lesionada. Estos procesos que se desarrollan en fase aguda, pueden explicar el inicio en el incremento de la modulación de GFAP a las 4 horas (figura 1), siendo acorde con lo reportado por Yokobori et al. (2015) quienes registran un aumento en los niveles de GFAP en liquido encefalorraquídeo 4 horas después la lesión.

Un evento importante que ocurre después de la disrupción de la BBB, es el incremento en los niveles de glutamato ocasionados por la degradación de células neuronales y gliales (Sandrow & Houlé, 2015; Levine, 2015; Zai & Wrathall, 2005). Este proceso conlleva a una disminución de estas poblaciones celulares, lo cual se ve representado en la subexpresión de las proteínas específicas de cada linaje celular; en consonancia, estudios previos han demostrado que después de la primera hora posterior a la lesión, se evidencia una disminución de los niveles de GFAP y otras proteínas asociadas a la actividad de células gliales (Liu, Wu, Zhang, Xiang, & Zou, 2013), lo cual concuerda con lo observado en el presente estudio (Figura 1; Figura 2a,b).

En cuanto a la modulación de la proteína GFAP entre los diferentes segmentos, se observaron cambios en la expresión de la proteína acordes a lo mencionado anteriormente en la región media y anterior de la médula espinal (Figura 2a,b).

Debido a la migración de astroglia al epicentro de la lesión como resultado de la respuesta inflamatoria, el segmento medio (foco de la lesión) generalmente presenta una mayor expresión de GFAP respecto a los segmentos anterior y posterior, presentándose también una modulación un poco mayor en el segmento anterior respecto del posterior (McDonough, Hoang, Monterrubio, Greenhalgh, & Martínez, 2012). Este ultimo aspecto se evidencia en el presente estudio (Figura 2a,c), donde el segmento caudal o posterior mantuvo una expresión homogénea respecto al control en tanto la región rostral o anterior evidenció cambios en los niveles de la proteína. Posiblemente esto se debe a que las vías ascendentes son interrumpidas por la lesión en tanto las vías descendentes permanecen intactas, lo cual origina una mayor actividad axonal en la región anterior favoreciendo los procesos celulares compensatorios en esta área (Zai & Wrathall, 2005).

En general los niveles de expresión más altos de GFAP se observaron en el segmento anterior, siendo mayor la expresión de la proteína para esta región en 3 de los 5 tiempos evaluados (Figura 1), diferente a lo reportando por McDonough, Hoang, Monterrubio, Greenhalgh, & Martínez (2012). Este patrón de expresión puede estar asociado a los tiempos evaluados en el curso temporal, puesto que estudios previos demuestran que los cambios significativos en la expresión de la proteína GFAP ocurren a partir de las 24 horas de inducida la lesión (Liu, Wu, Zhang, Xiang, & Zou, 2013; Zai & Wrathall, 2005).

En conclusión, aunque la literatura presenta evidencia de una mayor modulación de la proteína GFAP a tiempos posteriores a los evaluados en el presente estudio (León, 2012; McDonough, Hoang, Monterrubio, Greenhalgh, & Martínez, 2012), los datos obtenidos indican cambios en la expresión de la proteína en la médula espinal a partir de primera hora de inducida la lesión (Liu, Wu, Zhang, Xiang, & Zou, 2013). Esta información alude a la importancia de la reactividad astrocitaria, y la variación de las poblaciones de astroglia en la médula espinal como respuesta a los diferentes eventos posteriores a una lesión medular inicial o primaria.

Referencias

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