Caracteristicas de Semen de Ovino Refrigerado en Estado de Anaerobiosis y Aerobiosis Final

Gráfica 3. Porcentaje de normalidad
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA
UNIDAD XOCHIMILCO


Características de Semen de Ovino Refrigerado en Estado de Anaerobiosis y Aerobiosis.


M. C. C. Bandera, S. B. Chávez, S. O. Huazo
División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Departamento de Producción Agrícola y Animal, Licenciatura en Medicina Veterinaria y Zootecnia, México, Distrito Federal.

Resumen: Se obtuvieron 6 eyaculados por medio de vagina artificial de 2 carneros adultos de las razas: Suffolk y Criollo; alimentados ad libitum con alfalfa y concentrado. El promedio de volumen eyaculado fue de 1.2 ml. A cada eyaculado se le administro diluyente yema de huevo-tris-fructosa en una concentración de 1:2, y se dividió en 2 partes iguales para las muestras 1, 2, 3 y 4: Una en estado de aerobiosis y otra en estado anaerobiosis; las muestras 5 y 6 se dividieron en 5 partes iguales, reservando 4 para anaerobiosis y la quinta para evaluar aerobiosis. La anaerobiosis se produjo en un tubo vacutainer utilizando una jeringa de 10 ml para la extracción de aire, formando así un vacío en el mismo y eliminando la mayor cantidad de oxigeno posible de la muestra. Todas las muestras se mantuvieron en refrigeración hasta el día 7, de su última evaluación.
El promedio de las características evaluadas de los eyaculados antes de ser refrigerados fueron: Porcentaje de motilidad progresiva 86.5%; Concentración Espermática 3958.2 millones de espermatozoides/ml.; % Espermatozoides Vivos 84.8 y % Espermatozoides Normales 87.6. Las muestras 1,2,5 y 6 fueron evaluadas el día 4,5,6 y 7; las muestras 3 y 4 se evaluaron el día 5 y 7, obteniendo el promedio de características evaluadas de los eyaculados: Motilidad Progresiva en Aerobiosis 17%; así como Anaeróbicamente 48.3%; % Espermatozoides Vivos en Aerobiosis 52 y en Anaerobiosis 69.3%; Espermatozoides Normales en Aerobiosis 66.6% y en Anaerobiosis 74%.




__________________________________________________________________
Palabras clave: Semen de ovino, refrigeración, aerobiosis, anaerobiosis.
__________________________________________________________________


Introducción
La preservación de semen favorece un uso más eficiente y prolongado de los carneros asignados a programas de mejoramiento genético, al permitir su utilización durante y fuera de la estación reproductiva (Naim, 2009).
Por lo cual el semen refrigerado es una tecnología que debido a la practicidad de su implementación, bajo costo y considerando a su vez que 20-40% de los sementales responde pobremente al congelamiento seminal (Naim, 2009).
La viabilidad del semen preservado en refrigeración puede mantenerse 48 h o más (Evans y Maxwell, 1990), lo que permite mayor flexibilidad de uso en programas de IA. (Martinez-Rojero ,2005). Tal característica es debida a que los espermatozoides ante la presencia de oxígeno tienen una considerable actividad respiratoria, que normalmente se pone en correlación con su motilidad. El espermatozoide de todas las especies hasta ahora investigadas, puede ser capaz de sostener la motilidad por respiración endógena, en la ausencia de substratos extracelulares. También es conocido que en algunas especies, los espermatozoides son capaces de mantener una alta proporción en cuanto a la captación de oxígeno, incluso cuando la concentración del oxígeno es mucho más baja que en el aire (Nevo, 1965).
Los estudios apuntan a que el metabolismo de los espermatozoides es comprendido químicamente por la utilización de la energía para la motilidad. En condiciones de I. A., cuando la energía interna es agotada, la energía externa original es requerida especialmente de los carbohidratos (Samo y col., 2006).
Aunque los espermatozoides no tienen muchos organelos asociados con los procesos metabólicos, son metabólicamente activos, debido a que poseen las enzimas necesarias para llevar a cabo las reacciones bioquímicas de la glucólisis, el ciclo de los ácidos tricarboxílicos , la oxidación de los ácidos grasos, el transporte de electrones y posiblemente la vía de la hexosa monofosfato. Bajo condiciones de anaerobiosis los espermatozoides desintegran la glucosa, fructosa o manosa para convertirlas en ácido láctico. Esta actividad glucolítica o fructolítica permite a los espermatozoides sobrevivir bajo condiciones anaeróbicas de almacenamiento en caso de la inseminación artificial. Las enzimas que permiten este metabolismo glucolítico, aparentemente se distribuyen a lo largo de la cola. Los espermatozoides utilizan una gran variedad de sustratos en presencia del oxígeno. Su actividad respiratoria proporciona los medios para utilizar el lactato o piruvato que resulta de la fructolisis de azúcares hasta bióxido de carbono y agua. Esta vía oxidativa que se cree se localiza en las mitocondrias, se considera más eficiente en la producción de energía. Utilizando estos procesos catabólicos los espermatozoides convierten gran cantidad de su energía en ATP (Adenosin-Trifosfato). La mayoría del ATP se utiliza para los procesos de motilidad que consumen energía, aunque parte de esta energía se utiliza para mantener la integridad de las membranas de los espermatozoides que protegen a las células de la pérdida de sus componentes vitales (Salisbury y col., 1978).
Por ello, en este estudio se obtuvo semen de ovino y se manejó en estado de anaerobiosis y aerobiosis durante un proceso de refrigeración. De igual manera se revisaran las características que presenta el semen refrigerado en anaerobiosis conforme al tiempo de preservación
Planteamiento del problema
Como optativa para la conservación del semen se pretende analizar los resultados de la evaluación espermática en refrigeración en estado de anaerobiosis y aerobiosis.
Hipótesis
La conservación de semen refrigerado en estado de anaerobiosis, en comparación con el semen en estado de aerobiosis, tendrán una vida media mayor.
Material y Métodos
El presente Trabajo de Investigación se realizó en el Laboratorio de Manejo de la Reproducción; con animales del Bioterio de la Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco, situada en Calzada del Hueso #1100, Col. Villa Quietud, Del. Tlalpan, Distrito Federal.
Se colectó semen de 2 carneros: Suffolk y Criollo. Obteniendo los eyaculados por Vagina Artificial (V.A.) durante 3 semanas; dando un total 1 muestra por carnero por semana. Cada muestra fue colocada en el interior de un termo portátil con una temperatura de 37°C; para posteriormente llevarla al laboratorio para su evaluación.
Obtención del semen
El material que se utilizó para la obtención del semen es: VA, termómetro, termo, vaselina, tubo colector estéril graduado (.5 a 15 ml.) para la recolección del semen y un recipiente para el manejo del mismo (mamila, cubierta con papel aluminio). La VA se mantuvo a una temperatura interna de 42-45° C; conectada a un tubo colector estéril, éste estuvo en una mamila a una temperatura de 35-37° C para poder recibir el eyaculado. Las muestras del semen obtenidas, fueron las segundas del día, ya que Los autores concluyen que el uso del segundo y tercer eyaculados podría mejorar los resultados en una inseminación artificial (Pilar, 2011). El semen colectado fue colocado en un baño de agua caliente (30° C) y evaluado inmediatamente para la consistencia, el movimiento ondulatorio y el porcentaje de espermatozoides móviles. (Zekariya, 2011)
Evaluación del semen
Dentro del procedimiento de valoración del semen en fresco, los eyaculados obtenidos con la VA se sometieron a una estimación de características físicas y microscópicas como son: volumen, motilidad progresiva, % vivos, % normales y concentración; sobre una platina atemperada (37° C). Aprobando y procesando los eyaculados que solo tengan más del 50% de motilidad progresiva.
Motilidad Progresiva
Se realizó utilizando semen con diluyente yema de huev-tri-fructosa, observándolo al microscopio de contraste de fase con el objetivo de 40X y una platina atemperada a 37° C; realizándose una dilución de semen con el diluente 1:2 y posteriormente se examinaron 2 gotas de semen de cada muestra, estimándose en porcentaje con una escala de 0 a 100 (Bag y col. 2002).
Porcentaje de espermatozoides vivos
Se evaluó tomando una gota de semen y agregándose una gota de colorante (eosina-nigrosina) a 37° C, mezclándose y haciendo un frotis, observándose al microscopio con el objetivo de 40X; realizando un recuento total de 100 espermatozoides observando a los vivos no coloreados y muertos con tinción (Roca y col., 1997).
Porcentaje de Normales
Se observaron por medio del frotis, para posteriormente observarlo con el objetivo de 40X. El semen no debe tener más de un 15-20% de espermatozoides anormales; pudiendo estar estas anormalidades a nivel de cabeza o cola, proximal o distal (Gil y col. 2000).
Concentración
Se evaluó utilizando una pipeta de Thomas, succionando hasta 0.5 ml de semen y llenándola hasta 101μl. con cloruro de sodio al 3% (para matar a los espermatozoides), realizándose una dilución de 1:200; agitándose y tirando las primeras 5 gotas; después se coloca una gota por capilaridad en la cámara de New Bawuer (Barrios y col. 2000; Valencia y col., 1994), observándose al microscopio con aumento de 40X, tomándose en cuenta 5 cuadros (los de las esquinas y el del centro), contando los espermatozoides que se encuentren dentro de los cuadros, realizándose la suma total y expresándose las unidades en X107 de espermatozoides por ml (INITA-Bariloche 2004).
Extracción del oxígeno
Después de la evaluación del semen, se procedió a la extracción de oxígeno presente en el tubo vacutainer haciendo vacío con una jeringa de 5ml. succionando el aire presente en el mismo para posteriormente pasarlo al cuarto frío a 5° C (INITA-Bariloche 2004; Marco-Jiménez y col., 2004; Salomón and Maxwell, 1995).




Resultados y Discusión
Los resultados arrojados durante las evaluaciones seminales fueron los siguientes.
En la gráfica 1, se muestra el promedio, del Porcentaje de motilidad progresiva, durante los 7 días de evaluación.





En la gráfica 2, se puede observar el promedio del porcentaje de viabilidad de las muestras.


En la gráfica 3, se muestran el promedio del porcentaje de normalidad.



Porcentaje de motilidad progresiva
En cuanto a la motilidad progresiva notamos la alta diferencia entre porcentajes desde el cuarto día, teniendo un 80% de MP en anaerobiosis mientras que en estado de aerobiosis es de 63.8%, y al séptimo día la motilidad es de 48.3% y 16.5% respectivamente.
Porcentaje de viabilidad
Con respecto a los resultados obtenidos de viabilidad notamos que los espermatozoides en estado de aerobiosis presentaron al séptimo día un 52%, mientras que en estado de aerobiosis el valor es de 69.3%.
Porcentaje de normalidad
Los resultados arrojados sobre normalidad presentaron una ligera diferencia entre ambas muestras, con un 74% en anaerobiosis y un 66.7% en aerobiosis al séptimo día, demostrando aun así que los espermatozoides se mantuvieron en mejores condiciones en estado de anaerobiosis.

Conclusión
De acuerdo con los resultados arrojados se hace notorio que los espermatozoides en estado de anaerobiosis mantuvieron un valor más alto en cuanto a las evaluaciones diarias, sobretodo en el porcentaje de Motilidad progresiva que se puede considerar como el más importante en la IA.


Puesto que los espermatozoides se encuentran en estado de anaerobiosis mientras se mantienen almacenados en los testículos, podemos decir que refrigerados bajo este régimen logramos preservarlos en mejores condiciones para el momento de la IA.
Referencias
Angulo, M. R. B., Ortíz, H. A., Berruecos, V. J. M., Feldman, S. D., Valencia, M. J. 1999. Motilidad y fertilidad del semen de carnero descongelado a dos diferentes ritmos de temperatura. Vet. Méx. 30 (3).
Barrios B., 2000, Seminal plasma protein revert the cold.shock damage in ram sperm membrane, Department of Biochemistry and Molecular and Cell Biology, School of veterinary Medicine, University of Zaragoza. Biology of reproduction. 63; 1531-1537
Fernández-Abella, D.H., M.O. Preve and N. Villegas. 2003. Insemination time and dilution rate of cooled and chilled ram semen affects fertility. Theriogenology. 60; 21-26.
Garner, D.L. y Háfez, E.S.E. 2000. Spermatozoa and Seminal Plasma. En: Háfez, E.S.E. and Háfez. B (eds)., Reproduction in farm animals, 7th edition. Lippincott Williams & Wilkins Company, Philadelphia.
Gibbons A., 2007, Inseminación artificial con semen fresco en ovinos, Presencia, No 51.
Gibbons, A. y M. Cueto. 2004. Jornadas de inseminación artificial con semen fresco en ovinos. Manual de divulgación. Comunicación Técnica de Producción Animal del INTA. Bariloche. Nº 200.
Gil. J., Lundeheim, N., Söderquist, L. y Rodríguez-Martínez, H. 2003. Influence of extender, temperature, and addition of glycerol on post-thaw sperm parameters in ram semen. Theriogenology. 59 (5–6); 1241–1255
Godoy, Meneses, 2011, Protocolo de inseminación con semen fresco en ovinos, INIA Intihuasi.
López-Brea J., 1992, Congelación de semen en la especie ovina: características biológicas de las dosis descongeladas, universidad complutense de madrid facultad de veterinaria.
Martinez-Rojero, 2005, Intrauterin artificial insemination in creole goats with cooled semen, Centro de studio Colegio superior Agropecuario del Estado de Guerrero. 40 (1); 71-76
Naim, P., Cueto, M. y Gibbons, A. 2009. Inseminación Artificial a Tiempo fijo con Semen Ovino Refrigerado. Archivos de Zootecnia. 58: 435-440.
Nevo, C. A. 1965. "Dependence of sperm motility and respiration on oxygen concentration". Journal Reproduction and Fertility. Vol 9.
Olivera, J., A. Gil, J. Gamarra, V. Teixeira y S. Fierro. 2005. I-Preservación seminal para la IA cervical en majadas del Proyecto Merino Fino: semen refrigerado (24 y 48 h). Programa de apoyo y vinculación con sector productivo.
Paulenz, H., S. Lennart, Å. Tormod, H.F. Ove and A.B. Kjell. 2003. Effect of milk- and TRIS-based extenders on the fertility of sheep inseminated vaginally once or twice with liquid semen. Theriogenology. 60 (4):759-66.
Samo, M. U., Axford, R. F. E., Quereshi, T. A., Memon, A. A. y Memon M. M. 2006. "Effects of aerobic and anaerobic incubation on the quality of ram semen". Pakistan Journal of Biological Sciences. 9 (1); 123-127
Santiani, A., Sandoval, R., Ruiz, L., Coronado, L. 2004. Estudio de la integridad en espermatozoides de ovino mediante la prueba de estrés hipoosmótico. XXVII Reunión Científica Anual de la Asociación Peruana de Producción Animal. Piura, Perú, 20 al 24 de setiembre.
Santolaria, Pilar y Palacin I. 2011. Management factors affecting fertility in sheep. Pp 174.
Salamon, S. y Maxwell, W. 2000. Storage of ram semen. Animal Reproduction Science. 62; 77–111
Salisbury, G. W., Vandemark N. L., and Lodge J. R. 1978. "Fisiología de la Reproducción e Inseminación Artificial de los Bóvidos. Segunda edición. Acribia, España. 25 (1); 34-38
Watson, P. 2000. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Anim. Repro. Sci. 60; 481-492
Zekariya Nur, Berrin Zik, Burcu Ustuner, 2011, Effect of freezing rateo n acrosome and chromatin integrity in ram semen, Ankara university Veterinary Faculty, 588, 267-272


Gráfica 2. Porcentaje de viabilidad
Gráfica 1. Porcentajes de Motilidad Progresiva