Características de la contracción de células mioides peritubulares de los túbulos seminíferos de testículo de rata
Descripción
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN LUIS FACULTAD DE QUÍMICA BIOQUÍMICA Y FARMACIA
Características de la contracción de células mioides peritubulares de los túbulos seminíferos de testículo de rata
Trabajo de Tesis Presentado por Licenciado Darío Fernández Para optar el grado académico de Doctor en Bioquímica
Asesor Científico: Doctor Luis Alberto López Co-asesor Científico: Doctor Juan Carlos Cavicchia San Luis. República Argentina 2008
AGRADECIMIENTOS La presente investigación representa un esfuerzo que culmina con varios años de estudios y dedicación hacia la ciencia. Agradezco al Dr. Luis López, por sus observaciones atentas, sus críticas y sugerencias, sus investigaciones paralelas a las mías y a la orientación personal y profesional, que imprimió a mi labor, para poder comenzar a recorrer el camino de la ciencia. Expreso mi cordial gratitud al Dr. Juan Carlos Cavicchia por su gran aporte y co-asesoramiento científico. Estoy muy agradecido de todo el personal del Instituto de Histología y Embriología de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Cuyo. También
quiero
agradecer
a
mis
compañeros
de
trabajo
del
Laboratorio de Citoesqueleto y Ciclo Celular, por los momentos compartidos a lo largo del desarrollo de esta investigación. Por último, agradezco a Diego Fernández por la colaboración que me ha prestado en el desarrollo de imágenes y animaciones de la molécula de miosina. Darío Fernández Mendoza, 2 008.
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Para Mario y Aurora A mis Hermanos, Mario y Diego A Cami, Joe y Timoteo
_____________________________________________________________________ Índice General
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ÍNDICE GENERAL CAPÍTULO I
11
INTRODUCCIÓN
11
1. EL TESTÍCULO
12
1.1. Estructura del testículo
12
1.1.1. Túbulos seminíferos del testículo
13
1.1.2. Células mioides peritubulares
13
1.1.3. El epitelio seminífero
14
1.1.4. Desarrollo del túbulo seminífero
16
1.1.5. Desarrollo del epitelio seminífero
17
1.1.6. Espermatogénesis
21
1.1.7. El ciclo del epitelio seminífero
21
1.1.8. Organización del epitelio seminífero
24
1.1.9. Regulación de la contracción del túbulo seminífero
29
2. CARACTERÍSTICAS DE MIOSINA
31
2.1. Miosinas
31
2.1. Descubrimiento de Miosina
31
2.2. Estructura de la molécula de Miosina II
32
2.2.1. Estructura de la porción C-terminal de miosina II 2.3. Estructura de los filamentos gruesos de miosina II 2.3.1. Ensamble y desensamble de filamentos gruesos
35 35 37
2.3.2. Implicancia de la fosforilación de las cadenas livianas en la formación del filamento
38
_____________________________________________________________________ Índice General
_____________________________________________________________________
2.3.3. Implicancia de la fosforilación de la cadena pesada en la formación de filamentos de miosina II
40
3. PROPÓSITO DEL TRABAJO DE TESIS
41
CAPÍTULO II
42
CARACTERÍSTICAS DE LA MOLÉCULA DE MIOSINA DE CÉLULAS MIOIDES PERITUBULARES DEL TESTÍCULO
42
1.1. Contenido de miosina en el túbulo seminífero de testículo
43
1.2. Purificación de miosina-CMP
47
1.2.1. Método agregación-desagregación
47
1.2. 2. Purificación de miosina-CMP en gradiente de sacarosa
49
1.2. 3. Purificación de miosina-CMP en columna de hidroxiapatita 50 2. CARACTERÍSTICAS PEPTÍDICAS DE LA CADENA PESADA DE MIOSINA-CPM
52
2.1. Digestión Enzimática
52
2.2. Espectrometría de masas
53
2.2.1. Miosina-CMP de testículo de rata
53
2.2.2. Miosina-CMP de testículo de toro
58
3. PROPIEDADES DE SOLUBILIDAD DE MIOSINA-CMP 3.1. Solubilidad in vitro 3.1.1. Solubilidad de miosina de otros tejidos
60 60 61
3.2. Agregación in vitro
63
3.3. Desagregación in vitro
66
_____________________________________________________________________ Índice General
_____________________________________________________________________
4. LOCALIZACIÓN DE MIOSINA-CMP EN LOS TEJIDOS DEL TESTÍCULO 70 4.1 Células mioides peritubulares.
70
5. DISCUSIÓN DEL CAPÍTULO II
73
CAPÍTULO III
76
CARACTERÍSTICAS DE LAS CÉLULAS MIOIDES PERITUBULARES DEL TESTÍCULO
76
1. IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS MIOIDES PERITUBULARES EN TÚBULOS SEMINÍFEROS AISLADOS
77
1.1. Tinción con nitrato de plata
77
1.2. Contracción de las células mioides peritubulares
79
1.2.1. Diámetro de los túbulos seminíferos y tamaño de las células mioides peritubulares 2. GRADO DE AGREGACIÓN DE MIOSINA-CMP 2.1. Efecto de endotelina-1
80 83 83
3. DISCUSIÓN DEL CAPÍTULO III
85
CAPÍTULO IV
86
ACTIVIDAD DE LAS CÉLULAS MIOIDES PERITUBULARES RELACIONADA CON EL EPITELIO SEMINIFERO
86
1. DESARROLLO DEL TÚBULO SEMINÍFERO Y DE LAS CÉLULAS MIOIDES QUE LO RODEAN 1.1. Diámetro del túbulo seminífero de testículos en desarrollo
87 87
1.2. Caracteres morfológicos de las células-MP en túbulos seminíferos en desarrollo
89
_____________________________________________________________________ Índice General
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1.3. Isotipos de miosina-CMP en las células mioides peritubulares en desarrollo
92
2. CARACTERÍSTICAS DE LA CONTRACCIÓN DE LOS SEGMENTOS DEL EPITELIO SEMINÍFERO Y DE LAS CÉLULAS MIOIDES QUE LO RODEAN 94 2.1 Diámetro de distintos segmentos de túbulos seminíferos
95
2.2 Morfología de las células mioides peritubulares en los distintos segmentos del túbulo seminífero
96
2.3. Isotipos de miosina-CMP en los distintos segmentos del túbulo seminífero
99
3. DISCUSIÓN DEL CAPITULO IV
101
CAPÍTULO V
103
DISCUSION GENERAL Y CONCLUSIONES
104
1. Características de miosina-CMP
104
2. Contracción de las células MP y expresión de isotipos de miosinaCMP
111
CAPÍTULO VI
117
MATERIALES Y METODOS
118
1. Animales y materiales biológicos
118
2. Aislamiento de túbulos seminíferos y de células del testículo
118
3. Visualización y medición de las células mioides peritubulares en el túbulo seminífero
119
4. Tratamiento de los túbulos seminíferos con endotelina-1
120
5. Análisis de proteínas
120
_____________________________________________________________________ Índice General
_____________________________________________________________________
6. Obtención y purificación de proteínas
122
7. Digestión de proteínas con tripsina
125
8. Cuantificación de proteínas
125
9. Precipitación de proteínas
126
10. Agregación y desagregación de miosina
126
11. Análisis de datos
127
Bibliografía
129
Publicaciones relacionadas con los resultados presentados
141
_____________________________________________________________________ Índice General
_____________________________________________________________________
ABREVIATURAS ASB: Albúmina de suero bovino. ATP: Adenosina trifosfato. Células MP: Células mioides peritubulares. ET-1: endotelina-1. E.S.M: error standart medio. H: hora kDa: kilo Dalton. M: concentración molar. mM: concentración milimolar. mm (minúscula): milímetro. µM: concentración micromolar. nM: concentración nanomolar. Min: minuto. µm: micrómetro. µm2: micrómetro cuadrado. Miosina-CMP: Miosina proveniente de células mioides peritubulares. PAGE-SDS: Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. PBS: bufer fosfato salino. Pn: posnacimiento SDS: Dodecil sulfato de sodio. SMM-II: Miosina II de músculo liso.
_____________________________________________________________________ Índice General
_____________________________________________________________________
TS: Túbulo(s) seminífero(s). Xg: unidad gravitatoria.
_____________________________________________________________________ Índice General
CAPÍTULO I INTRODUCCIÓN
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
1. EL TESTÍCULO 1.1. Estructura del testículo Los órganos reproductores masculinos, se clasifican en órganos sexuales
internos
y
externos.
Los
internos
incluyen
testículo,
epidídimo, conducto deferente y glándulas sexuales anexas, (estas últimas incluyen vesícula seminal, próstata y glándula bulbouretal). Los externos son pene y escroto. El testículo, como se ilustra en la figura I.1. Está rodeado por una gruesa cápsula de tejido conectivo, la túnica albugínea, que se extiende hacia el interior del testículo. Dentro de las cavidades que forma la túnica, se encuentran los túbulos seminíferos que son los responsables de la producción y transporte de los espermatozoides. Los túbulos seminíferos están separados por tejido intersticial que contiene células de Leydig y vasos sanguíneos.
_____________________________________________________________________ Introducción
12
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
Figura I.1. Esquema general de la organización del testículo. (Figura extraída de Geneser y col 2000)
1.1.1. Túbulos seminíferos del testículo Los túbulos seminíferos son una serie de conductos que contienen en su interior el epitelio seminífero y están rodeados por células mioides peritubulares y tejido conectivo. 1.1.2. Células mioides peritubulares Las células mioides peritubulares (células MP) son de origen mesenquimático, representan el mayor componente celular de la pared de los túbulos seminíferos y participan en la regulación paracrina de la función testicular.
_____________________________________________________________________ Introducción
13
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
Estudios in vitro han demostrando que las células MP secretan un número de sustancias, incluyendo componentes de la matriz extracelular y factores de crecimiento, algunos de los cuales estimulan en forma paracrina la secreción de las células de Sértoli Las
células
MP
son
contráctiles,
expresan
proteínas
de
verdaderas células musculares lisas tales como alfa-isoactina,
y
miosina y forman prominentes haces de microfilamentos. En la rata adulta los microfilamentos dentro de cada célula están orientados en forma circular y longitudinal al eje mayor del túbulo seminífero. La actividad contráctil de las células MP es responsable de la contracción
de
los
túbulos
seminíferos
para
el
transporte
de
espermatozoides y fluido testicular, y por lo menos parcialmente, para la liberación de espermatozoides durante la espermiación (Virtanen y col., 1986); (Tung y Fritz, 1990). Varios
agonistas
(endotelina-1,
crecimiento derivado de las plaquetas,
vasopresina,
el
factor
de
oxitocina y prostaglandinas,
entre otros, regulan la contracción de las células MP (Rossi y col., 2002) 1.1.3. El epitelio seminífero El epitelio seminífero es un epitelio estratificado complejo compuesto por dos tipos celulares básicos: células de Sertoli y células espermatogénicas. Las células de Sértoli, representan una población no proliferante que se extienden desde la membrana basal hasta la luz del túbulo _____________________________________________________________________ Introducción
14
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
seminífero. Tienen forma cilíndrica, con complejas prolongaciones apicales
y
laterales
que
rodean
las
células
espermatogénicas
adyacentes y llenan los espacios vacíos entre ellas. Las células de Sértoli adyacentes están unidas entre sí por complejos de unión que forman la barrera hematotesticular, que es una
barrera
fisiológica
que
separa
el
tejido
de
las
sustancias
transportadas por la sangre. Las células de Sertoli desempeñan un papel esencial en el desarrollo de las células espermatogénicas, ya que secretan líquidos o restringen el movimiento de moléculas, creando micro ambientes esenciales para el desarrollo y la diferenciación de las mismas. Además las células de Sértoli median el movimiento a través del epitelio seminífero de esteroides, metabolitos y sustancias nutritivas; restringen la filtración de moléculas extracelulares al epitelio por medio de los complejos de unión; fagocitan las células espermatogénicas en degeneración y el exceso de citoplasma eliminado por las espermátides en diferenciación; secretan proteínas ligadoras de andrógenos, que concentran la testosterona dentro del epitelio seminífero y la parte proximal de las vías de conducción; secretar varias sustancias inhibidoras y estimuladoras que regulan la mitosis, meiosis, funciones esteroidogénicas
de
las
células
de
Leydig
y
la
liberación
de
gonadotropinas; controlan el movimiento de células espermatogénicas en el epitelio seminífero y la liberación de los espermatozoides a la luz del túbulo. (Brinster, 2007)
_____________________________________________________________________ Introducción
15
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
1.1.4. Desarrollo del túbulo seminífero La más extensa y detallada investigación del desarrollo de los túbulos seminíferos ha sido llevada a cabo en ratas de laboratorio. Los túbulos
fueron
reconstruidos
de
cortes
seriados
de
testículos,
comenzando con el día 16 de vida embrionaria y continuando hasta los de ratas adultas. En cada testículo fetal hay 20-31 cordones sexuales distintos que están organizados en arcos en forma de C, apilados entre si como el cartílago de la tráquea. Se pueden distinguir dos grupos de arcos; unos localizados periféricamente, formando los cordones externos y corriendo próximos a la túnica albugínea y los otros formados por grupos mas pequeños alejados de la túnica albugínea. Los cordones tienen solo dos conexiones
a
la rete testis.
A medida que el
desarrollo de los cordones progresa, su crecimiento longitudinal causa más ondulaciones y plegamiento de los arcos. En el momento del nacimiento, los arcos están extensamente plegados formando alrededor de 90 pequeñas circunvalaciones.
El
desarrollo de los túbulos continúa por el crecimiento longitudinal de las porciones entre las circunvalaciones sin variar el número de ellas. El subsiguiente desarrollo de los túbulos seminíferos está dado por el crecimiento en longitud y en diámetro. Como se muestra en la figura I.2 el diámetro de los túbulos seminíferos tiene un crecimiento sostenido hasta los 50 días postnacimiento (pn), donde adquiere la
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16
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
medida de los túbulos seminíferos de los testículos adultos (Greep y Astwood, 1975) 1.1.5. Desarrollo del epitelio seminífero Los túbulos seminíferos en la rata fetal contienen dos tipos de células. Las células de sostén (precursores de las células de Sértoli y los gonocitos (células germinales primordiales). Los dos tipos celulares están en activa división mitótica durante la vida fetal. En la rata, en el momento de nacimiento, alrededor del 95 % de los túbulos no presentan lumen, son cordones macizos. Entre los 1014 días pn, algunos cordones comienzan a mostrar pequeñas zonas con lumen que van progresando marcadamente, hasta llegar al día 18 pn donde el 85 % de los cordones están abiertos. Para el día 30 pn todos los cordones ya son verdaderos túbulos con lumen. El diámetro de la luz de los túbulos crece lentamente hasta el día 20 pn y luego rápidamente hasta el día 50 pn. (Ver figura I.3) En el momento del nacimiento, las células de Sertoli no presentan
características
especiales
de
su
citoplasma
y
recién
comienzan a tener el aspecto de células maduras desde el día 16 pn. Se observan transformaciones del citoplasma apical, denominadas especializaciones ectoplásmicas (ES) y la formación de uniones laterales entre células de Sértoli, formando una barrera tipo epitelial. Para el día 22 pn las células de Sértoli presentan las características de células maduras.
_____________________________________________________________________ Introducción
17
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
Hay evidencias, que en la rata, algunos gonocitos embrionarios degeneran y mueren en los primeros días del nacimiento, pero los restantes, proliferan por mitosis en el día 4 pn y forman las espermatogonias tipo A que entrarán en el ciclo espermatogénico para formar la bases para la definitiva línea de células germinales. En el día 15 pn las espermatogonias y los espermatocitos primarios están presentes. Espermátides redondas se encuentran en el día 30 pn. Espermátides elongadas comienzan a observarse en algunos túbulos en el día 40 pn y en todos al día 50 pn. A los 50 pn se considera que el primer ciclo espermatogénico se ha completado. Recién a los 60 días pn el epidídimo está maduro y contiene un gran número de espermatozoides (Greep y Astwood, 1975).
_____________________________________________________________________ Introducción
18
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
Figura I.2. Diámetro del túbulo seminíferos en ratas de varias edades (Figura extraída de Greep y Astwood, 1975)
_____________________________________________________________________ Introducción
19
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
Las precursoras
células
mioides
peritubulares
mesenquimáticas
en
los
se
originan
primeros
días
de
células
posnatal
y
presentan escaso desarrollo hasta el día 14 pn (Campagnolo y col., 2001). En el día 16 pn comienza a desarrollarse microfilamentos paralelos aislados (filamentos de actina) en forma de haces orientados en forma circular al eje mayor del túbulo seminífero, y en el día 30 pn comienzan a aparecen en adición a los circulares, haces que corren longitudinalmente al eje mayor del túbulo.
Por el día 40 pn, hay un
gran desarrollo de haces de microfilamentos formando una red con orientación circular y longitudinal, que luego pierde intensidad en la edad adulta (Maekawa y col., 1995).
Figura I.3. Diámetro del lumen tubular en ratas de varias edades (Figura extraída de Russell y col. 1989)
_____________________________________________________________________ Introducción
20
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
1.1.6. Espermatogénesis La organización de las células internas del túbulo seminífero ha sido estudiada especialmente en ratas. (Leblond y Clermont, 1952. a y b; Clermont, 1957). En menor grado en ratones (Oakberg, 1956 a y b) y eventualmente en otras especies. Se denomina espermatogénesis al proceso sumamente ordenado y definido que envuelve el desarrollo del espermatozoide desde células progenitoras que residen dentro del epitelio germinal del testículo. Las
células
germinales
maduras,
las
espermatogonias,
se
dividen para formar las células meióticas o espermatocitos primarios que al final de la división reduccional forman las células haploides denominadas espermatides (espermatocinesis). Las espermátides se convierten en espermatozoides por el resultado de una complicada metamorfósis envolviendo dramáticas modificaciones estructuras del núcleo,
formación
de
nuevas
organelas,
y
la
adquisición
de
mecanismos que le permiten una movilidad direccional independiente (espermogénesis). 1.1.7. El ciclo del epitelio seminífero Un detallado estudio de los cambios estructurales progresivos que se producen en las espermátides en el curso de su desarrollo y en la formación de los espermatozoides llevó a los investigadores a describir en la rata 14 etapas bien definidas de la espermiogénesis.
_____________________________________________________________________ Introducción
21
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
Además se comprobó que cada sección transversal del túbulo seminífero contiene espermátides en alguno de los 14 estados mencionados formando una asociación específica con ciertas células del resto del epitelio germinal.
Estas evidencias llevó el concepto
original de ciclo espermatogénico a la idea de ciclo del epitelio seminífero definido como “una serie de cambios en una determinada área del epitelio seminífero ubicada entre dos áreas del mismo estado de desarrollo (Leblond y Clermont, 1952 a y b) En la rata el ciclo del epitelio seminífero consiste de 14 estados o asociaciones celulares características como se muestra en la figuras I.4 y I.5. Tanto la formación de asociaciones específicas de células como la secuencia de su aparición en una determinada área del túbulo seminífero son eventos altamente sincronizados. La duración del ciclo del epitelio seminífero en ratas depende de la variedad. En las ratas Sherman el ciclo es de 12 días, en ratas Sprague-Dawley el ciclo es 12,9 días, en ratas Wister 13 días y en ratas Vandicoot 10 días.
_____________________________________________________________________ Introducción
22
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
Figura I. 4. Micrografía electrónica de una porción de la pared del epitelio seminífero de un testículo que muestra una asociación celular o estado, compuesto de espermatogonia, espermatocitos y dos generaciones
de
espermátides.
A
la
derecha
son
las
células
individuales que constituyen una asociación celular (Figura extraída de Russell y col. 1990).
_____________________________________________________________________ Introducción
23
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
Figura. I.5. Mapa del ciclo de la espermatogénesis de la rata, las columnas
verticales,
están
designadas
con
números
romanos
representan las asociaciones celulares o estados. La progresión del desarrollo de las células es seguida horizontalmente hasta el borde derecho del mapa del ciclo, la progresión continúa de la izquierda del mapa en fila, éste termina con formación del espermatozoide (Figura extraída de Russell y col. 1990).
1.1.8. Organización del epitelio seminífero Las asociaciones de las células se desarrollan y permanecen en una región del túbulo seminífero, por ejemplo, el estado I se convertirá finalmente en el estado II sin movimientos con respecto al eje longitudinal del túbulo. Hay distintos ordenamientos de asociaciones celulares a lo largo de la longitud del túbulo. Perey y col. 1961 han examinado muy meticulosamente las secciones longitudinales de
_____________________________________________________________________ Introducción
24
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
túbulos de rata y describieron el patrón de la espermatogénesis a lo largo de la longitud del túbulo y comprobaron que los segmentos de los túbulos están formados de asociaciones de célula solas o estados. Los segmentos como asociaciones de células son designados por números romanos, por ejemplo, una porción longitudinal del túbulo seminífero ocupada por el estado IV es llamado segmento IV. Figura I.6. (Greep y col. 1975)
Figura I.6 Esquema de una sección longitudinal de un túbulo seminífero
mostrando
los
segmentos
que
son
designados
por
números romanos. La sección proximal es la mas cercana al rete. Cuando el final de la serie es alcanzado (estado I), la serie comienza a descender desde el estado XIV. Nótese que la medida de los segmentos con diferentes designaciones numéricas romanas no son iguales, como no así los segmentos que poseen la misma designación numérica romana. (Figura extraída de Russell et al. 1990).
Un segmento es una porción del túbulo seminífero en su eje longitudinal ocupado por una simple asociación de células.
_____________________________________________________________________ Introducción
25
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
La longitud de un segmento en particular es variable y sólo puede ser expresado como una media de la longitud para una especie en particular, la longitud media del segmento es proporcionalmente más larga para estados con mas frecuencia observados. El desarrollo sincrónico de las células dentro del segmento no es completamente homogéneo, distintos criterios
morfológicos pueden
ser usados para dividir varios estados en subsegmentos; Perey y col. 1961 destaca que el subsegmento es bruscamente demarcado
a lo
largo de la longitud del túbulo (figura I.7). (Greep y col. 1975)
Figura I.7. Se muestran los subsegmentos en una sección longitudinal del segmento XIV. El subsegmento XIVa representa la porción de la asociación o estado XIV con figuras meióticas en meiosis I (metafase, anafase y telofase). El subsegmento XIVb representa la porción del estado XIV con espermatocitos secundarios y el subsegmento XIVc muestra la porción del estado que contiene las figuras mitóticas en meiosis II. (Figura extraída de Russell et al. 1990).
En secciones del túbulo seminífero, una asociación celular con células características de un sub-segmento es llamada sub-estado. Los
_____________________________________________________________________ Introducción
26
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
sub-estados son designados con números romanos con un sufijo alfabético ej. VIIa, XIVb. Los
segmentos
están
ordenados
dentro
del
túbulo
seminífero;
comenzando desde la rete testis (proximal), presentan un orden descendiente, si por ejemplo el segmento XI
es cercano a la rete
testis, entonces más distante a lo largo de túbulo se encontrará primero el segmento X, IX, VII y VII, etc. Cuando el segmento I es alcanzado, el siguiente segmento es el XIV, seguido por el XIII y el XII y así sucesivamente de manera descendiente. Las uniones de los segmentos
consecutivos,
son
llamadas
continuidad
de
orden
segmentaria. El patrón general de orden descendiente en una dirección lejana a la rete testis es llamada orden segmentaria descendiente. Figura
I.8.
Ocasionalmente
las
modulaciones
ocurren
a
cortas
distancias a lo largo del túbulo invirtiendo el orden. Sin embargo a una corta distancia de orden descendiente se observa lo contrario. Figura I.8 (Russell y col. 1990)
Figura I.8 Una modulación en la pendiente de orden segmental. Aunque el patrón de orden descendiente es evidente, una corta porción del túbulo invierte la orden del segmento a un patrón ascendente. (Figura extraída de Russell et al. 1990).
_____________________________________________________________________ Introducción
27
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
El
orden
segmentario
descendiente
ocurre
desde
ambos
extremos de un túbulo seminífero que parte del rete. Hay un punto en el que la orden descendiente de ambos extremos se reúnen. Este punto es conocido como el sitio reverso. Fig I.9
Figura I-9. Sitio reverso. Es obvio que el descenso de la orden segmental no puede ser mantenido indefinidamente desde el rete hacia ambos extremos del túbulo. Hay un punto en éste llamado sitio de reversa que marca el lugar de unión de los dos patrones de descenso. (Figura extraída de Russell y col. 1990).
_____________________________________________________________________ Introducción
28
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
El sitio de reversa no es equidistante del rete a ambos lados del túbulo. Si hay o no modulación, la orden descendiente del segmento eventualmente guiará a una serie completa de segmentos. Una serie completa a lo largo de la longitud del túbulo se define como una onda. Figura I.9. Una onda del epitelio seminífero es una serie completa de segmentos, incluyendo algunas modulaciones que ocurren a lo largo de túbulo. Muchas ondas (eventualmente cerca de 24) están presentes en un túbulo seminífero, éstas no son iguales en longitud varían de 1 a 5 cm. (Russell y col. 1990) 1.1.9. Regulación de la contracción del túbulo seminífero Una ver terminada la espermiogénesis los espermatozoides se desprenden de las células de Sertoli y son transportados a la rete testis. En esta función participan en forma sincronizada las células de Sértoli y las células MP. El estimulante de la contracción de las células MP en el túbulo seminífero es el péptido endotelina
(ET), que es un potente
vasoconstrictor de origen epitelial secretado por las células de Sertoli (Fantoni, 1993) Las células MP de rata expresan dos tipos de receptores de alta afinidad a ET, (receptores ET-A y ET-B) que controlan la contracción celular a través de la movilización de calcio intracelular (Tripiciano, 1997). _____________________________________________________________________ Introducción
29
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
Un
aspecto
central
relacionado
con
el
control
de
la
contractibilidad del túbulo seminífero se relaciona con la producción de ET por las células de Sértoli. ET es secretado como un precursor inactivo que es activado en el espacio pericelular por un clivaje específico de la molécula por la enzima convertidora de endotelina (ECE) (Opgenorth y col. 1992). La ECE solo es expresada en las células MP donde en el epitelio seminífero los espermatozoides han terminado su maduración y están listos para ser liberados al lumen del túbulo, es decir los estadíos IX-XI (Palombi, 2002).
_____________________________________________________________________ Introducción
30
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
2. CARACTERÍSTICAS DE MIOSINA 2.1. Miosinas Un
gran
número
de
proteínas
conocidas
como
miosinas
constituyen la parte motriz del sistema miosina-microfilamentos. Las miosinas son proteínas motoras que convierten la energía química en fuerza mecánica. 2.1. Descubrimiento de Miosina A finales de siglo XIX, Kühne transformó la teoría de la contracción muscular cuando observó un nematodo que nadaba libremente dentro del tejido muscular (Kühne 1863). El concluyó que el contenido del músculo no era sólido como se había pensado, y en lugar de eso era una solución concentrada de “albúmina”. Encontró que soluciones que contenían altas concentraciones salinas extraían una sustancia del músculo a la que él llamó “miosina” (Kühne 1864). Engelhardt y Ljubimowa en 1939 descubrieron que la miosina de Kühne, poseía actividad ATPasa y era la fuente de energía para la producción de fuerza durante la contracción muscular. Más tarde, Albert Szent-Gyorgyi en 1942, demostró in vitro la formación de fibras artificiales de miosinas y de otras proteínas a las que ellos llamaron “actina” (debido a que activaban a miosina). Desde ese tiempo hasta la actualidad trabajos bioquímicos y fisiológicos han contribuido al entendimiento de la estructura básica de la molécula de miosina. Además, se han encontrado diversas miosinas clasificándolas en dos
_____________________________________________________________________ Introducción
31
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
grupos: Miosinas convencionales a aquellas que forman filamentos y comprenden a la familia de proteínas conocidas como miosinas II. Miosinas no convencionales a las que no forman filamentos y tienen una función distinta a la de la contracción muscular y se conocen las miosinas I y III a XVII (Redowicz, 2007). 2.2. Estructura de la molécula de Miosina II La molécula de miosina II es uno de los principales componentes del sistema contráctil y comprende más del 50% de las proteínas totales. Las moléculas de miosina II se organizan en forma de filamentos gruesos y se convierten en elementos de transducción de energía y desarrollo de fuerza. La familia de miosina II incluye a miosinas del músculo esquelético y liso, de músculo cardíaco y también de sistemas no musculares. Todas las moléculas de miosina II tienen algunas propiedades comunes y otras específicas de cada tipo celular. La molécula de Miosina II es larga, asimétrica y de un peso molecular
de
aproximadamente
450
kDa.
Posee
dos
cabezas
globulares localizadas en el extremo amino (NH2) de la molécula, seguida de una larga cola semejante a varas entrelazadas. Cada molécula de miosina II es un hexámero compuesto por dos cadenas pesadas de aproximadamente 205 kDa cada una, dos cadenas livianas esenciales de 16 kDa a 20 kDa cada una y dos cadenas livianas reguladoras de aproximadamente 16 kDa a 20 kDa de peso molecular cada una. Las cadenas livianas regulatorias ( rLCM ), _____________________________________________________________________ Introducción
32
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
participan en la regulación de la contracción del músculo por el calcio, y las cadenas livianas esenciales ( eLCM ), regulan la actividad ATPasa de la molécula. (Lehman, 1978; Szent-Györgyi, 1980; Wagner y Stone. 1983). Las cadenas pesadas son asimétricas y cada una contiene una cabeza globular y una cola semejante a una vara. La porción globular tiene actividad enzimática (hidroliza ATP) y sitios de interacción con actina y con las cadenas livianas. La porción de la cola es la responsable del ensamble de la molécula en filamentos gruesos. En la Figura I.10 se observa una molécula de miosina II con sus dominios.
Figura I.10. Características de la molécula de miosina II. A. Esquema de la proteína mostrando las cadenas y dominios que la componen.
_____________________________________________________________________ Introducción
33
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
B.
Aspecto de la proteína observada por micrografías electrónicas de alta resolución. (Figura extraída de Alberts y col. 2002)
Los dominios peptídicos de miosina II se pueden separar por tratamientos proteolíticos controlados. La molécula de miosina II puede digerirse con quimiotripsina y papaína. La digestión con quimiotripsina (Prince y col. 1981), produce un corte dando dos fragmentos, uno denominado meromiosina pesada HMM (Heavy MeroMyosin) y otro meromiosina liviana LMM (Light Mero-Myosin). La digestión con papaína (Cohen y col. 1970) del fragmento HMM genera dos nuevos subfragmentos, S1 (Subfragmento 1) y S2 (Subfragmento 2). S1 comprende la porción globular de la molécula y S2 el cuello. Ver Figura I.11.
Figura I.11. Clivaje proteolítico de miosina II. El tratamiento de miosina II con quimiotripsina genera dos fragmentos, llamados meromiosina
pesada
(HMM),
y
meromiosina
liviana
(LMM).
El
_____________________________________________________________________ Introducción
34
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
tratamiento del fragmento HMM con papaína genera dos fragmentos más, S1 constituido por las dos cabezas globulares y S2 por el tallo restante. (Figura extraída de Lodish y col. 2005)
2.2.1. Estructura de la porción C-terminal de miosina II La porción carboxilo terminal del LMM de la cadena pesada de miosina II es el responsable de las propiedades de agregación, solubilización y forma el núcleo de los filamentos. El fragmento LMM mide 156 nm de longitud, posee una conformación “coiled coil”, motivo estructural encontrado en muchas proteínas, constituido por las largas hélices alfa, con un patrón de aminoácidos hidrofóbicos que se repite. Los aminoácidos hidrofóbicos se combinan con los de otras moléculas de miosinas y forman los filamentos gruesos. La información contenida en la secuencia primaria de las LMM es importante para entender las interacciones que ocurren entre las moléculas de miosina adyacentes en el filamento grueso. La
porción
LMM
tiene
una
secuencia
de
aminoácidos
característicos, posee un heptapéptido repetido (-a-b-c-d-e-f-g-), donde los aminoácidos a y d son hidrofóbicos y forman una interfase entre las hélices alfa de la proteína plegada. (Parry, 1981; McLachlan; Ueno y Harrington. 1981 a y b 1981; Stewart M. 1982). 2.3. Estructura de los filamentos gruesos de miosina II La molécula de miosina II forma dos tipos de filamentos gruesos, los filamentos bipolares y los de polaridad lateral. Los filamentos bipolares son característicos de miosina II de músculo
_____________________________________________________________________ Introducción
35
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
estriado y de músculo liso. Se forman por la nucleación de moléculas de
miosina
II
orientadas
en
forma
antiparalela.
Las
colas
se
entrecruzan y forman una región central desprovista de las cabezas, denominada zona desnuda. (Craig y Megerman. 1977; Hinssen y col. 1978). Los
filamentos
de
polaridad
lateral
o
side
polar
son
característicos de miosina II de músculo liso y de células no musculares, se interpreta que se forman por la unión de dímeros antiparalelos de miosina II. Cada nuevo dímero que se incorpora al filamento se une evitando la cabeza de las moléculas vecinas.
_____________________________________________________________________ Introducción
36
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
Figura I.12. Esquema de filamentos bipolares y de polaridad lateral (side polar). a corte longitudinal de los dos filamentos; b vistas longitudinales transversales
de del
transformaciones filamento
de
(negro:
FOURIER,
y
núcleo,
c
vistas
punteado:
entrecruzamiento). (Figura extraída de Xu y col. 1996)
2.3.1. Ensamble y desensamble de filamentos gruesos Como se mencionó anteriormente miosina II tiene la propiedad de ensamblarse en filamentos y es así como se encuentra en los tejidos.
_____________________________________________________________________ Introducción
37
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
Los filamentos de todos los tejidos musculares se disocian al ser expuestos a altas concentraciones salinas, aproximadamente 0,6 M de NaCl,
sugiriendo
que
las
uniones
entre
las
moléculas
son
principalmente de naturaleza iónica (Szuchet. 1977; Emes y Rowe. 1978 a y b; Trinick y Cooper, 1980). Estudios
de
microscopía
electrónica
demuestran
que
el
tratamiento con 160 mM de NaCl provoca el acortamiento de los filamentos a un tamaño intermedio, con 170 mM de NaCl se obtienen fragmentos más cortos y con 300 mM de NaCl la completa disociación. Estos tres estados de desensamble demuestran que existen distintos grados de empaquetamiento de la molécula de miosina II para formar el filamento (Trinick y Cooper, 1980). 2.3.2. Implicancia de la fosforilación de las cadenas livianas en la formación del filamento La cadena liviana regulatoria de miosina II ( rMLC ), es fosforilada por una quinasa denominada, quinasa de la cadena liviana regulatoria (MLCK), y es dependiente del complejo calcio-calmodulina. Asimismo la cadena liviana es defosforilada por una fosfatasa tipo I (MYPT 1). (Onishi y col. 1978); (Scholey y col. 1980). Cuando la cadena liviana está fosforilada, miosina II adquiere un estado conformacional conocido como 6 S. Estudios por microscopía electrónica demuestran que en estas condiciones la molécula tiene la cola o porción helicoidal desplegada.
_____________________________________________________________________ Introducción
38
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
Si la cadena liviana regulatoria se defosforila, miosina II cambia su conformación a un estado de 11 S y la cola de la molécula se pliega. (Suzuki, y col. 1978; Trybus y col. 1982; Kendrick-Jones y col. 1982; a, b y c). La condición natural de miosina II en el tejido es en estado 6S, es decir los sitios hidrofóbicos de las colas están expuestos y se combinan en forma antiparalela con otras moléculas de miosina II. (Craig y col. 1983). Cuando miosina II se encuentra en estado 11 S, la molécula es incapaz de formar filamentos y permanece soluble. Ver Figura I.11.
Figura
I.13.
Ensamblaje
controlado
de
miosina
II.
(
A
)
La
fosforilación controlada de una de las dos cadenas ligeras tiene al menos dos efectos in vitro:provoca un cambio en la conformación de la cabeza de miosina, exponiendo su lugar de unión a la actina, y libera la cola de miosina de la “zona pegajosa” de la cabeza, permitiendo que la molécula se ensamble formando cortos filamentos bipolares. La enzima responsable de esta fosforilación es la quinasa de la cadenaligera de la miosina. ( B ) Tinción negativa de filamentos cortos de miosina II quehan sido inducidos a ensamblarse por
_____________________________________________________________________ Introducción
39
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
fosforilación de sus cadenas ligeras. (Figura extraída de Alberts y col. 2002)
2.3.3. Implicancia de la fosforilación de la cadena pesada en la formación de filamentos de miosina II El fragmento LMM de miosinas de músculo liso y de células no musculares, es fosforilado en múltiples serinas cerca del extremo carboxilo terminal por la proteína quinasa C (PKC) y la caseína quinasa II, (Bresnick, 1999). Las fosforilaciones en la porción LMM inhiben el ensamble de miosina II en filamentos. Ver figura I.14.
Figura I.14. Secuencia de aminoácidos del extremo carboxilo terminal de dos isoformas de miosina II. Los sitios marcados con asteriscos son fosforilados por la PKC, y las puntas de flecha indican los sitios fosforilados por la caseína quinasa II. (Figura extraída de Bresnick 1999)
_____________________________________________________________________ Introducción
40
Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________
3. PROPÓSITO DEL TRABAJO DE TESIS El túbulo seminífero es una estructura compleja que contiene los distintos tipos celulares que participan en la formación de los espermatozoides y su posterior traslado a la rete testis. Es de nuestro interés estudiar las características contráctiles de las células mioides peritubulares del túbulo seminífero en el testículo de rata en desarrollo y adulto. Se aislará miosina de las células mioides peritubulares y se analizará: la estructura peptídica, la solubilidad en medios de baja y alta fuerza iónica y la participación en el proceso de contracción. Se desarrollará un método de tinción indispensable para medir los parámetros de las células MP en túbulos seminíferos aislados tanto en reposo como estimulados a contraerse. Por último se estudiará la relación de las características morfológicas de las células MP con
la expresión de isotipos de
miosina-CMP en túbulos seminíferos del testículo en desarrollo y en los segmentos conteniendo los distintos estados del epitelio seminífero.
_____________________________________________________________________ Introducción
41
CAPÍTULO II CARACTERÍSTICAS DE LA MOLÉCULA DE MIOSINA DE CÉLULAS MIOIDES PERITUBULARES DEL TESTÍCULO
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
CARACTERÍSTICAS DE LA MOLÉCULA DE MIOSINA DE CÉLULAS MIOIDES PERITUBULARES DEL TESTÍCULO Introducción: En este capítulo se analizará las característica de miosina de las células
mioides
peritubulares
del
testículo,
se
determinará
las
propiedades de la proteína tanto en su estructura peptídica como en la solubilidad en medios de baja y alta fuerza iónica.
1.
AISLACIÓN Y PURIFICACIÓN DE MIOSINA PRESENTE EN
LOS TÚBULOS SEMINÍFEROS 1.1. Contenido de miosina en el túbulo seminífero de testículo Cuando se homogenizan testículos de rata desprovistos de la túnica albugínea, en soluciones de baja fuerza iónica, se comprueba la existencia de una proteína de 205 kDa. (Figura II. 1)
_____________________________________________________________________ Resultados
43
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
Figura II.1. Proteínas de un homogeneizado de testículo. SDS-PAGE 7,5% teñido con azul de Coomassie. C+: miosina de músculo liso purificada parcialmente;
Homogeneizado:
homogeneizado
de
testículos
de
rata
sembrados en dos concentraciones. Las flechas en el interior de las figuras indican la posición de 205 kDa. Las flechas a la izquierda de la figura indican la posición de las proteínas de peso molecular conocido.
Cuando el homogeneizado se centrifuga a 100.000 xg por 60 minutos, se comprueba la existencia de una proteína de 205 kDa (que denominamos proteína 205) que se encuentra en su totalidad en el sobrenadante. Si el sobrenadante es incubado 30 minutos a 20° C, la proteína 205 se agrega y es posible sedimentarla por centrifugación.
_____________________________________________________________________ Resultados
44
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
La proteína 205 sedimentada puede ser nuevamente solubilizada por la incubación con 4 mM ATP (Sobrenadante ATP). (Ver figura II.2).
Figura II 2. Solubilización de la proteína 205 por ATP. Proteína de 205 kDa en el sobrenadante ATP. SDS PAGE 7,5% teñido con azul de Coomassie Se muestran las proteínas de tres experimentos. Las flechas indican la posición de las proteínas de peso molecular conocido (PM).
Debido a que la proteína 205 tiene la misma movilidad electroforética que la cadena pesada de miosina de músculo liso, se procedió a analizar por inmunoensayos la capacidad de un anticuerpo _____________________________________________________________________ Resultados
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Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
monoclonal anti-miosina II de músculo liso de aorta de reconocer a la proteína. Para su comparación se utilizaron miosinas de músculo liso de varios tejidos. Como se muestra en la figura II.3, el anticuerpo reconoce a la proteína 205, de la misma manera que a otras miosinas de músculo liso conocidas.
Actividad ATPasa: Se ha comprobado que la proteína de 205 kDa aislada en testículo de rata, es reconocida por un anticuerpo monoclonal anti-miosina de músculo liso.
Llama la atención que la
proteína 205 se encuentre soluble en medios de baja fuerza iónica, siendo que las proteínas miosinas de músculo liso no son solubles en esas condiciones. Para asegurarse de que se trata de miosina, la proteína 205 fue sometida a un ensayo de actividad ATPasa. Se conoce que solo las proteínas de la familia de las miosinas hidrolizan ATP en medios de alta concentración de KCl (0,6 M) y EDTA (medio EDTA-K). Los ensayos indicaron que las fracciones ricas en la proteína 205 kDa, hidrolizaron ATP a 0,8 ± 0.01 µM ATP/min/mg de proteína en coincidencia con la hidrólisis de ATP en medio EDTA-K de miosina de músculo liso de estómago de pollo (McKenna y col. 1989). Debido a que la proteína 205 coincide con la movilidad relativa de la cadena pesada de miosina de músculo liso, es reconocida por un anticuerpo enriquecidas
anti-miosina de
la
de
proteína
músculo
liso
hidrolizan
y
ATP
además en
medio
fracciones EDTA-K,
mostrando una actividad de ATPasa propia de las proteínas miosina, se _____________________________________________________________________ Resultados
46
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
procedió a denominar a la proteína 205 como miosina -CMP. (Más adelante en el texto se explicará el motivo de la denominación).
Figura II.3. Reconocimiento de la proteína 205, con anticuerpo antimiosina II de músculo liso. A. SDS-PAGE 5% teñido con azul de Coomassie. B. Inmunoensayo del gel. 1 y 2 citosol de testículo de rata en dos concentraciones; 3-6, miosina de tejidos de rata:3 y 4: de aorta (edad perinatal y adulta respectivamente); 5: útero, 6, cordón umbilical; 7 proteína 205 concentrada por agregación-desagregación. Las flechas indican las posiciones de miosinas reconocidas en las bandas del gel y en la lámina de nitrocelulosa.
1.2. Purificación de miosina-CMP 1.2.1. Método agregación-desagregación: En base a que miosinaCMP está soluble en el citosol, se agrega a 20° C y se resuspende con ATP, se desarrolló un método sencillo para poder aislarla. (Ver figura II.4). El método que llamamos de agregación-desagregación permite obtener una fracción enriquecida de miosina-CMP, sin utilizar columnas _____________________________________________________________________ Resultados
47
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
cromatográficas. Como se observa en la figura II.5, por este método se obtienes muestras donde aproximadamente el 70 % de las proteínas corresponde a miosina-CMP.
Figura II.4. Esquema del método de agregación-desagregación de miosina-CPM Diagrama esquemático del método utilizado para aislar miosina-CMP de testículo de rata y toro.
_____________________________________________________________________ Resultados
48
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
Figura II.5. Aislamiento de miosina-CMP por el método de agregacióndesagregación. SDS-PAGE 7,5 % teñido con azul de coomassie. La flecha indica la posición de miosina-CMP.
1.2. 2. Purificación de miosina-CMP en gradiente de sacarosa Una vez puesta a punto la técnica para obtener una fracción enriquecida de miosina-CMP, se utilizó esta preparación para purificar la proteína. Para ello se carga la muestra en un gradiente de sacarosa (5 %-20 %). El gradiente se centrifuga a 100.000 xg, 18 horas, 4 °C. Se colectan 18 fracciones, que se numeran desde el fondo del tubo. Las fracciones 7 a 11 contienen miosina-CMP altamente purificada, aunque perdura una pequeña contaminación con proteínas de bajo peso molecular. Ver figuras II.6.
_____________________________________________________________________ Resultados
49
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
Figura II.6. Purificación de miosina-CMP en un gradiente de sacarosa. SDS-PAGE al 7,5 % teñido con azul de Coomassie. .Gel A: Muestra de proteínas sembradas en el gradiente ( C+) y primeras 11 fracciones (1-11). Gel B: fracciones 11-18.
La migración de proteínas de peso molecular
conocido es mostrado a la izquierda de la figura.
1.2. 3. Purificación de miosina-CMP en columna de hidroxiapatita Miosina-CMP, parcialmente purificada por el método agregacióndesagregación, se sembró en una columna de hidroxiapatita, la columna se eluyó con un gradiente de 0 - 400 mM de fosfato de sodio en 0,6 M de NaCl y se recogieron 28 fracciones. En las fracciones 1624 se obtiene miosina-CMP purificada al 100 %, como se observa en la figura II.7.
_____________________________________________________________________ Resultados
50
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
Figura
II.7.
Purificación
de
miosina-CMP
por
cromatografia
de
hidroxiapatita. SDS-PAGE 7,5 % teñido con azul de coomassie. C+: proteínas sembradas en la columna. fracciones de la elusión (2-28). La flecha indica la posición de la cadena pesada de miosina-CMP.
_____________________________________________________________________ Resultados
51
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
2. CARACTERÍSTICAS PEPTÍDICAS DE LA CADENA PESADA DE MIOSINA-CPM 2.1. Digestión Enzimática Para conocer la composición peptídica de miosina-CMP se procedió a realizar cortes de la proteína con tripsina a distintos tiempos. Miosinas de músculo liso de la túnica albugínea y la arteria espermática del testículo fueron digeridas en paralelo. Los péptidos de la digestión, fueron analizados en un inmunoblotting con un anticuerpo antimiosina de músculo liso (Figura II.8)
Figura II.8. Digestión de miosina con tripsina. Miosina de arteria espermática (Art. Esp.), túnica Albuguinea (Tunica Alb.) y túbulos seminíferos (miosina cmp) fueron digeridas con tripsina 20 y 40 min a 20 °C. A: SDSPAGE 7,5 % teñido con azul de Coomassie , B: inmunoensayo del gel con anti-miosina de músculo liso. Las cabezas de flechas a la derecha de la figura indican los péptidos producidos por la digestión de miosina CMP. La migración de proteínas de peso molecular conocido es mostrado a la izquierda de la figura. _____________________________________________________________________ Resultados
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Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
La digestión con tripsina mostró que se producían péptidos de distinto peso molecular de miosina-CMP con respecto a la miosina de músculo liso de la túnica albugínea y de la arteria espermática Figura II.8). 2.2. Espectrometría de masas Debido a que miosina-CMP presenta un patrón de péptidos distintos a los de otras proteínas de músculo liso (ver figura II.8), se procedió a analizar la huella peptídica por espectrometría de masas. Bandas de un gel al 7,5 % de la cadena pesada de miosina-CMP de rata y toro, teñidas con azul de Coomassie fueron escindidas, y analizadas
por
Maldi-TOF
(MALDI:
Matrix-Assisted
Laser
Desorption/Ionization, desorción/ionización mediante láser asistida por matriz). En la ionización, los analitos cocristalizados con una matriz apropiada son convertidos en iones mediante la acción de un láser. Esta fuente de ionización suele asociarse a un analizador de tiempo de vuelo (TOF: Time-Of-Flight) en el que los iones se separan en función de su relación masa-carga tras ser acelerados en un campo eléctrico, y de allí se obtiene la huella peptídica de las masas de la proteína. La comparación de los péptidos obtenidos fueron analizados utilizando el programa MASCOT de Matrix science. Se determinó la búsqueda considerando que miosina-CMP había sido digerida con tripsina y había sido modificada por carboximetilación. 2.2.1. Miosina-CMP de testículo de rata: En un análisis de amplio espectro se comprobó que con un “score” significativo de 95 %, _____________________________________________________________________ Resultados
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Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
de los 65 péptidos de miosina-CMP analizados, 27 de ellos coincidían con miosina de músculo liso de rata Rattus norvegicus (número de acceso al banco de datos gi|34868040). Estos resultados indicaban que los péptidos de miosina CMP que coincidían con los de músculo liso de rata representaban el 18% del total de la proteína. (Ver figura II.9)
1 MAQKGQLSDD EKFLFVDKNF INSPMAQADW VAKKLVWVPS EKQGFEAASI 51 KEEKGDEVVV ELVENGKKVT VGKDDIQKMN PPKFSKVEDM AELTCLNEAS 101 VLHNLRERYF SGLIYTYSGL FCVVVNPYKH LPIYSEKIVD MYKGKKRHEM 151 PPHIYAIADT AYRSMLQDRE DQSILCTGES GAGKTENTKK VIQYLAVVAS 201 SHKGKKDSSI TGELEKQLLQ ANPILEAFGN AKTVKNDNSS RFGKFIRINF 251 DVTGYIVDLL EKSRAIRQAR DERTFHIFYY LIAGAKEKMR NDLLLESFNS 301 YTFLSNGFVP IPAAQDDEMF QETLEAMSIM GFSEEEQLAI LKVVSSVLQL 351 GNIVFKKERN TDQASMPDNT AAQKVCHLVG INVTDFTRAI LTPRIKVGRD 401 VVQKAQTKEQ ADFAIEALAK ATYERLFRWI LSRVNKALDK THRQGASFLG 451 ILDIAGFEIF EVNSFEQLCI NYTNEKLQQL FNHTMFILEQ EEYQREGIEW 501 NFIDFGLDLQ PCIELIERPN NPPGVLALLD EECWFPKATD KSFVEKLCSE 551 QGNHPKFQKP KQLKDKTEFS IIHYAGKVDY NASAWLTKNM DPLNDNVTSL 601 LNASSDKFVA DLWKDVDRIV GLDQMAKMTE SSLPSASKTK KGMFRTVGQL 651 YKEQLGKLMT TLRNTTPNFV RCIIPNHEKR SGKLDAFLVL EQLRCNGVLE 701 GIRICRQGFP NRIVFQEFRQ RYEILAANAI PKGFMDGKQA CILMIKALEL 751 DPNLYRIGQS KIFFRTGVLA HLEEERDLKI TDVIMAFQAM CRGYLARKAF 801 TKRQQQLTAM KVIQRNCAAY LKLRNWQWWR LFTKVKPLLQ VTRQEEEMQA 851 KEEEMQKIKE RQQKAESELK ELEQRHTQLA EEKTLLQEQL QAETELYAEA 901 EEMRVRLAAK KQELEEILHE MEARLEEEED RSQQLQAERK KMAQQMLKEE 951 KSRQELEKLK RKLEGDASDF HEQIADLQAQ IAELKMQLAK KEEELQAALA 1001 RLDEEITQKN NALKKIRELE GHVSDLQEDL DSERAARNKA EKQKRDLGEE
_____________________________________________________________________ Resultados
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Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
1051 LEALKTELED TLDSTATQQE LRAKREQEVT MLKKALDEET RSHEAQVQEM 1101 RQKHTQAVEE LTEQLEQFKR AKANLDKSKQ TLEKENADLA GELRVLGQAK 1151 QEVEHKKKKL EGQLQELQSK CSDGERARTE LSDKVHKLQN EVESVTGMLN 1201 EAEGKAIKLA KEVASLGSQL QDTQELLQEE TRQKLNVSTK LRQLEDERNS 1251 LQDQLDEEME AKQNLERHVS TLNIQGPYGS PLGLCGLFVQ LFPLLLDFLS 1301 WRKSVHFSGF HSWPLQLSDS KKKLQDLAST IEVMEEGKKR LQKEMEGLGQ 1351 QYEEKAAAYD KLEKTKNRLQ QELDDLVVDL DNQRQLVSNL EKKQKKFDQL 1401 LAEEKNISSK YADERDRAEA EAREKETKAL SLARALEEAL EAKEELERTN 1451 KMLKAEMEDL VSSKDDVGKN VHELEKSKRA LETQMEEMRT QLEELEDELQ 1501 ATEDAKLRLE VNMQALKGQF ERDLQARDEQ NEEKRRQLQR QLHEYETELE 1551 DERKQRALAA AAKKKLEGDL KDLELQADSA VKGREEAIKQ LRKLQAQMKD 1601 FQRELDDARA SRDEIFATSK ENEKKAKSLE AELMQLQEDL AAAERARKQA 1651 DLEKEELAEE LASSLSGRNT LQDEKRRLEA RIAQLEEELE EEQGNMEAMS 1701 DRVRKATLQA EQLSNELVTE RSAAQKNESA RQQLERQNKE LRSKLQEVEG 1751 AVKAKLKSTV AALEAKIVQL EEQIEQEARE KQAATKLLKQ KDKKLKEVLL 1801 QVEDERKMVE QYKEQAEKGN TKVKQLKRQL EEAEEESQRI NANRRKLQRE 1851 LDEATESNEA MGREVNALKS KLRRGNEASF VPSRRAGGRR VIENTDGSEE 1901 EMDARDSDFN GTKASE
Figura II.9. Comparación de los péptidos de miosina-CMP de rata. Secuencia peptídica de miosina de músculo liso de rata (Rattus norvegicus gi|3486804). Se muestra el resultado del análisis de 65 peptidos de miosinaCMP, de los cuales, 27 (resaltados en rojo) coincidieron con los de miosina de musculo liso y cubrieron el 18% de la proteína.
_____________________________________________________________________ Resultados
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Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
1 MSLWLTALES LQGSALSGTM QDRTQRQSLP TGQTDETDTQ GTKQVWILVP 51 VFLVRTVSCL RGGAWQSFQV ALLQRPCSFD NVAPESGDQM HVLRPHCGLW 101 DGEEGHHLLG GDEAREKNLF LAALLEEKVG EEVQRKRRIL TCRVWSVGSW 151 ASPESLRARF GGGTTGVLYL FGKLTGRLAC PRPDPKSGEK EEREGHVWKV 201 RVSPRCPRQA SLRPVAGAVS FPRLRAVCFQ WECPRPEVPD GPLLPLLGTS 251 YREDQSILCT GESGAGKTEN TKKVIQYLAV VASSHKGKKD TSITQIGGLE 301 TASGVTAPAI AGAVTETARL EALGGLGQAP LVAGGALLPA TDAGNPAFPS 351 RLWHNVLEHT ILRLSLRGSE RGFSLRRLSL RLMALLWHAS LPLLPAVIPE 401 FLPRALAPAH RCVLVHIPTD PSYGNFTRAQ DFHGGAPSEG AGGLWTASAA 451 FNLMNGAQAT CFEALFCSSV KTIPDVNKFQ GELEKQLLQA NPILEAFGNA 501 KTVKNDNSSR FGKFIRINFD VTGYIVGANI ETYLLEKSRA IRQARDERTF 551 HIFYYLIAGA KDKMKNDLLL EGFNNYTFLS NGFVPIPAAQ DDEMFQETVE 601 AMAIMGFSEE EQLSAQKVCH LMGINVTDFT RSILTPRIKV GRDVVQKAQT 651 KEQADFAIEA LAKATYERLF RWILSRVNKA LDKTHRQGAS FLGILDIAGF 701 EIFEDAHRAS PVSHTQVNSF EQLCINYTNE KLQQLFNHTM FILEQEEYQR 751 EGIEWNFIDF GLDLQPCIEL IERPNNPPGV LALLDEECWF PKATDKSFVE 801 KLCTEQGNHP KFQKPKQLKD KTEFSIIHYA GKVDYNASAW LTKNMDPLND 851 NVTSLLNASS DKFVADLWKD VDRIVGLDQM AKMTESSLPS ASKTKKGMFR 901 TVGQLYKEQL GKLMTTLRNT TPNFVRCIIP NHEKRSGKLD AFLVLEQLRC 951 NGVLEGIRIC RQGFPNRIVF QEFRQRYEIL AANAIPKGFM DGKQACILMI 1001 KALELDPNLY RIGQSKIFFR TGVLAHLEEE RDLKITDVIM AFQAMCRGYL 1051 ARKAFAKRQQ QLTAMKVIQR NCAAYLKLRN WQWWRLFTKP VCTRGLRLNW 1101 SWHQFFGPEK GPLLVRHVKP LLQVTRQEEE MQAKEDELQK TKERQQKAEN 1151 ELKELEQKHT QLAEEKNLLQ EQLQAETELY AEAEEMRVRL AAKKQELEEI 1201 LHEMEARLEE EEDRGQQLQA EKKKMAQQML DLEEQLEEEE AARQKLQLEK 1251 VTAEAKIKKL EDDILVMDDQ NNKLSKEGLS SGRLSGGLHL LRGPGFVAVR 1301 LKKEEKSRQE LEKLKRKLEG EASDFHEQIA DLQAQIAELK MQLAKKEEEL 1351 QAALGRPSLV YTCARSPFHW PLKHHLPEAG TTLLPLLRRV FFVNASLPFT
_____________________________________________________________________ Resultados
56
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
1401 LLLALRPPPG CSGPHTPRAL RNLSPHHPCV LQDGARVTGQ NHHLGCEPAW 1451 KTLLQSKRPA PPLDDEIAQK NNALKKIREL EGHISDLQED LDSERAARNK 1501 AEKQKRDLGE ELEALKTELE DTLDSTATQQ ELRAKREQEV TVLKKALDEE 1551 TRSHEAQVQE MRQKHTQAVE ELTEQLEQFK RAKANLDKNK QTLEKENADL 1601 AGELRVLNQA KQEVEHKKKK LEVQLQELQS KCSDGERARA ELNDKVHKLQ 1651 VTHFLWEPRN CRDQPHHGSG ISQSVDSHKT YHNEVESVTG MLNEAEGKAI 1701 KLAKDVASLG SQLQDTQELL QEETRQKLNV STKLRQLEDE RNSLQDQLDE 1751 EMEAKQNLER HISTLNIQLS DSKKKLQDFA STVEALEEGK KKFQKEIEGL 1801 TQQYEEKAAA YDKLEKTKNR LQQELDDLVV DLDNQRQLVS NLEKKQKKFD 1851 QLLAEEKSIS SKYADERDRA EAEAREKETK ALSLARALEE ALEAKEELER 1901 TNKMLKAEME DLVSSKDDVG KNVHELEKSK RALETQMEEM KTQLEELEDE 1951 LQATEDAKLR LEVNMQALKG QFERDLQARD EQNEEKRRQL QRQLHEYETE 2001 LEDERKQRAL AAAAKKKLEG DLKDLELQAD SAIKGREEAI KQLRKLQAQM 2051 KDFQRELEDA RASRDEIFAT AKENEKKAKS LEADLMQLQE DLAAAERARK 2101 QADLEKEELA EELASSVSGR NTLQDEKRRL EARIAQLEEE LEEEQGNMEA 2151 MSDRVRKATQ QAEQLNNELA TERSAAQKNE SARQQLERQN KELRSKLQEM 2201 EGAVKSKFKS TIAALEAKIA QLEEQVEQEA REKQATAKSL KQKDKKLKEV 2251 LLQVEDERKM AEQYKEQAEK GNAKVKQLKR QLEEAEEESQ RINANRRKLQ 2301 RELDEATESN EAMGREVNAL KSKLRRGNET AFVPSRRSGG RRVIENADGS 2351 DEEVDARDAD FNGTKASE
Figura II.10 Comparacion de los peptidos de miosina-CMP de toro. Secuencia peptídica de miosina de músculo liso Myh11 de perro (Canis familiaris gi|57088007). Se muestra el resultado del análisis de 65 peptidos de miosina CMP de toro, de los cuales, 24 (resaltados en rojo) coinciden con los de miosina Myh 11 y cubrieron el 13% de la proteína.
_____________________________________________________________________ Resultados
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Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
Además, los análisis de espestrometría de masas indicaron que diez péptidos con masas entre 855 y 1277 no coincidían con los peptidos de ninguna proteína conocida. (Ver tabla I). 2.2.2. Miosina-CMP de testículo de toro: Debido a que se habían aislado y purificado miosina-CMP de testículo de toro, se procedió también a analizar por Maldi-Tof. Utilizando el mismo programa y el mismo banco de datos que para miosina CMP de rata, se comprobó que con un score significativo de 81 %, de los 65 peptidos analizados, 24 de ellos coincidían con miosina de músculo liso de perro, Myh 11 Canis familiaris (número de acceso al banco de datos: gi|57088007). Estos resultados indicaban que los peptidos de miosinaCMP que coincidían con la proteína Myh 11 y que representaban el 13% del total de la proteína. (Ver figura
10).
Coincidentemente con miosina-CMP de rata, miosina-CMP de toro presenta siete péptidos con masas entre 855 y 1670 que no coinciden con los peptidos de ninguna proteína conocida. (Ver tabla II.I).
Tabla II. I. Masa estimada de péptidos específicos de miosinaCMP
_____________________________________________________________________ Resultados
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Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
MASA DE LOS PÉPTIDOS
MIOSINA-CMP DE RATA
MIOSINA-CMP DE TORO
1. 855,09
1. 855,09
2. 861,10
2. 861,05
3. 877,05
3. 864,20
4. 1050,11
4. 877,00
5. 1066,09
5. 1034,52
6. 1072,10
7. 1277,10
8.
1552,75
9. 1624.84
6. 1615,79
10. 1706.87
7. 1670,85
_____________________________________________________________________ Resultados
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Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
3. PROPIEDADES DE SOLUBILIDAD DE MIOSINA-CMP 3.1. Solubilidad in vitro Como se mencionó anteriormente, miosina-CMP se encuentra soluble cuando se homogeniza el testículo, de todas maneras no conocemos la relación de miosina-CMP soluble y agregada. Para determinar
el porcentaje
de
miosina-CMP
soluble
realizamos
el
siguiente ensayo. Homogenizamos túbulos seminíferos con baja y alta fuerza iónica, purificamos miosina-CMP por el método de agregacióndesagregación y ulterior centrifugado sobre 20 % de sacarosa. Determinamos la concentracion de miosina-CMP en S3. Como se indica en la figura II.11, fue similar la cantidad de miosina-CMP obtenida con y sin fuerza iónica. La cuantificación de las bandas de miosina-CMP por comparación de bandas conocidas de albúmina indicó que se habían extraído 14,8 ± 1,9 µg/g de miosina-CMP por el uso del medio sin fuerza iónica y 15,8 ± 2,2 µg/g de miosina-CMP por el uso de fuerza iónica (0,6 M NaCl). Estos resultados confirman que la mayoría de miosina-CMP se encuentra soluble en el citoplasma de la célula.
_____________________________________________________________________ Resultados
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Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
Figura II.11. Extracción de miosina-CMP de testículo de rata con y sin fuerza iónica. 5µl y 10 µl de S3 de la extracción de miosina-CMP sin fuerza iónica (a-b) y con fuerza iónica (c-d). 1, 2 y 3 µg de ASB (e-g). La figura muestra un gel de poliacrilamida al 7,5 %, teñido con azul de Coomassie. La posición de miosina-CMP es mostrada a la izquierda de la figura y la de albúmina (66 Kda) a la derecha.
3.1.1. Solubilidad de miosina de otros tejidos: Hemos demostrado que miosina-CMP es una proteína que se asemeja a miosina II de músculo liso, pero llama la atención que se encuentre soluble en el citosol. Nos preguntamos si existe miosina soluble en otros tejidos del testículo. Para ello se comparó la solubilidad de miosina-CMP de los túbulos seminíferos con la solubilidad de miosina de la arteria seminífera y de la túnica albugínea. Los tres tejidos se trataron en forma idéntica. Se homogenizaron con buffer PM, se centrifugaron, se separó el sobrenadante (S1) y el sedimento se resuspendió con 0,65 M _____________________________________________________________________ Resultados
61
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
de NaCl en PM, se centrifugó y se obtuvo un sobrenadante (S2). Al analizar el contenido de miosina en S1 y S2 se observó que solo miosina-CMP del túbulo seminífero se encontraba soluble en S1, mientras que miosina de músculo liso de la arteria espermática y de la túnica albugínea se encontraba en S2. Por la tanto en las condiciones utilizadas, la miosina II de músculo liso se encuentra agregada formando filamentos, como ya ha sido demostrado en numerosos ensayos, en contraposición a miosina-CMP. Ver figura II.12.
Figura II.12. Grado de solubilidad de miosina de distintos tejidos. Sobrenadante (S1) y sedimento resuspendido con fuerza iónica (S2) de túbulos seminíferos (A), arteria espermática (B) y túnica albugínea (C). SDSPAGE
al
7,5
%
teñido
con
azul
de
coomassie
(coomassie
blue)
y
reconocimiento de miosina de músculo liso en el blotting (anti-SMM II). La migración de proteínas de peso molecular conocido es indicada a la izquierda de la figura.
_____________________________________________________________________ Resultados
62
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
Estos resultados indican que si se trata de filamentos de miosina II de músculo liso las condiciones de homogeneización con buffer PM no alteran su estabilidad. Por lo tanto, en este momento se puede inferir que la molécula de miosina-CMP tiene alguna diferencia estructural que le impide formar filamentos en medios de baja fuerza iónica. 3.2. Agregación in vitro Debido a que hemos comprobado que más del 90 % de miosinaCMP se encuentra soluble en los túbulos seminíferos, nos intereso analizar el comportamiento que presenta in vitro cuando se la expone a
soluciones
de
distinta
fuerza
iónica.
Además
se
observó
el
comportamiento de miosina II de músculo liso y estriado. Como se ha comprobado en otros laboratorios, a 4° C, miosina II de músculo liso y estriado, dializadas en una solución sin NaCl, están completamente agregadas. Mientras que en solución 100 mM de NaCl, 80 % de miosina II de músculo estriado y el 79 % de miosina II de músculo liso permanecen agregadas respectivamente. Con 150 mM y 300 mM, el 50 % y el 40 % de miosina II de músculo estriado permanecen agregadas respectivamente (figura II.13) Cuando se determina el grado de solubilidad de miosina-CMP se comprueba que en diálisis con 0 mM de NaCl sólo el 10 % esta agregada y ese porcentaje se mantiene con las otras soluciones de NaCl probadas ( 100 - 300 mM ) (ver la figura II.13). El mismo grado de solubilidad presenta miosina-CMP de toro sometida a las mismas _____________________________________________________________________ Resultados
63
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
concentraciones de NaCl. Es decir, miosina-CMP tiene un alto grado de solubilidad en soluciones de baja fuerza iónica a 4° C en contraste con el comportamiento de miosina II de músculo liso y estriado. (Ver figura II.13).
Figura II.13. Ensayo de agregación de distintos tipos de Miosina a 4°C. Soluciones conteniendo miosina-CMP de rata y toro, miosina II de músculo estriado y liso,
de aproximadamente 150 µg/ml fueron dializadas
por 12 horas en contra de 0-300 mM de NaCl a 4ºC. En el gráfico se muestra el porcentaje soluble de cada tipo de miosina en las distintas concentraciones de
NaCl.
Los
datos
presentados
corresponden
al
promedio
de
dos
experimentos y la dispersión no es mayor a un 5 %.
_____________________________________________________________________ Resultados
64
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
Debido a que nosotros teníamos experiencia de que a 20 °C miosinaCMP se agrega, repetimos el experimento anterior utilizando las mismas soluciones de diálisis, pero efectuando el ensayo a 20° C. (figura II. 14). Diálisis con 0 y 50 mM de NaCl muestra que el 100 % de miosina-T está agregada, de la misma forma que miosina II de músculo liso y estriado. Con diálisis de 100 mM de NaCl el 90 % de miosina-T de rata y el 100 % de miosina-T de toro estan agregadas, de manera similar a miosina II de músculo liso y estriado ( 89 % y 87 % respectivamente). Con 150 mM de NaCl los porcentajes observados fueron 50 % y 20 % de agregación para miosina-T de rata y toro respectivamente, y 75 % y 70 % para miosina II de músculo liso y músculo estriado, respectivamente. Con 300 mM de NaCl todas las miosinas probadas presentan un muy bajo grado de agregación (0 % para miosina-CMP de rata y toro, 30 % y 20 % para miosina II de músculo liso y estriado). Por lo tanto, miosina-CMP en medio de baja fuerza iónica tiene la particularidad de estar totalmente soluble a 4 °C y totalmente agregada a 20 °C.
_____________________________________________________________________ Resultados
65
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
Figura II.14. Ensayo de agregación de distintos tipos de Miosina a 20° C. Soluciones conteniendo miosina-CMP de rata y toro, miosina II de músculo estriado y liso,
de aproximadamente 150 µg/ml fueron dializadas por 12
horas en contra de 0-300 mM de NaCl a 4ºC. En el gráfico se muestra el porcentaje soluble de cada tipo de miosina en las distintas concentraciones de NaCl. Los datos presentados corresponden al promedio de dos experimentos y la dispersión no es mayor a un 5 %.
3.3. Desagregación in vitro Debido a que miosina-CMP presenta la característica que es soluble a en soluciones de baja fuerza iónica y solo se agrega a 20 °C, nos preguntamos si los filamentos formados a 20 °C era más lábiles que los filamentos de miosina de músculo liso de pollo que se forman espontáneamente a 4 °C. Por lo tanto filamentos de miosina-CMP y de miosina músculo liso de pollo fueron sometidos a fuerza iónica. Como _____________________________________________________________________ Resultados
66
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
la figura II.15 lo indica, es necesario 200 mM de NaCl para solubilizar alrededor del 20 % de los filamentos de ambas miosinas, y 300 mM de NaCl para solubilizar el 60 % de los filamentos de ambas miosinas. Por lo tanto cuando se logran obtener las condiciones para polimerizar miosina-CMP, los filamentos formados tienen la misma estabilidad a fuerza iónica que los de miosina-músculo liso de pollo.
Figura II.15. Desagregación de filamentos de miosina por fuerza iónica. Filamentos de miosina-CMP de rata y miosina II de liso, (formados de aproximadamente 150 µg/ml de miosina, fueron incubados con 0-300 mM de NaCl a 20 ºC. En el gráfico se muestra el porcentaje soluble de cada tipo de
_____________________________________________________________________ Resultados
67
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
miosina en las distintas concentraciones de NaCl. Los datos presentados corresponden al promedio de dos experimentos ± SEM.
Se conoce que los filamentos de miosina de músculo liso en general son lábiles a la presencia de ATP, por ello analizamos la solubilidad de miosina-CMP y las comparamos con la de los filamentos de miosina de músculo liso. Como la figura 15 lo indica, los filamentos de miosina-CMP resultados muchos más lábiles que los de miosina de músculo liso.
_____________________________________________________________________ Resultados
68
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
FIGURA II.16. Desagregación de filamentos de miosina por ATP. Filamentos de miosina-CMP de rata y miosina II de músculo liso, (formados de aproximadamente 150 µg/ml de miosina,
fueron incubados con de 0-35
mM de ATP a 20 ºC. En el gráfico se muestra el porcentaje soluble de cada tipo
de
miosina
en
las
distintas concentraciones
de
ATP.
Los
datos
presentados corresponden al promedio de dos experimentos ± SEM.
_____________________________________________________________________ Resultados
69
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
4. LOCALIZACIÓN DE MIOSINA-CMP EN LOS TEJIDOS DEL TESTÍCULO 4.1 Células mioides peritubulares. Para analizar en que células del testículo se encuentra miosinaCMP, testículos de rata desprovistos de la túnica albugínea y vasos sanguíneos, fueron sometidos a dos tratamientos enzimáticos ( ver sección Materiales y Métodos) Se separaron los túbulos seminíferos del tejido intersticial por un tratamiento suave con tripsina; y luego los túbulos seminíferos (TS) fueron disgregados utilizando una solución de digestión que contiene colagenasa y hialuronidasa (ver materiales y métodos), separando de esta manera a las células mioides peritubulares (células MP) del resto de las células del TS (TSd). Para analizar el grado de desprendimiento de las células MP durante el tratamiento enzimático del TS, en distintos momentos del tratamiento, muestras de TS se tiñeron con nitrato de plata y se observaron en una lupa. Debido a que las células MP tienen la particularidad de ser las únicas células del testículo que presentan reacción a fosfatasa alcalina (Chapin y col. 1987; Palombi
y Di Carlo, 1988; Anthony y Skinner,
1989), las fracciones celulares obtenidas del tratamiento enzimático del TS fueron sometidas a la reacción de fosfatasa alcalina. Además en la fracción de células MP se determinó el porcentaje de células con reacción positiva a fosfatasa alcalina. _____________________________________________________________________ Resultados
70
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
El anticuerpo anti-miosina detectó miosina en los túbulos seminíferos intactos y en la fracción de las células mioides peritubulares Fig. 13 B. Además el análisis de fosfatas alcalina en las las fracciones indicó un alto porcentaje de actividad en la fracción de células MP. Por lo tanto, con estos resultados podemos confirmar que la miosina encontrada en el testículo proviene de las células MP como lo indica la figura 13 C.
C.
Fracciones Actividad alcalina
de
TS
TSd
I
CMP
100
16,7± 2,3
4,5± 2,1
70± 5,3
Fosfatasa
( % del total)
Figura II.16. Localización de miosina-CMP en el tejido testicular. Túbulos seminíferos intactos (TS); túbulos seminíferos sometidos a la digestión (TSd); intersticio (I); y fracción de células MP (CMP) fueron analizados por SDS-PAGE al 7,5 % teñido con azul de Coomassie (A). Inmunoensayo con anti-miosina (B) y actividad fosfatasa (C). Control positivo para miosina-CMP(C+), La posición de la cadena pesada de miosina se indica _____________________________________________________________________ Resultados
71
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
en B con una flecha. Las flechas a la izquierda de la figura indican la posición de proteínas con peso molecular conocido. En C se indica el porcentaje de actividad de fosfatasa alcalina recuperada en las fracciones, siendo el 100% de la actividad el corresponde al de los túbulos seminíferos intactos.
_____________________________________________________________________ Resultados
72
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
5. DISCUSIÓN DEL CAPÍTULO II Los resultados indican que en el túbulo seminífero de la rata se encuentra una proteína con movilidad relativa de 205 kDa. Dicha proteína es reconocida por un anticuerpo monoclonal anti miosina de músculo liso. Dicha proteína fue bautizada por nosotros miosina-CMP. Miosina-CMP tiene la particularidad que se encuentra soluble en el citosol del homogeneizado de túbulos seminíferos mientras que se mantenga a 4 °C. Si la suspención se incuba a 37 °C por 30 min, miosina-CMP se agrega en filamentos. En base al comportamiento de miosina-CMP a 4 y 37 °C se desarrolló en este laboratorio un método para purificar la proteína a partir de un citosol de homogeneizado de tubulos seminíferos. Dicho método, que consiste en agregar y desagregar la proteína en medios de baja fuerza iónica, permite obtener una suspención de miosina-CMP con un 90 % de pureza. Si este material es sometido a centrifugación en gradiente de sacarosa, se obtienen fracciones de miosina-CMP con 100 % de pureza. Además, se obtuvieron fracciones puras de miosinaCMP por cromatografía en columna de hidroxiapatita, a partir de proteínas obtenidas por el método de agregación-desagregación. Con
miosina-CMP
purificada
se
continuó
caracterizando
la
proteína. Se comprobó que miosina-CMP presenta gran capacidad para hidrolizar ATP en medio EDTA-K, condiciones solo inherentes para hidrolizar ATP por la familia de miosinas.
_____________________________________________________________________ Resultados
73
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
La
digestión
parcial
de
miosina-CMP
con
tripsina
y
la
comparación de bandas en electroforesis en geles de poliacrilamida, permitió evidenciar que presentaba péptidos con movilidad relativa distinta a la de miosina de músculo liso de arteria espermática y túnica albugínea de rata. Además, la composición peptídica de miosina-CMP fue analizada utilizando espectrometría de masa, específicamente realizando el análisis Maldi-Tof.
Este análisis permitió dilucidar la composición
peptídica de miosina-CMP de testículo de rata y toro y se comprobó que tenía una baja homología con miosina de músculo liso de rata y de pollo respectivamente. Además miosina-CMP de rata y toro, mostró masas de péptidos que entre 10 y 12 no presentaban homología con ninguna proteína conocida y otros, que solo coincidían con peptidos de proteínas muy alejados de la familia de proteínas. Además en este capítulo se analizó la localización de miosinaCMP y se comprobó que se encontraba en las células mioides peritubulares del testículo. Por lo tanto, los resultados obtenidos en este capítulo se pueden resumir que se encontró una proteína de la familia de las proteínas, que tiene la particularidad de no ensamblar en filamentos en medios de baja fuerza iónica. Que miosina-CMP tiene parcial homología con miosina de músculo liso conocida y que varios péptidos son inéditos. Nos preguntamos sobre la naturaleza de la solubilidad de miosina-CMP y en base a los resultados obtenidos comprobamos que la _____________________________________________________________________ Resultados
74
Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
temperatura puede producir agregación. Por otro lado miosina-CMP purificada presenta la misma característica que la obtenida en el citosol.
Es
decir
solo
se
agrega
por
temperatura.
Además
comprobamos que los filamentos formados de miosina-CMP son estables como los de miosina de músculo liso conocidas. Solo que los filamentos son más lábiles que los de miosina de músculo liso. La falta de agregación de miosina-CMP es atribuida a diferencias peptídicas con la de miosinas de músculo liso convencionales. Nos preguntamos la función de miosina-CMP en las células miodes peritubulares del testículo. Es
conocido
que
muchas
miosinas
no
convencionales
se
encuentran solubles en el citoplasma de las células y se les atribuye función de transporte intracelular. Otras proteínas se encuentran solubles en determinados momentos y se agregan en filamentos en circunstancias que las células necesitan de la tracción de estas proteínas motoras. Por lo tanto en el próximo capítulo analizaremos la característica de miosina-CMP en las células mioides peritubulares en desarrollo y adultas
en
distintos
tramos
del
túbulo
seminífero.
Además
relacionaremos la expresión de isotipos de miosina-CMP con la morfología de las células MP tanto en reposo como en contracción.
_____________________________________________________________________ Resultados
75
CAPÍTULO III CARACTERÍSTICAS DE LAS CÉLULAS MIOIDES PERITUBULARES DEL TESTÍCULO
Capítulo III. Características de las células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
CARACTERÍSTICAS DE LAS CÉLULAS MIOIDES PERITUBULARES DEL TESTÍCULO Introducción: Se
ha
comprobado
que
las
células
mioides
peritubulares
contienen miosina-CMP que se encuentra soluble en el citoplasma (datos presentados en el Capitulo II ). Debido a ello nos preguntamos si miosina-CMP participa activamente en el proceso de contracción. En este capítulo se describe un método de tinción útil para medir los parámetros de las células MP. Se determinan las dimensiones y radios de las células MP en túbulos seminíferos aislados tanto en reposo como contraídos, y se determina el estado de agregación de miosina-CMP en túbulos seminíferos contraídos.
1. IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS MIOIDES PERITUBULARES EN TÚBULOS SEMINÍFEROS AISLADOS 1.1. Tinción con nitrato de plata Rutinariamente, para observar las células MP en los TS se utiliza microscopía electrónica de Barrido (Palombi y col. 1992). Esta técnica, es laboriosa y permite la visualización de porciones discretas de los segmentos. Debido
a
que
necesitábamos
analizar
las
células
MP
en
segmentos completos de TS utilizamos la técnica de tinción con nitrato de plata, que nos permitió analizar en forma sencilla gran número de células MP. _____________________________________________________________________ Resultados
77
Capítulo III. Características de las células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
El fundamento de esta técnica es que al incubar los TS con una solución de nitrato de plata (AgNO3), el ion plata (Ag+) se deposita sobre los carbohidratos de las uniones estrechas de las células MP (comunicación personal de JC Cavicchia). Luego al incubar los TS con la solución reductora,
se reduce Ag+ a Ag0,
produciéndose un fino
precipitado de plata metálica de color marrón en los bordes de las células MP. Como se puede observar en la figura III.1B la tinción permitió identificar el límite de las células MP con muchos detalles, similares a los mostrados por el método de microscopio electrónico de barrido (figura III.1A). Es decir, por ambas técnicas se identifican las células MP,
con su aspecto
de mosaico y con las uniones
intercelulares definidas. (Palombi y col. 1992; Chiarenza y col. 2000). Debido a que la técnica de tinción con plata es sencilla nos permitió analizar los parámetros de un gran número de las células MP de los TS aislados.
_____________________________________________________________________ Resultados
78
Capítulo III. Características de las células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
Figura III.1. Detalles de la pared del túbulo seminífero: A: Microscopía electrónica de barrido. B: Tinción con nitrato de plata.
1.2. Contracción de las células mioides peritubulares Se conoce que las células MP tienen la posibilidad de contraerse por acción de hormonas tales como, oxitocina, angiotensina II y Endotelina I (ET-1) (Tripiciano y col. 1996; Tripiciano y col. 1997).
Figura III.2. Túbulo seminífero estimulado con Endotelina-1. La flecha negra indica las células contraídas por endotelina-1 y las flechas blancas los espermatozoides expulsados.
Debido a que ET-1 es una hormona secretada por las células de Sértoli, consideramos que era útil para analizar los parámetros de contracción de las células MP en TS aislados. Para ello los TS del testículo de rata de 90 días fueron aislados en medio MEM a 32oC, una fracción fue usada como control y la otra tratada con 50 nM de ET-1 _____________________________________________________________________ Resultados
79
Capítulo III. Características de las células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
por 20 segundos. Los
TS fueron fijados con 3% de glutaraldehído
y
teñidos con nitrato de plata. Al observar en la lupa los TS tratados con ET-1 se comprobó que presentaban un movimiento ondulatorio y expulsaban espermatozoides por los extremos. (Figura III.2), signos que indican que ET-1 produce la contracción del TS.
Figura III.3. Túbulos seminíferos teñidos con nitrato de plata. Túbulos seminíferos de ratas 90 días. A. Control; B. Tratados con 50 nM de ET-1 por 20 seguntos.
1.2.1. Diámetro de los túbulos seminíferos y tamaño de las células mioides peritubulares El diámetro del TS control fue de 235.25 ± 6.19 µm, mientras que el de los TS tratados con ET-1 presentó segmentos de 200.83 ± 5.13 µm y de 251.67 ± 7.89 µm. (Figura III.4).
_____________________________________________________________________ Resultados
80
Capítulo III. Características de las células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
La superficie de las células MP de los TS controles fue de 810.48 ± 185.8 µm2 y el de la las células de TS tratados 539.36 ± 144.7 µm2 (figura III.5). El largo del eje x e y de las células MP controles fue de 34.79 ± 5 µm y 26.1 ± 5.5 µm respectivamente. Mientras que el eje x e y de las células MP de TS tratados fue de 28.15 ± 3.5 µm y 26.7 ± 4.5 µm respectivamente (Figura III.5). Para poder interpretar en que forma se contraen las células MP, calculamos la relación entre los ejes x e y antes y después de la contracción. Las mediciones mostraron una relación x/y de 1.24 en el control y de 0.84 en el tratado. Estos resultados indican que las células MP al contraerse, mayormente reducen el eje x, es decir aquel longitudinal al eje mayor del TS.
Figura III.4. Diámetro de los túbulos seminíferos. A: controles y B: tratados con ET-1.
_____________________________________________________________________ Resultados
81
Capítulo III. Características de las células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
Figura III.5. Tamaño de las células mioides peritubulares. A. Célula de TS control. B. Células de TS tratado con ET-1.C. Superposición de la figura A sobre la B
_____________________________________________________________________ Resultados
82
Capítulo III. Características de las células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
2. GRADO DE AGREGACIÓN DE MIOSINA-CMP 2.1. Efecto de endotelina-1 En el capítulo II se mostró que miosina-CMP de las células MP, es un isotipo de miosina de músculo liso que tiene la particularidad de ser soluble en soluciones con fuerza iónica similar a la fisiológica (50100 mM de NaCl). Además se mostró que miosina-CMP se ensamblaba en filamentos a 37 °C. Debido
a
que
miosina-CMP,
bajo
ciertas
condiciones,
se
ensambla in vitro a 37 °C, pensamos que podría participar en la contracción de las células MP. Como ya se mostró arriba, ET-1 produce la contracción de cada célula MP del TS. Para analizar la distribución de miosina-CMP,
túbulos
seminíferos
incubados
con
ET-1,
por
20
segundos, fueron inmediatamente homogeneizados y analizados para determinar la distribución de miosina-CMP en el sobrenadante y sedimento. En TS controles (no tratados con ET-1) 85 ± 5% de miosinaCMP se encuentra soluble, mientras que en los TS contraídos con ET-1, solo el 40 ± 6 % queda en el sobrenadante. (Ver figura III.6). De estos
resultados
se
desprende
que
miosina-CMP
es
capaz
de
ensamblarse en filamentos cuando la célula MP se contrae.
_____________________________________________________________________ Resultados
83
Capítulo III. Características de las células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
Figura III.6. Agregación de miosina-CMP por ET-1. Miosina-CMP en sobrenadante y sedimento de túbulos seminíferos controles (A) y tratados con 50 nM de ET-1 por 20 segundos (B), purificada por el método agregacióndesagregación. 3 µg de sobrenadante y 8 µg del sedimento fueron analizados por SDS-PAGE al 7.5% y teñido con azul de coomassie de. La intensidad de las bandas proteicas se analizó con el software Scion Image.
_____________________________________________________________________ Resultados
84
Capítulo III. Características de las células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________
3. DISCUSIÓN DEL CAPÍTULO III Los resultados presentados en este capítulo indican que se desarrolló una técnica sencilla de tinción con nitrato de plata, que permitió determinar las características morfológicas de las células MP en la pared del TS. Asimismo, por el tratamiento con ET-1 se logró, a juzgar por el movimiento de los TS y por la expulsión de espermatozoides, la contracción de los TS aislados. La tinción de los TS con nitrato de plata permitió dilucidar claramente el límite de cada célula MP y determinar sus dimensiones. Se comprobó que las células MP tienen una superficie de alrededor 810 µm2 que se reduce un 33,5 % por acción de ET-1. El eje x de las células MP es de alrededor 34 µm y se reduce en 9 µm por el efecto de ET-1, mientras que el eje y de las células MP es de alrededor 26 µm y no cambia por acción de ET-1; indicando que la célula se contrae acortando el eje x. El acortamiento del eje x podría inducir un incremento del diámetro del TS, que podría justificar el hallazgo experimental de encontrar sectores de TS tratados con ET-1 con un diámetro mayor al del control. El análisis del grado la distribución de miosina-CMP entre soluble y agregada permitió comprobar que una significativa cantidad de miosina-CMP se agrega en filamentos cuando los TS se contraen, lo que indica que miosina-CMP participa activamente en la contracción de las células MP.
_____________________________________________________________________ Resultados
85
CAPÍTULO IV ACTIVIDAD DE LAS CÉLULAS MIOIDES PERITUBULARES RELACIONADA CON EL EPITELIO SEMINIFERO
Capítulo IV. Actividad de las células mioides peritubulares relacionada con el epitelio seminífero _____________________________________________________________________
ACTIVIDAD
DE
LAS
CÉLULAS
MIOIDES
PERITUBULARES
RELACIONADA CON EL EPITELIO SEMINIFERO Introducción: Ya se ha mostrado en este trabajo que las células MP tienen un tipo particular de miosina que denominamos miosina-CMP. MiosinaCMP se encuentra soluble en el citoplasma y es capaz de formar filamentos en el momento que las células MP se contraen. Además se ha desarrollado un método para identificar las células MP en los TS, tinción con plata, que permite el análisis morfométrico de un gran número de células. En este capítulo se analizan las características morfológicas de las células MP y la expresión de isotipos de miosina-CMP en los TS del testículo en desarrollo y en los segmentos del TS relacionados con los estados del epitelio seminífero del testículo de rata adulta. 1. DESARROLLO DEL TÚBULO SEMINÍFERO Y DE LAS CÉLULAS MIOIDES QUE LO RODEAN Desde el primer día de nacimiento, los TS del testículo comienzan
a
madurar
y
van
cambiando
su
morfología.
Nos
preguntamos en que momento comienzan a tener capacidad de contraerse, como es la morfología de las células MP y que isotipos de miosina-CMP expresan. 1.1. Diámetro del túbulo seminífero de testículos en desarrollo En los primeros días postnatal (pn), el testículo presenta esbozos de los TS, pero en realidad son cordones sólidos. Recién en el _____________________________________________________________________ Resultados
87
Capítulo IV. Actividad de las células mioides peritubulares relacionada con el epitelio seminífero _____________________________________________________________________
día 10 pn, algunos cordones muestran lumen y recién en el día 30 pn todos los túbulos presentan lumen. (Ver capitulo I). Se ha comprobado que el diámetro del TS va creciendo sostenidamente desde el nacimiento hasta día 40 pn (capítulo I). Mediciones propias nos indican la dinámica de crecimiento de los TS en los primeros 30 días pn. Como la figura IV.1 lo indica desde el día 14 pn al 18 pn el diámetro crece de 60 a 120 µm, luego del día 18 al 24 pn, crece solo de 120 µm a 150 µm, retomando luego el ritmo de crecimiento de los primeros días desde el día 24 pn hasta el 30 pn.
Figura IV.1. Diámetro de los túbulos seminíferos de ratas en desarrollo. Se determinó
el
diámetro
de
los
túbulos
seminíferos
en
cortes
_____________________________________________________________________ Resultados
88
Capítulo IV. Actividad de las células mioides peritubulares relacionada con el epitelio seminífero _____________________________________________________________________
histológicos de testículos de rata. Los datos son el valor medio ± SEM de tres ratas.
1.2. Caracteres morfológicos de las células-MP en túbulos seminíferos en desarrollo Analizamos las células MP en los primeros días de desarrollo postnatal, en el día 16 pn las células muestran una superficie de 136,2 µm2 con un diámetro en el eje x de 10,6 µm y en el y de 12,1 µm. En el día 20 pn la superficie de las células MP ya es de 412,9 µm2 siendo el diámetro del eje x e y de 19,2 µm y 21,5 µm respectivamente. Además en el día 30 pn el área de las células MP es de 481,6 µm2 y el diámetro en el eje x e y es 22,7 µm y 23,0 µm respectivamente. (Figura IV.2 y tabla IV.1)
_____________________________________________________________________ Resultados
89
Capítulo IV. Actividad de las células mioides peritubulares relacionada con el epitelio seminífero _____________________________________________________________________
FIGURA IV.2. Túbulos seminíferos de ratas en desarrollo. Tinción con nitrato de plata. A-B de 16 días control y tratados. C-D de 20 días control y tratado y E-F de 30 días control y tratado. Las barras indican 200 µm.
_____________________________________________________________________ Resultados
90
Capítulo IV. Actividad de las células mioides peritubulares relacionada con el epitelio seminífero _____________________________________________________________________
TABLA IV.1. Área y diámetros de las células MP en ratas en desarrollo AREA
Diámetro (x)
Diámetro (y)
(µm2 ±ESM)
(µm ±ESM)
(µm ±ESM)
EDAD (días pn)
control
tratado
control
tratado
control
tratado
16
136,2
139,1
10,6
11,9
12,1
11,7
±10,2
±8,5
±0,5
±0,3
±0,14
±0,61
412,9
220,3
19,2
14,3
21,5
16,6
±10,1
±11,1
±0,35
±0,71
±0,12
±0,21
20
** 30
**
**
481,6
343,6
22,7
19,3
23,0
18,5
±24,1
±18,4
±1,5
±1,4
±2,2
±1,4
**
**
**
** p < 0,01
Nos preguntamos si las células MP en los primeros días de desarrollo postnatal responden al tratamiento con ET-1. Como se puede observar en la figura IV y tabla IV.1, ET-1 no indujo cambios ni el área ni en los diámetros de los x e y en las células de 16 días pn. En cambio ET-1 produjo una reducción del alrededor del 50 % del área de las células del día 20 pn y una significativa disminución del diámetro del los dos ejes (x, y). Además ET-1 en células de 30 días pn produjo una reducción de alrededor del 30 % en el área y una significativa reducción en el diámetro solo del eje y.
_____________________________________________________________________ Resultados
91
Capítulo IV. Actividad de las células mioides peritubulares relacionada con el epitelio seminífero _____________________________________________________________________
1.3. Isotipos de miosina-CMP en las células mioides peritubulares en desarrollo Si se analiza la movilidad electroforética de miosina-CMP proveniente de testículos de rata adulta, en geles de 4,5 %,
se
detectan dos bandas de 205 y 200 kDa que denominamos isotipos de miosina-CMP A y B respectivamente. Las dos bandas son reconocidas por los anticuerpos anti-miosina de músculo liso. Comprobamos que en el testículo adulto, el 40 % de miosina-CMP es del isotipo A y 60 % del isotipo B. (Figura IV.3).
Figura IV. 3. Isotipos de miosina-CMP en testículo de rata adulta. Gel SDS-PAGE al 4,5 %, teñido con azul de coomasie.
Se analizó la expresión de los isotipos A y B de miosina-CMP en túbulos seminíferos de testículo de rata en desarrollo. Para ello se purificó miosina-CMP de testículos de rata de 12 a 43 días de edad y cada muestra se analizó por electroforesis. Los resultados indican que en los túbulos seminíferos de ratas desde el día 12 de edad van expresando más cantidad del isotipo B
_____________________________________________________________________ Resultados
92
Capítulo IV. Actividad de las células mioides peritubulares relacionada con el epitelio seminífero _____________________________________________________________________
que del A hasta llegar al día 27 donde expresan 70 % del isotipo B y solo 30 % del A (Figuras IV.4 y 5).
Figura IV.4. Isotipos miosina-CMP A y B de túbulos seminíferos de ratas en desarrollo (12-43 días de nacimiento). SDS-PAGE al 4,5 % teñido con azul de coomassie. Se muestra un experimento típico.
Llamativamente, desde el día 27 pn comienza a decrecer la expresión del isotipo B y por ende a expresarse el A, llegando al día 35 donde se expresan ambos isotipos en el mismo porcentaje, 50 %. Luego desde el día 35 pn, nuevamente comienza a expresarse mayor cantidad del isotipo B, 60%, manteniéndose esa relación hasta los túbulos seminíferos de los testículos de rata adulta.
_____________________________________________________________________ Resultados
93
Capítulo IV. Actividad de las células mioides peritubulares relacionada con el epitelio seminífero _____________________________________________________________________
Figura IV.5. Distribución relativa de los isotipos A y B de miosina-CMP en túbulos seminíferos en desarrollo. Isotipo de miosina-CMP A (azul) y B (marrón). Días pn: 1. 16; 2. 21; 3. 27; 4. 29; 5. 35 y 6. 43. Se muestra el valor medio ± SEM de tres experimentos.
2. CARACTERÍSTICAS DE LA CONTRACCIÓN DE LOS SEGMENTOS DEL EPITELIO SEMINÍFERO Y DE LAS CÉLULAS MIOIDES QUE LO RODEAN Debido a que cada segmento del TS contiene un estadio específico del epitelio germinal (ver capítulo I), nos preguntamos si estos segmentos presentaban características propias. Se seleccionaron por transparencia bajo lupa tres segmentos de TS, el que contenía mayor cantidad de espermatozoides, segmento _____________________________________________________________________ Resultados
94
Capítulo IV. Actividad de las células mioides peritubulares relacionada con el epitelio seminífero _____________________________________________________________________
VII-VIII;
el
segmento
inmediato
al
VII-VIII
que
no
contenía
espermatozoides, segmento IX-XIV; y el inmediato al segmento VIIVIII que contenía relativa cantidad de espermatozoides, segmento IVI. Cada segmento fue tratado con y sin ET-1 y fue analizado el diámetro del TS, la morfología de las células MP y la expresión de isotipos de miosina-CMP. 2.1 Diámetro de distintos segmentos de túbulos seminíferos El diámetro del segmento I-VI fue de alrededor 230 µm y por el tratamiento con endotelina incrementó su diámetro a 250 µm. El segmento IX-XIV tiene un diámetro de 200 µm y por el tratamiento con ET-1
no sufre ningún aumento significativo en su diámetro. En
cambio el segmento VII-VIII con un diámetro de 200 µm
cambió a
uno de 280 µm por el tratamiento con ET-1. (Figuras IV.6 y 7).
_____________________________________________________________________ Resultados
95
Capítulo IV. Actividad de las células mioides peritubulares relacionada con el epitelio seminífero _____________________________________________________________________
Figura IV.6. Diámetro de distintos segmentos del túbulos seminífero. Se midieron los segmentos I-VI, VII-VIII y IX-XIV antes (controles) y después del tratamiento con ET-1 (tratados). Se muestra el valor medio ± SEM de tres experimentos.
2.2 Morfología de las células mioides peritubulares en los distintos segmentos del túbulo seminífero Se determinó el área y los diámetros de los ejes x e y de las células MP de los tres segmentos del TS. El área de las células MP del segmento I-VI fue de 1141 µm2 y por el tratamiento con endotelina-1 (ET-1) se redujo a 995 µm2
_____________________________________________________________________ Resultados
96
Capítulo IV. Actividad de las células mioides peritubulares relacionada con el epitelio seminífero _____________________________________________________________________
produciendo un cambio del 12,8 %. El diámetro en los ejes x-y fueron de 38,9 µm -31,7 µm respectivamente y después del tratamiento con ET-1 34,1 µm -31,1 µm respectivamente
mostrando una reducción
significativa en diámetro del eje x. (Figura IV.7 y tabla IV.2)
Figura IV.7. Túbulos seminíferos en estadíos I –VI. Tinción con plata. A: Control, B: Tratado con ET-1 durante 20 segundos.
El área de las células MP del segmento VII-VIII fue de 964 µm2 y por el tratamiento con ET-1 se redujo a 769 µm2 produciendo un cambio del 20,2 %. El diámetro en los ejes x-y fueron de 35,9 µm 30,3 µm respectivamente y después del tratamiento con ET-1 28,3 µm - 30,0 µm respectivamente mostrando una reducción significativa solo en el diámetro del eje x. (Figura IV.8 y tabla IV.2).
_____________________________________________________________________ Resultados
97
Capítulo IV. Actividad de las células mioides peritubulares relacionada con el epitelio seminífero _____________________________________________________________________
Figura: IV.8. Túbulos seminíferos en estadío VII-VIII. Tinción con plata. A: Control, B: Tratado con ET-1 durante 20 segundos.
Mientras que las células MP del segmento IX-XIV tienen un área 938 µm2
que no se modifico por el tratamiento con E-1. Por
consiguiente no se modificaron el diámetro en el eje x e y que fue de 34,8 µm y 29,5 µm respectivamente. (Figura IV.9 y tabla IV.2)
Figura IV.9. Túbulos seminíferos en estadío IX-XIV. Tinción con plata. A: Control, B: Tratado con ET-1 durante 20 segundos.
_____________________________________________________________________ Resultados
98
Capítulo IV. Actividad de las células mioides peritubulares relacionada con el epitelio seminífero _____________________________________________________________________
Tabla IV.2. Áreas y diámetros de las células MP en el estadío I-VI, VIIVIII y IX-XIV. AREA
Diámetro (x)
Diámetro (y)
(µm2 ±ESM)
(µm ±ESM)
(µm ±ESM)
ESTADIOS
control
tratado
control
tratado
control
tratado
I-VI
1141,2
995,3
38,9
34,1
31,7
31,1
±55,1
±67,2
±0,8
±0,9
±0,8
±0,9
** VII-VIII
**
964,9
769,7
35,9
28,3
30,3
30,0
±59,1
±81,2
±0,8
±1,6
±1,2
±0,7
** IX-XIV
**
938,9
970,2
34,8
35,3
29,5
29,8
±64,3
±67,2
±0,9
±0,8
±0,7
±0,8
** p < 0,01 2.3. Isotipos de miosina-CMP en los distintos segmentos del túbulo seminífero En los tres segmentos del TS se purificó miosina-CMP y se analizó el grado de expresión de los isotipos A y B. Como ya se había mostrado en la figura IV.3 en las células MP del conjunto de los TS del testículo adulto se expresan 40 % del isotipo A y 60 % del isotipo B. Cuando se analiza la expresión de los isotipos A y en el segmento I-VI de los TS se observa que la expresión es 40 % de A y 60 % de B y la misma expresión se encuentra en el segmento IX-XIV. Mientras que en el estadio VII-VIII se expresa 75 % del A y solo 25 % del B. De estos resultados se desprende que hay
_____________________________________________________________________ Resultados
99
Capítulo IV. Actividad de las células mioides peritubulares relacionada con el epitelio seminífero _____________________________________________________________________
preponderancia en la expresión del isotipo B en el segmento IX-XIV del TS.
Figura IV.10. Distribución relativa de los isotipos de miosina-CMP en segmentos de túbulos seminíferos. Isotipos de miosina-CMP A (azul) y B (rojo) en los segmentos del túbulo seminífero conteniendo los estados I-VI, VII-VIII y IX-XIV del epitelio seminífero y en el túbulo seminífero entero, control. Se muestra el valor medio ± S.E.M de tres experimentos. Inserto en la parte superior de la figura se muestra un ejemplo típico de las bandas A y B de miosina-CMP en los tres segmento del túbulo seminífero y en el control. Tinción con azul de coomassie.
_____________________________________________________________________ Resultados
100
Capítulo IV. Actividad de las células mioides peritubulares relacionada con el epitelio seminífero _____________________________________________________________________
3. DISCUSIÓN DEL CAPITULO IV Los resultados presentados indican que los TS presentan desde el día 14 pn un marcado crecimiento en diámetro que se mantiene hasta el día 18 pn, luego se aprecia un enlentecimiento en el ritmo de crecimiento hasta el día 18, donde comienza a crecer en forma sostenida. Durante el desarrollo del TS las células MP presentan cambios notables. A los 16 días pn las células MP tienen un diámetro de 136 µm2 que se incrementa a 412 µm2 en el día 20 pn. Además desde el día 20 pn las células MP manifiestan la capacidad de contraerse por estímulo con ET-1. Junto con el cambio morfológico de las células MP y su capacidad de contraerse se aprecian cambios en la expresión de los isotipos de miosina-CMP. En el día 16 pn se manifiesta el 40 % del isotipo A y 60 % del isotipo B. Mientras que en el día 21 pn se observa incremento en la expresión del isotipo B, 65%, y en el día 27 pn al valor máximo de 70%. En una segunda parte de éste capítulo se muestra que las células MP de los distintos segmentos del TS presentan características propias. Las células MP del segmento I-VI son de mayor área y se reducen un 12 % al contraerse. Las células MP del segmento VII-VIII se contraen fuertemente y reducen su área un 20 %. En cambio las
_____________________________________________________________________ Resultados
101
Capítulo IV. Actividad de las células mioides peritubulares relacionada con el epitelio seminífero _____________________________________________________________________
células MP del segmneto IX-XIV no cambian su área al ser estimuladas a contraerse, interpretándose que no se contraen. Miosina–CMP además presenta particularidades de expresión en las distintas porciones del TS. En el segmento I-VI 40 % corresponde al isotipo A y 60% al isotipo B, mientras que en el segmento VII-VIII, 25 % corresponde al isotipo A y 75 % corresponde al isotipo B. En el segmento IX-XIV se restablece la proporción 40 % isotipo A, 60 % isotipo B. Es interesante destacar que la expresión del isotipo B de miosina-CMP está relacionada con la mayor actividad de contracción de las células MP tanto en el desarrollo como en el testículo adulto.
_____________________________________________________________________ Resultados
102
CAPÍTULO V DISCUSIÓN GENERAL Y CONCLUSIONES
Discusión General _____________________________________________________________________
DISCUSION GENERAL Y CONCLUSIONES 1. Características de miosina-CMP En este trabajo se muestra que una proteína de testículo de rata que denominamos miosina-CMP tiene movilidad electroforética de 205 kDa (cadena pesada) y de 22 y 17 kDa (cadenas livianas), presenta características que la permiten clasificar dentro de la familia de las miosinas. La cadena pesada presenta una secuencia de aminoácidos con parcial homología a
la cadena pesada de miosina II de músculo
liso y además es reconocida con anticuerpos monoclonales antimiosina II de músculo liso. El perfil de péptidos de la cadena pesada presenta diferencias con miosina II de la arteria espermática y de la túnica albugínea. Miosina-CMP se encuentra en las células MP de los TS del testículo de rata, basándonos en los siguientes criterios. Se aísla de las células que revisten
los TS y la remoción de dichas células deja
desprovisto al TS de miosina-CMP. El 90 % de miosina-CMP se encuentra soluble (sin formar filamentos) en el citoplasma celular. Este comportamiento se puso en evidencia
al
recuperar
miosina-CMP
en
el
sobrenadante
de
homogeneizados de TS con soluciones de baja fuerza iónica. Miosina-CMP, en medios de baja fuerza iónica, permanece soluble a 4°C y se agrega y forma filamentos a 20 °C.
_____________________________________________________________________ Discusión
104
Discusión General _____________________________________________________________________
Los filamentos formados in vitro de miosina-CMP tienen la misma estabilidad a fuerza iónica que los filamentos de miosina II de músculo liso, pero mayor labilidad a ATP. De los resultados detallados arriba llama la atención el siguiente hecho, miosina-CMP presenta muchas de las características de la familia de moléculas de miosina II de músculo liso, excepto que se encuentra soluble en el citosol de las células y no forma filamentos in vitro a 4°C. En principio, el comportamiento de miosina-CMP puede atribuirse a algunas de las siguientes razones: Desfosforilación de sitios de las cadenas livianas o fosforilación de sitios de la cadena pesada. Falta de dominios peptídicos en el extremo carboxilo terminal. Desfosforilación de la cadena liviana. Las moléculas de miosina II de músculo liso deben mantenerse fosforiladas para ensamblarse en filamentos. La falta de fosforilaciones hace soluble a las moléculas de miosina. (Ver Capitulo I sección 2.3.2). Fosforilación de las cadenas pesadas. Se ha comprobado que en las células no musculares, en ciertas circunstancias, miosina II se solubiliza por la fosforilación de la cadena pesas (ver Capitulo I sección 2.3.3) y una ulterior defosforilación
permite que forme filamentos
nuevamente. Dominios peptídicos.
Hodge y col. 1992, han propuesto que la
función de la porción no helicolidal de la cola de miosina II es la de promover o potenciar el ensamble mediante la unión a sitios
_____________________________________________________________________ Discusión
105
Discusión General _____________________________________________________________________
específicos de las moléculas vecinas. La ausencia o mutación de esta pieza provoca la acumulación de una conformación intermedia que no es apta para el ensamble en filamentos. En base al comportamiento de otras miosinas II en los sistemas descriptos, se puede interpretar que miosina-CMP en el citoplasma de las células MP tiene desfosforilada la cadena liviana o fosforilada la cadena pesada, de tal modo que se mantiene soluble. Si tenemos en cuenta el comportamiento de miosina-CMP in vitro, que
a 4° C está soluble, mientras que a 20° C se agrega, sin
que medien reacciones de fosforilación/desfosforilación, nos lleva a considerar poco probables las hipótesis anteriores
y plantear que
miosina-CMP carece de dominios de ensamble o que no están expuestos. Es de destacar, por la
que el cambio de solubilidad de miosina-CMP
temperatura sólo se produce in vitro, y es probable que esté
reflejando un comportamiento que se repite en el citoplasma celular activado por otros factores, tales como proteínas. Se conocen proteínas como “kinase-related protein ” (KPR), telokin y proteína de 38 kDa que confieren estabilidad a miosina II en condiciones donde la concentración de ATP es elevada y los niveles de fosforilación de las cadenas livianas es escasa ,(Shirinsky y col., 1993; Okagaki
y
col.,
2000).
KRP
previene
que
miosina
II
adopte
conformación 10 S porque compite con al región de miosina II donde la cola se pliega (Olney y col., 1996; Silver y col., 1997).
_____________________________________________________________________ Discusión
106
Discusión General _____________________________________________________________________
¿ Forma miosina-CMP filamentos en las células mioides perituburales?. Una vez que comprobamos que la proteína soluble miosina-CMP proviene de las células MP, que es un isotipo de miosina II de músculo liso, que presenta mayor solubilidad in vitro, que se ensambla in vitro en filamentos por tratamiento térmico, nos preguntamos si miosinaCMP en el citoplasma de la célula se ensambla y participa en la contracción de la célula. Para contestar esta pregunta era necesario contar con un método sencillo y reproducible que nos permitiera observar y medir las células MP en la pared de los TS para corroborar su contracción. El intercambio de ideas con el Dr. Juan C. Cavicchia nos llevó a ensayar con la tinción con plata de los TS. De esta manera se puso a punto un método que nos permitió en pocos minutos observar en lupa estereoscópica las células MP con todos sus detalles. El primer paso fue analizar in vitro la contracción del TS con ET1, una hormona que participa activamente en el testículo en la contracción del TS. (Fantoni y col. 1993). Utilizando ET-1 en segmentos aislados de TS, se observó
que
producía la expulsión de espermatozoides por los extremos y cambios en la sección de los TS. El TS en conjunto presentó un diámetro de 235 µm y cuando se lo trató con ET-1, ciertos segmentos presentaron un diámetro significativamente mayor, 251 µm. Las mediciones morfológicas de las células MP
en el testículo
adulto indicaron que tienen el aspecto hexagonal con un área de 810
_____________________________________________________________________ Discusión
107
Discusión General _____________________________________________________________________
µm2 que se reduce a 539 µm2 por el tratamiento con ET-1. Presenta un eje x (longitudinal al eje mayor del TS) de 34 µm que es mayor al eje y (perpendicular al eje mayor del TS) de 28 µm.
Sólo
en
los
segmentos donde el TS aumenta de diámetro se observaron células MP con cambios morfológicos. Nos llamó la atención que en la contracción de la célula MP, el eje x es el que se reduce, mientras que el eje y no cambia, indicando que las células MP presentan una organización del citoesqueleto que le permite contraerse en forma anisodiamétrica. Habiendo comprobado en forma morfológica la contracción de las células MP, nos preguntamos si miosina-CMP participa en el mecanismo de contracción. Para ello, a TS aislados antes y después de la contracción se les analizó la distribución de miosina-CMP. Se comprobó que durante la contracción de las células MP, una significante cantidad de miosina-CMP faltaba en el sobrenadante y se encontraba agregada como filamentos, interpretándose que miosinaCMP participa activamente en la contracción de las células. De estos resultados se infiere que miosina-CMP participa dentro de la célula en el sistema contráctil. Se encuentra soluble cuando está inactiva, forma filamentos en respuesta a un estímulo y vuelve a solubilizarse después de la contracción. Existen antecedentes relacionados con un estado cíclico de solubilidad de miosina en las células. Las células en división, disponen de un mecanismo por el cuál solubilizan miosina II citoplasmática, la trasladan, la ensamblan en filamentos y forman el anillo contráctil de
_____________________________________________________________________ Discusión
108
Discusión General _____________________________________________________________________
la citocinesis. Este es un modelo de desensamble-ensamble llevado a cabo por la fosforilación-desfosforilación de la cadena pesada de miosina II. (Burgess, 2005) En células satélites del hígado, que participan en la contracción de los sinusoiedes hepáticos, la fosforilación de las cadenas livianas de miosina II induce la formación de filamentos en el momento de la contracción. Este modelo de desensamble-ensamble de miosina II es llevado a cabo por la desfosforilación-fosforilación de las cadenas livianas (Saab y col. 2002). Volviendo a miosina-CMP en las células MP, de acuerdo a los resultados obtenidos in vitro, no sería el estado de fosforilación el que determina la solubilidad de miosina-CMP, sino proteínas que facilitarían el ensamble de la proteína en filamentos, por lo tanto miosina-CMP alternaría entre el estado soluble o agregado dependiendo de proteínas que estabilizaran la unión entre miosinas. ¿Cual es la ventaja de disponer de un sistema de ensambledesensamble de miosina? Las moléculas de miosina son verdaderos motores celulares que generan
la tracción mecánica de la célula. En
las células del músculo estriado y cardíaco las moléculas de miosina son parte de la unidad de contracción, el sarcómero, en forma de filamentos gruesos constituidos cada uno por mas de 50 moléculas de miosina, que generan contracción al desplazar los microfilamentos. Tanto
en
las
células
de
músculo
estriado
como
cardíaco,
los
sarcómeros permanecen armados toda la vida de la célula, que en
_____________________________________________________________________ Discusión
109
Discusión General _____________________________________________________________________
muchos casos coincide con la vida del organismo (Landsverk y Epstein. 2005). En cambio, en las células de músculo liso, la unidad de contracción es más laxa, aunque los filamentos de miosina se mantienen armados durante toda la vida de la célula Landsverk y Epstein. 2005.) En las células no musculares, miosina sigue siendo la unidad de contracción, pero la organización de los filamentos de miosina es temporal y depende de la actividad de la célula. De esa manera, cuando una célula se desplaza sobre un sustrato, continuamente esta reorganizando los filamentos de miosina y de actina, y en muchos casos las moléculas de miosinas cambian de estado, de solubles pasan a formar filamentos y luego a ser solubles nuevamente (Conrad y col. 1995). Las células MP presentan características de células de músculo liso, pero de acuerdo a nuestros resultados miosina-CMP, que es la principal proteína con característica de miosina que presenta la célula, se mantiene soluble y solo se ensambla en filamentos por el estímulo de la contracción. En este aspecto miosina-CMP se comporta como una miosina de células no musculares, y podría estar indicando la plasticidad que presenta el citoesqueleto para cambiar en cada instante la forma de la célula MP. El hecho de que hemos encontrado células MP con distinta morfología en los segmentos del TS con diferentes estados del epitelio
_____________________________________________________________________ Discusión
110
Discusión General _____________________________________________________________________
seminífero
podría
confirmar
la
hipótesis
de
un
citoesqueleto
sumamente dinámico. 2. Contracción de las células MP y expresión de isotipos de miosina-CMP En el desarrollo del testículo. En el testículo de rata miosina-CMP se expresa en gran cantidad en las células MP y participa en la contracción de las mismas provocando la reducción del área celular y modificando la forma de la célula (se reduce en mayor proporción el eje x). Cuándo se analiza la movilidad electroforética de la cadena pesada de miosina-CMP se observan dos bandas que corresponden al isotipo A (205 kDa) y B (200 kDa). Desde el momento del nacimiento el TS presenta profundos cambios morfológicos, primero aparece el lumen y luego va creciendo en diámetro y longitud (Ver CAPII). Observamos que los TS, desde el día 14 pn al día 18, duplican el diámetro, luego desde el día 18 pn al 24 el crecimiento en diámetro se enlentese y nuevamente retoma el ritmo de crecimiento en el día 24 pn. De la misma manera las células MP en los TS aumentan tres veces el área desde el día 16 pn al 20 pero luego conservan las mismas dimensiones hasta el día 30 pn. Con respecto a miosina-CMP,
Las células MP del día 16 pn
expresan 40 % del isotipo A y 60 % del isotipo B. Luego las células del
_____________________________________________________________________ Discusión
111
Discusión General _____________________________________________________________________
día 21 pn al día 24 van expresando mayor cantidad del isotipo B, llegando al día 24 pn a expresar el 70 %. Es
conocido
que
las
células
MP
comienzan
a
producen
microfilamentos circulares del citoesqueleto desde el día 16 pn y en el día 30 pn aparecer en adición a los circulares, haces que corren longitudinales al eje mayor del TS. (Ver Cap. I Sección 1.1.5). Por lo tanto en este período 16-20 días pn, donde las células MP cambian significativamente el área el citoesqueleto de actina se reorganiza profundamente de la misma forma que se incrementa la expresión del isotipo B de miosina-CMP. Concomitantemente con la reorganización del citoesqueleto, las células MP comienzan a tener una marcada actividad contráctil que se pone de manifiesto el día 20 pn. ¿Es necesaria la expresión elevada del isotipo B de miosina-CMP para que la célula se contraiga apropiadamente? Es conocido que dos isotipos de la cadena pesada de miosina II de músculo liso se encuentran en las células de músculo liso y son conocidos como SM1 (204 kDa) y SM2 (200 kDa). SM1 presenta un extremo C-terminal con 9 aminócidos más que SM2. En la rata, SM2 aparece mas tarde en el desarrollo embrionario y es expresado a elevados niveles en células diferenciadas de músculo liso. (Nagai R y col. 1989; Loukianov y col. 1997). Debido a los antecedentes descriptos y teniendo en cuenta que SM2 es equivalente al isotipo B de miosina-CMP, podemos inferir que
_____________________________________________________________________ Discusión
112
Discusión General _____________________________________________________________________
en el desarrollo postnacimiento de las células MP, el isotipo B de miosina-CMP se expresa en el momento de mayor diferenciación de las células MP y es posible que sea fundamental para el desarrollo morfológico y contráctil de la célula. En los segmentos del túbulo seminífero conteniendo las células del ciclo espermatogénico. Hemos comprobado que en el testículo de rata adulta la dinámica de contracción de los segmentos del TS está relaciona a los estados del epitelio seminífero que contienen. Así, en el segmento I-VI la contracción es discreta si se compara con el segmento VII-VIII y la desaparece en el segmento IX-XIV. Por otro lado la expresión de los isotipos de miosina-CMP también esta relacionada con el estado contráctil de las células MP, en el segmento I-VI y el IX-XIV donde la contracción es escasa o nula se expresa 40 % del isotipo A y 60 % del isotipo B. En cambio en el segmento VII-VIII el isotipo A se expresa solo un 22 % y el B el 78 %. En
conclusión,
en
el
segmento
VII-VIII,
donde
los
espermatozoides están maduros y deben ser transportados a la rete testis, el TS se contrae más activamente, las células MP cambian mas profundamente la morfología por la contracción y producen una elevada expresión del isotipo B de miosina-CMP. Nuestros resultados coinciden con experimentos realizados en otro laboratorio, donde demuestran que la estimulación con oxitocina produce el mayor efecto contráctil en el segmento VII-VIII del TS. (Harris y Nicholson 1998).
_____________________________________________________________________ Discusión
113
Discusión General _____________________________________________________________________
En los TS de testículos de rata adulta, la espermatogénesis es un
proceso
constante,
donde
las
células
germinales
están
continuamente desarrollándose desde las espermatogonias tipo A. La reestructuración de la citoarquitectura ocurre en discretos estados del epitelio seminífero, correlacionado con la translocación de clones de células germinales en meiosis temprana desde el compartimiento basal al luminal. (Fantoni y col. 1993). En este caso los testículos están bajo cambios que rememoran algunos de los que ocurren en otros órganos durante el desarrollo fetal. Es conocido que el efecto morfogenético de las hormonas esta ligado a la interacción del epitelio con las células del estroma. Las principales células tipo somáticas del túbulo seminífero son las células MP (mesenquimaticas) y las células epiteliales de Sertoli. Resultados de co-cultivos in vitro realizados por Palombi y col. 2002 demostraron que las células de Sertoli y las células MP interaccionan entre sí llevando a la formación de la lámina basal y una arquitectura similar a la de TS. La presencia de células MP además resulta en un incremento de la producción de “androgen binding protein” (ABP) por las células de Sertoli. Proteínas liberadas por las células MP estimulan la producción de ABP y transferrina por las células de Sertoli. (Palombi y col. 2002). Las células de Sertoli producen y secretan ET-1 que activan a las células MP que contienen los receptores ETA y ETB para ET-1 (Fantoni y col. 1993; Tripiciano y col. 1997). Es conocido que la expresión
cíclica de la enzima convertidora de ET-1 (ECE) por las
_____________________________________________________________________ Discusión
114
Discusión General _____________________________________________________________________
células de Sertoli regula funcionalmente la contracción del TS. Se ha comprobado que las células de Sertoli solo en el estadio IX-X del epitelio seminífero secretan ECE, por ende aportan ET-1 a las células MP vecinas para contraerse. (Tripiciano y col. 1999). ¿ Las células MP presentan un ciclo de diferenciación en sincronía con el epitelio espermático?. Durante el desarrollo del testículo hemos visto que las células MP se transforman profundamente desde el día 16 pn, cambiando su tamaño, morfología, organización de los microfilamentos y expresión de isotipos miosina-CMP. En el testículo de rata adulta, las células MP de los segmentos del TS que contienen a las células de los distintos estados del epitelio seminífero muestran distinto comportamiento en cuanto a su tamaño, grado de contracción y expresión de isotipos de miosina-CMP. Se interpreta que en el estado VII-VIII, donde los espermatozoides deben ser transportados a la rete testis, es donde más activas se encuentran las
células
MP,
actividad
que
luego
pierden
cuando
los
espermatozoides han dejado el lumen del TS. Hay muchas evidencias en la bibliografía de la íntima relación de la célula de Sertoli con la célula MP, de tal modo que la célula de Sertoli determina cuándo se activan y contraen las célula MP.
Pero
para que la célula MP sea sensible a ET-1, debe encontrarse en el segmento VII-VIII del epitelio seminífero, de lo contrario es refractaria. A lo largo de este trabajo hemos mostrado la aparición de rasgos diferenciales de la célula MP en el estado VII-VIII como la
_____________________________________________________________________ Discusión
115
Discusión General _____________________________________________________________________
mayor expresión del isotipo B de miosina PM e incremento de la capacidad contráctil, por lo que interpretamos que de la misma manera como madura la célula MP en el desarrollo del testículo, las células MP se van diferenciado a lo largo de cada ciclo del epitelio seminífero para ser totalmente activas en el estado VII-VIII.
_____________________________________________________________________ Discusión
116
CAPÍTULO VI MATERIALES Y MÉTODOS
Capítulo VI. Materiales y Métodos _____________________________________________________________________
MATERIALES Y METODOS 1. Animales y materiales biológicos Se
utilizaron
ratas
Wistar
(Charles
River)
criadas
en
el
animalario del IHEM y fueron alimentadas ad libitum hasta que se sacrificaron por decapitación cervical. Los animales fueron mantenidos de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio del NIH (USA). Los testículos de toro y los estómagos musculares de pollo fueron obtenidos en un matadero de la ciudad. 2. Aislamiento de túbulos seminíferos y de células del testículo Aislamiento de túbulos seminíferos y segmentos: Testículos de rata desprovistos de la túnica albugínea y de la arteria seminífera se digirieron con 1 % de tripsina en buffer fosfato, 5 minutos, a 25 ° C y se centrifugaron en centrífuga de mesa. En el sedimento quedaron los túbulos seminíferos y en el sobrenadante las células del intersticio. Segmentos de túbulos seminíferos con distintos estados seminíferos. Los túbulos seminíferos en una caja de petri, se colocaron en la platina de la lupa. Se eligieron segmentos conteniendo la mayor cantidad de espermatozoides (segmento VI-VII) y se seccionaron con una tijera. Además se secciono la porción que seguía al segmento VI-VIII que no contenía espermatozoides, segmento IX-XIV, y la porción que contenía escasos espermatozoides, segmento I-V. Los tres segmentos fueron colocados en recipientes distintos y utilizados para los experimentos.
_____________________________________________________________________ Materiales y Métodos
118
Capítulo VI. Materiales y Métodos _____________________________________________________________________
Células mioides peritubulares: Los túbulos seminíferos desprovistos de las células del intersticio se digieren con 0,2 mg/ml de colagenasa, 0,02 mg/ml de hialuronidasa, 2% de ácido etilendiamintetraacético (EDTA), 1 mg/ml de albúmina, 4,5 mg/ml de HEPES, en buffer PBS (Phosphate Buffer Saline), por 90 minutos a 34° C. La digestión se centrifugó y en el sobrenadante quedan las células mioides. El desprendido de las células mioides se monitoreó bajo lupa en túbulos teñidos con nitrato de plata. 3. Visualización y medición de las células mioides peritubulares en el túbulo seminífero Tinción con Cloruro de Plata: Túbulos seminíferos o segmentos con
distintos
estados
del
epitelio
seminal
fueron
fijados
con
glutaraldehído al 3% e incubados con cloruro de plata al 1% en H2O, 10 min. Se lavaron con H2O y se incubaron con solución reductora (30 % sucrosa, 0,4 M acido nítrico, 30 % alcohol etílico) por 20 min. Las células MP fueron visualizadas con lupa estereoscópica a 20 X y fotografíadas o gravadas para su análisis. En cada experimento una regla graduada de referencia fue gravada en paralelo con las muestras. El diámetro del TS y el área y los ejes x (longitudinal al eje mayor del TS) e y (perpendicular al largo del TS) de las células MP fueron cuantificados con el software Scion Image. Microscopía electrónica de barrido: Los túbulos seminíferos se fijaron con 3% de glutaraldehído en buffer cacodilato, postfijazo con 1% de OsO4 en buffer Zetterquist, y deshidratados en 25%-100% de acetona.
_____________________________________________________________________ Materiales y Métodos
119
Capítulo VI. Materiales y Métodos _____________________________________________________________________
Luego del punto crítico con acetona se los bañó con oro y los túbulos seminíferos se analizaron en un microscopio de barrido. 4. Tratamiento de los túbulos seminíferos con endotelina-1 Túbulos seminíferos aislados o segmentos conteniendo distintos estados germinales fueron incubados con 0-50 nM ET-1 en medio MEM 20 segundos y las células MP fueron visualizadas por tinción con cloruro de plata. 5. Análisis de proteínas Electroforesis en geles de poliacrilamida. Fueron utilizados geles de poliacrilamida 4-7,5 % con dodecil sulfato de sodio (SDS) (SDSPAGE), bajo condiciones de reducción. Las proteínas se corrieron en paralelo con marcadores de peso molecular. La corrida electroforética se efectuó de 2-10 mA. Transferencia de proteínas: Luego de corrido el gel, las proteínas se transfirieron a lámina de nitrocelulosa utilizando el siguiente buffer de transferencia (0,02 M de tris-base, 0,15 M de glicina, 20 % de alcohol metílico y 0,1 % de SDS y una corriente de 250 mA. Las proteínas transferidas se analizaron con colorante Ponceau S. Inmunoensayo: Se bloqueó la lámina de nitrocelulosa con 0,1 % de albúmina de suero bovino (ASB) en buffer TTBS (0,3 M NaCl, 0,1 M tris, 0,05 M tween 20 y 0,01 % N3Na), 90 min a 20° C. Se Lavó con buffer TTBS e se incubó dos horas con el primer anticuerpo diluido disuelto en 1 % ASB en TTBS. Lavar con buffer TTBS e incubar con el segundo anticuerpo, conjugado con fosfatasa alcalina disuelto en 1 %
_____________________________________________________________________ Materiales y Métodos
120
Capítulo VI. Materiales y Métodos _____________________________________________________________________
ASB en TTBS, una hora. Lavar con TTBS y realizar la reacción de la fosfatasa alcalina. Reación
de
fosfatasa
alcalina:
Se
incubó
la
lámina
de
nitrocelulosa en 30 ml de solución AP (2 mg/ml de phenazine methosulfate, con trazas de nitroblue tetrazolium y 5-Bromo-4-chloro3-indolyl phosphate en medio alcalino a pH 8,8). Se detuvo la reacción por lavados con agua destilada.
Fosfatasa alcalina en suspención de células: Se utilizó el kit de laboratorios Wiener, se les adiciona sustrato buffer al blanco, al estándar y a la muestra, se incuban 10 minutos a 37° C y se agrega el reactivo color. Se lee el color de la reacción en el espectrofotómetro a 520 nm. ATPasa. La actividad K+-EDTA-ATPasa se midió en 0.2 mg/ml de miosina purificada en 300 µl de 15 mM imidazole.ClH, pH 7.5, 0.6 M KCl, 5mM EDTA, 1mM ATP a 20 °C. La reacción comienza por la adición de miosina, se remueve en varios puntos de la reacción una cantidad mínima, se lo lleva a una concentración de 0,4 N de ácido percloroacético para detener la reacción, antes de comenzar con el análisis espectroscópico con verde de malaquita a 600nm (Facemyer y Cremo, 1992; Cremo y col. 1995). Análisis de péptidos por espectroscopía de masa. Identificación huella peptídica: Tras su localización, las bandas de interés se recortaron de forma manual minimizando la cantidad de gel y se digirieron in-situ en modo automático (empleando un robot-digestor de Bruker), con tripsina utilizando el protocolo descrito por (Shevchenko y
_____________________________________________________________________ Materiales y Métodos
121
Capítulo VI. Materiales y Métodos _____________________________________________________________________
col. 1996) con algunas modificaciones (variable dependiendo del método de tinción utilizado). El sobrenadante de la digestión (que contiene los péptidos) se acidificó con trifluoroacético (TFA) (0.1% concentración
final)
y
se
secó
en
centrífuga
“speedvac”
y
se
resuspendió en 5 ml de TA (TFA 0.1% Acetonitrilo 33%). Una pequeña alícuota (0.5 ml) se depositó en una placa “Anchor-chip” (Bruker) empleando DHB (2,5-Dihydroxybenzoic acid) como matriz a una concentración de 5 g/l mediante el método “fast evaporation”.
La
placa se introdujo en un espectrómetro de masas de tipo MALDI-TOF (matriz-assisted laser desorption ionisation/time-of-flight), modelo Autoflex de Bruker
equipado con reflector. Los espectros de masas
obtenidos se utilizaron como huella peptídica para la identificación de proteínas en las bases de datos utilizando los motores de búsqueda (Mascot, Profound) accesibles en la red. 6. Obtención y purificación de proteínas Miosina II de la túnica albugínea y de la arteria seminífera del testículo: la túnica albugínea o la arteria seminífera de testículos de rata se congela con nitrógeno líquido, se pulveriza en un mortero y se resuspende con buffer PM (250 mM PIPES, 5 mM de sulfato de magnesio y 10 mM de EDTA). Miosina II de músculo liso: Miosina de músculo liso (MII-ML) se extrajo de estómago de pollo por modificación del método de Ikebe y Hartshorne, 1995. El estómago muscular de pollo recién faenado se homgeneizó en una picadora de carne en buffer A (10mM NaPO4 pH
_____________________________________________________________________ Materiales y Métodos
122
Capítulo VI. Materiales y Métodos _____________________________________________________________________
6,5, 0,3mM KCl, 1,5mM
EGTA, 5mM MgCl2, 1mM ATP). Se diluyó la
muestra con 4 volúmenes de agua destilada y luego se filtró con lana de vidrio (para eliminar lípidos). A la muestra obtenida desde el filtrado se le agregó 10 volúmenes de agua destilada y se incubó toda la noche a 4°C. Posteriormente se realizó una centrifugación de 15 minutos a 5.000 r.p.m. Se resuspendió el sedimento, conteniendo los filamentos de miosina, con buffer B (0,6 M de KPO4 pH 6,5, 0,025 M EGTA, 10 M KCl ) y se dializó 12 horas en contra de buffer C ( 0,025 M de KPO 4, 0,6 M de KCl, 0,01 M de EGTA, 0,001 M de DTT). Se agregó a la suspención 1 volumen de agua destilada y se centrifugó a 14.000 r.p.m. durante 30 minutos. El sobrenadante conteniendo miosina II se conservó en 50 % glicerol a – 20 °C hasta su uso. Obtención
miosina-CMP
por
el
método
de
agregación-
desagregación: Testículos de rata o de toro sin túnica albugínea ni arteria espermática, se homogenizaron en medio PMEE (35 mM de Pipes, 5 mM de MgSO4, 1 mM de EGTA, 0,5 mM de EDTA, pH 7,4) en una relación 1:1. El homogenizado se centrifugó a 100.000 xg, 1 h a 4° C. El sobrenadante (S1) se incubó 30 min a 20° C y se centrifugó a 100.000g por 30 minutos sobre sacarosa al 20 % en PMEE. El sedimento (P2) se lavó con PMEE y se centrifugó nuevamente. El nuevo sedimento limpio (P2) se resuspendió en una solución de 4 mM ATP en PMEE, se centrifugó y el sobrenadante (S3) se guardó a -20° C hasta su uso.
_____________________________________________________________________ Materiales y Métodos
123
Capítulo VI. Materiales y Métodos _____________________________________________________________________
Purificación de miosina-CMP en gradiente de sacarosa: Las proteínas obtenidas por el método de agregación-desagregación se sembraron en la parte superior de un gradiente de sacarosa (5 % - 20 % en PMEE), se centrifugaron a 150.000 xg 8 h a 4° C. Se colectaron fracciones desde el fondo del tubo y se analizaron en SDS-PAGE al 7,5 %. Purificación de miosina-CMP en columna de hidroxiapatita: Miosina-CMP de rata o de toro aislada parcialmente por el método de agregación-desagregación,
se
cargaron
en
una
columna
de
hidroxiapatita en buffer 0,6 M de NaCl en PM (Pipes-Magnesio), se purgó la columna con el mismo buffer, y se eluyeron las proteínas con un gradiente continuo de 0-400 mM de fosfato de sodio conteniendo 0,6 M de NaCl, pH 7,4. Se colectaron las fracciones, se precipitaron las proteínas con ácido tricloroacético (TCA) y se analizaron por SDS-PAGE al 7,5 %. Purificación
de
miosina-CPM
en
geles
de
poliacrilamida:
Muestras de miosina-cmp se corrieron en SDS-PAGE al 7,5 %, se cortaron la bandas de miosina-CMP y se enviaron a analizar o se solubilizaron del gel con H2O2 20 volúmenes, por doce horas a 60° C. Anticuerpos
policlonales
anti
miosina-CPM:
Se
inyectaron
conejos por vía subcutánea con una suspención de miosina-CMP purificada por electroforesis con adyuvante de Freund completo. Después de un mes se obtuvo suero del conejo que se conservó en solución de glicerol al 50 % a 70° C. Prueba del anticuerpo: La
_____________________________________________________________________ Materiales y Métodos
124
Capítulo VI. Materiales y Métodos _____________________________________________________________________
actividad y especificidad de los anticuerpos obtenidos se probaron por inmunoensayo. 7. Digestión de proteínas con tripsina Suspensiones de miosina fueron incubadas en relación
200/1
(peso/peso) con tripsina por el tiempo decidido a 25° C. La digestión se detuvo con 0,1 µg/ml de inhibidor de tripsina. 8. Cuantificación de proteínas Método de Lowry: Se tomaron alícuotas de las muestras a medir, se le adicionó reactivo alcalino de Lowry, se incubaron 15 m a 22 °C. Se adicionó reactivo de Folin, se incubaron 20-45 m y se leyeron en el espectrofotómetro a 500 nm. Utilización de geles: Geles de poliacrilamida al 7,5% fueron sembrados con las siguientes concentraciones Albúmina sérica bovina (0,5–4 µg), corridos y teñidos con Azul de Coomassie R-250. Los geles obtenidos fueron fotografiados con una cámara digital Kodak y grabados en un sofware propio sistema EDAS. Las fotografías se analizaron con el programa SCION IMAGE y se determinó el área de las bandas de SAB con los datos de la densidad óptica de cada una de las concentraciones, para evaluar la lineabilidad. En base a los valores obtenidos se confeccionó una curva de densidad de área de las bandas versus la concentración de ASB. Cuantificación de miosina: Se sembraron geles de poliacriamida al 7,5% con muestras de miosina de concentración desconocida y SAB con concentraciones de 0,5- 2 µg. Los datos de densidad óptica de las bandas de miosina obtenidos con
_____________________________________________________________________ Materiales y Métodos
125
Capítulo VI. Materiales y Métodos _____________________________________________________________________
SCION IMAGE se extrapolaron a los de la curva confeccionada con los correspondientes patrones de Albúmina. 9. Precipitación de proteínas A una suspensión de proteínas conteniendo 5 % de ácido tricloro acético en concentración final, se incubaron una hora a 0° C, se centrifuga a 15.000 rpm por 30 minutos a 4° C. El sedimento se resuspendió con sample buffer y se ajustó a pH 7. 10. Agregación y desagregación de miosina Agregación in vitro: Suspensiones de miosina de distintos orígenes en una concentración de 150 µg/ml se dializaron por 12 horas a 4° C o a 20° C en soluciones de 0 - 300 mM de NaCl en buffer fosfato (25 mM de NaPO4, 2 mM de MgCl2, 300 mM de NaCl a pH 7,5). Después de la diálisis las muestras se centrifugaron a 30.000 rpm sobre 20 % de sacarosa en buffer fosfato. Las proteínas del sedimento y del sobrenadante de cada muestra se analizaron por SDS-PAGE al 7,5 % y las bandas de miosina se cuantificaron en el gel. Agregación in vivo: Túbulos seminíferos, túnica albugínea y arteria espermática de rata se homogenizaron
en relación peso en
volumen 1:1 con buffer PM con y sin 0,6M NaCl a 0° C. Las proteínas obtenidas fueron analizadas por SDS-PAGE al 7,5% y la cantidad de miosina fue estimada por inmunoensayo. Desagregación por fuerza iónica o ATP. Filamentos de miosina, formados
de aproximadamente 150 µg/ml de miosina,
fueron
incubados con 0-300 mM de NaCl a 20 ºC o con 0-35 mM de ATP 30
_____________________________________________________________________ Materiales y Métodos
126
Capítulo VI. Materiales y Métodos _____________________________________________________________________
min a 20 °C. Las muestras se centrifugaron a 30.000 rpm sobre 20 % de sacarosa en buffer fosfato. Las proteínas del sedimento y del sobrenadante de cada muestra se analizaron por SDS-PAGE al 7,5 % y las bandas de miosina se cuantificaron en el gel. 11. Análisis de datos Los datos fueron analizados estadísticamente con el programa Excel y Prism y se expresaron como la media ± error estandart medio (E.S.M) de n experimentos.
_____________________________________________________________________ Materiales y Métodos
127
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