BÚSQUEDA DE EPÍTOPES INMUNOGÉNICOS CONSERVADOS EN EL DOMINIO P2 DE LA PROTEÍNA DE CÁPSIDE VP1 ENTRE DIFERENTES GENOTIPOS DE NOROVIRUS COMO POSIBLES CANDIDATOS A VACUNAS.

UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA
FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFIA


PROYECTO DE INVESTIGACIÓN:
BÚSQUEDA DE EPÍTOPES INMUNOGÉNICOS CONSERVADOS EN EL DOMINIO P2 DE LA PROTEÍNA DE CÁPSIDE VP1 ENTRE DIFERENTES GENOTIPOS DE NOROVIRUS COMO POSIBLES CANDIDATOS A VACUNAS.


Fernández Torres, Jorge Manuel


2014-I



Introducción y Justificación del Problema
1Los calicivirus humanos (HuCVs), entre ellos, norovirus, son causa importante de gastroenteritis aguda en adultos y niños menores de 5 años de edad a nivel mundial. 2Específicamente, norovirus ha sido recientemente reconocido como la segunda causa más común de diarrea infantil y de hospitalización por diarrea, además de causar un estimado de doscientos mil muertes de niños anualmente en países en desarrollo. 3Las formas de contagio son variadas, desde el fecalismo, hasta el simple tacto con una persona infectada sin adecuada higiene.
4Debido a su alta tasa de mutación, norovirus ha sido clasificado en 5 genogrupos, de los cuales, G1 (genogrupo 1) y G2 (genogrupo 2) infectan a los humanos. Dentro de cada genogrupo, existen diversos genotipos, de los cuales norovirus de genogrupo II, genotipo 4 (GII.4) representan la mayoría de los brotes a nivel mundial. 5Estas variaciones se basan en la secuencia de nucleótidos que componen el dominio P2 de la proteína de la cápside VP1 de norovirus.
6VP1 es la única proteína viral que conforma la cápside de norovirus, el cual presenta dos dominios, S (dominio de coraza) y el dominio superficial o protruding P, el cual se subdivide en dos regiones, P1 y P2. La región P2 es de gran importancia debido a que es altamente variable y se encuentra en la superficie más expuesta de la cápside presentando determinantes antigénicos para la respuesta inmunológica del huésped.
5Actualmente se han reportado más de 30 genotipos específicos para el genogrupo II, su diferencia radica en la secuencia de nucleótidos que presenta la región altamente variable P2 de las proteínas de la cápside VP1. Debido a su alta variabilidad, la respuesta inmune después de una infección solo reconocerá el genotipo al cual previamente el paciente se había infectado, lo que dificulta una vacuna universal para los distintos genogrupos y genotipos de norovirus. Sin embargo, la búsqueda de epítopes en común entre ambos genogrupos y diversos genotipos, podrían ayudar a revelar candidatos para una posible vacuna contra norovirus en el futuro.
7El principal agente viral de provocar muertes causadas por diarrea en niños, Rotavirus, presenta una vacuna, la cual ha disminuido considerablemente los casos de gastroenteritis agudas en niños. 8A causa de ello, los estudios epidemiológicos parecerían estar mostrando a norovirus como el nuevo principal agente viral causante de muertes por diarrea a nivel mundial debido a la carencia de vacunas y profilaxis adecuado. Debido a ello, la búsqueda de epítopes conservados entre los diferentes genogrupos y genotipos de norovirus, podría abrir paso a la generación de una serie de estudios sobre una posible vacuna general contra este agente.
A pesar de haber sido descubierto hace 30 años, norovirus aun carece de cultivo celular, lo que ha retrasado el desarrollo de una vacuna. Para su estudio, se ha recurrido al uso de sistemas de expresión de proteínas, como el sistema Baculovirus para la generación de VLP's que permitan la identificación de la estructura de norovirus.
9Actualmente, estudios como el de Tracy Dewese Parker, Noritoshi Kitamoto y colaboradores, demuestran que la disponibilidad de los VLPs, permiten la generación de anticuerpos monoclonales reactivos, permitiendo el estudio serológico y las propiedades antigénicas de norovirus.
Objetivos
Analizar y comparar las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del dominio P2 de la proteína de cápside VP1 entre los distintos genotipos G2 y G1 de cepas peruanas de norovirus.

Encontrar epítopes conservados en el dominio P2 de la proteína VP1 entre los distintos genotipos G1 y G2 de cepas peruanas de norovirus.

Métodos
Obtención de muestras
Actualmente, existen estudios previos acerca de la prevalencia de diversos genotipos de norovirus en el Perú, en ellos, se extraía el material genético del virus (RNA) mediante kit de extracción, donde las muestras de RNA fueron preservadas a -50°C. El proyecto titulado "Multiple Norovirus Infections in a Birth Cohort in a Peruvian Periurban Community", (Saito M, Goel-Apaza, Robert Gilman et al., 2013), identificó los diversos genogrupos y genotipos, prevaleciendo las cepas GII.3, GII.4, GII.17 y GI.2; muestras de RNA son conservadas por la asociación benéfica PRISMA. Para el presente estudio, se espera la aprobación del comité de ética del proyecto de Norovirus en Perú a cargo del grupo PRISMA-UPCH, que permita el uso de estas muestras ya caracterizadas, para la presente investigación.
El estudio está en base a la comparación de las secuencias de las diversas cepas obtenidas en muestras de heces provenientes del asentamiento Las Pampas ubicado en San Juan de Miraflores.
Las distintas cepas a comparar son genogrupo 2 variante 3, 4 y 17 y del genogrupo I, la variante 2 por ser las más prevalentes en el Perú10.
Diseño de Primers y amplificación del dominio P2.
Las muestras de RNA deberán ser convertidas a cDNA por PCR-transcriptasa reversa (usando random primers), una vez convertido a cDNA, se deberá diseñar primers específicos para el dominio P2, para cada genotipo (GII.3, GII.4, GII.17 y GI.2) y amplificar el producto mediante PCR convencional.



Fragmento de amplificación
Fragmento de amplificación

Purificación del Producto
El producto de PCR será purificado mediante Kit de purificación de producto de PCR, High Pure PCR Product Purification Kit de la empresa ROCHE.
Secuenciamiento
El producto de PCR purificado, será mandado a secuenciar por la empresa MACROGEN.
Análisis de Secuencias
Obtenidas las secuencias, se procederá su análisis de las secuencias de la región P2 con el programa CLC-7 Workbench, en ella se buscara similitud entre pares de bases de los diferentes genotipos GII.3, GII.4, GII.17 y GI.2.
Análisis de epítopes conservados
Obtenidas las secuencias de DNA de las diferentes cepas, el uso del programa ClustalW2, el cual, permite el alineamiento de secuencias múltiples de uso general para el ADN o las proteínas, permitirá encontrar regiones conservadas entre los diferentes genotipos de norovirus GII.4, GII.17 y GI.2, de igual manera, el programa puede analizar las secuencias de aminoácidos conservados entre los diferentes genotipos.
Predicción de Epítopes inmunogénicos
Con el programa NetMHC 3.4 Server11, el cual predice la unión de epítopes a un número de diferentes alelos de HLA, (los cuales han sido diseñados para 78 variedades del MHC humano o HLA) se buscará la inmunogenicidad de los diferentes epítopes obtenidos a partir del secuenciamiento de los genotipos GII.3, GII.4, GII.17 y GI.2.
Bibliografía
1. Miyuki Asanaka, Robert L. Atmar, et al. Replication and packaging of Norwalk virus RNA in cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol 102, pp 10327–10332. 2005.
2. Eric F. Donaldson, Lisa C. Lindesmith, et al. Norovirus pathogenesis: mechanisms of persistence and immune evasion in human populations. Immunological Reviews, 2008 Vol. 225: 190–211.
3. Bellido Blasco, Juan. 6ta Monografía de la Sociedad Española de Epidemiología, epidemiología de las gastroenteritis agudas víricas epidemiología de las gastroenteritis agudas víricas, aspectos actuales. Sociedad Española de Epidemiologia, Universidad de Valencia. Pág. 19.
4. Jacqueline Xerry, Chris Gallimore et al. Genetic Characterization of Genogroup I Norovirus in Outbreaks of Gastroenteritis. Journal of Clinical Microbiology, Vol 48, 2010.
5. Michele E. Hardy. Norovirus protein structure and function. FEMS Microbiology Letters, Volume 253, 2005,pp 1–8.
6. Mikael Nilsson, Kjell-Olof, et al. Evolution of Human Calicivirus RNA In Vivo: Accumulation of Mutations in the Protruding P2 Domain of the Capsid Leads to Structural Changes and Possibly a New Phenotype. Journal of Virology, 2003, Vol 77, pag 13117–13124.
7. CDC, Centers for Disease Control and Prevention, Febrero 2014. Artículo Disponible en: http://www.cdc.gov/vaccinesafety/vaccines/rotavsb.html
8. CDC, Centers for Disease Control and Prevention. Prevent the Spread of Norovirus, 2013. Artículo Disponible en: http://www.cdc.gov/features/norovirus/
9. Parker, Tracy; Kitamoto, Noritoshi, et al. Identification of Genogroup I and Genogroup II Broadly Reactive Epitopes on the Norovirus Capsid. Journal of Virology, 2005 vol. 79 pp 7402-7409.
10. Mayuko Saito, Sonia Goel-Apaza, R. Gilman, et al. Multiple Norovirus Infections in a Birth Cohort in a Peruvian Periurban Community. Clinical Infections Diseases Vol; pp 483–91, 2013.
11. ClustalW2, Multiple Sequence Alignment Tool, Disponible en: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/