BIOPLÁSTICOS A PARTIR DEL ALMIDÓN DE CÁSCARA DE BANANO: UNA ALTERNATIVA NOVEDOSA Y ECOLÓGICA A LOS PLÁSTICOS CONVENCIONALES BIOPLASTICS STARCH FROM BANANA PEEL: AN INNOVATIVE AND ECOLOGICAL ALTERNATIVE TO CONVENTIONAL PLASTIC

BIOPLÁSTICOS A PARTIR DEL ALMIDÓN DE CÁSCARA DE BANANO: UNA ALTERNATIVA NOVEDOSA Y ECOLÓGICA A LOS PLÁSTICOS CONVENCIONALES


Rev. 2 del 9/ene/2012
Alix Barragán, Pedro Domínguez, Jersson Hernández







Pag. 21 / 23
Publicaciones DYNA SL--c) Mazarredo nº69 - 4º -- 48009-BILBAO (SPAIN)
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BIOPLÁSTICOS A PARTIR DEL ALMIDÓN DE CÁSCARA DE BANANO: UNA ALTERNATIVA NOVEDOSA Y ECOLÓGICA A LOS PLÁSTICOS CONVENCIONALES

Alix Barragán Calderón-- Ingeniería Química-- Universidad Nacional de Colombia
Pedro Domínguez Guzmán -- Ingeniería Química-- Universidad Nacional de Colombia – [email protected]
Jersson Hernández Delgado-- Ingeniería Química-- Universidad Nacional de Colombia


Recibido: -- Aceptado: - DOI: 10.(A cumplimentar por el Editor)

BIOPLASTICS STARCH FROM BANANA PEEL: AN INNOVATIVE AND ECOLOGICAL ALTERNATIVE TO CONVENTIONAL PLASTIC

ABSTRACT:
In this report an investigative process performed, with the main objective of establishing the optimum condition and suitable for the production of polylactic acid (PLA), a biopolymer whose precursor molecule is lactic acid is described, considering all the aspects that involve. Initially a contextualization where be described simply and clearly an overview of the PLA, where its importance in the industry and its applications will be described took place, then some important financial aspects that will determine the best raw materials are mentioned to work, and where you can purchase easily. Subsequently deepened in the topic describing in detail, which microorganism has the ability to synthesize the desired product, plus his method of isolation from a natural source, besides its features, power and conservation, where it is explained, the nutritional requirements of growth and optimal conditions of culturing, here it should be emphasized that as the PLA is a product from the polymerization of lactic acid, a microorganism that produces this acid is sought. Later the industrial design process, and transferred to large scale mass production and finally established by a guide bioethics if the process is raised or irrelevant should outline.

Keywords: Bioplastic, polylactic acid, polymer, microorganism, culture medium, bioethics.
RESUMEN
En el presente informe se describirá un proceso investigativo realizado, con el objetivo principal de establecer las condiciones óptimas y adecuadas para la producción de ácido poli láctico (PLA) ,un biopolímero cuya molécula precursora es el ácido láctico, considerando todos los aspectos que lo involucran. En un principio se realizara una contextualización donde se describirá de forma sencilla y clara las generalidades del PLA, donde se describirá su importancia en la industria y sus múltiples usos, luego se mencionara algunos aspectos financieros importantes, que permitirán determinar cuál es la mejor materia prima para trabajar, y en donde se puede adquirir más fácilmente.

Posteriormente se profundizara en el tema describiendo de forma detallada, que microorganismo tiene la capacidad de sintetizar el producto buscado, sumado a su método de aislamiento de una fuente natural, además de sus características, fuente y conservación, donde se explicara, los requerimientos nutricionales del crecimiento, así como las condiciones óptimas del medio del cultivo, aquí cabe recalcar que como el PLA es un producto proveniente de la polimerización del ácido láctico, se buscara un microorganismo que produzca este acido. Más adelante se reseñara el diseño industrial del proceso, ya trasladado a gran escala para su producción en masa y finalmente se establecerá mediante una guía de bioética si el proceso planteado es o no pertinente.

Palabras clave: Bioplástico, ácido poliláctico, polímero, microorganismo, medio de cultivo, bioética.




1.- INTRODUCCIÓN

Actualmente el ácido láctico es utilizado ampliamente en la industria alimenticia, química, farmacéutica, del plástico, textil, la agricultura, la alimentación animal, entre otros [1], sin embargo, la aplicación más interesante del ácido láctico se encuentra en la posibilidad que ofrece de producir ácido poliláctico, El PLA es un biopolímero termoplástico [2] utilizado para la producción de implantes, prótesis, producción de envases y empaques para alimentos, por lo cual el presente proyecto tiene como objetivo establecer las condiciones óptimas y adecuadas para la producción de ácido poli láctico (PLA). El PLA ha despertado el interés de investigadores, productores y procesador ya que se ha encontrado que puede ser un gran competidor frente a otros plásticos de origen petroquímico por su carácter biodegradable y su amplio rango inusual de propiedades. [3], Es por ello que se ha motivado la elaboración del presente trabajo, pues entender de forma clara todos los aspectos relacionados con el PLA, llevaría a una posible propuesta sobre la mejora en diversos procesos industriales, ya que con sus características, el PLA puede dejar en el olvido, productos que hoy en día tras su producción dejan cientos de residuos contaminantes, extremadamente nocivos para el medio ambiente y por ende para la humanidad.

Dentro de la elaboración del proyecto, se plantea dejar un aporte positivo no solo a la ingeniería como tal, sino a todas las personas en general, ya que demostrando las cualidades y bondades que tiene la fabricación de biopolímeros, sobre los polímeros tradiciones provenientes de los derivados del petróleo, se alcanzara una concientización ambiental, lo que conllevara a que las industrias comiencen a producir estos materiales de forma masiva, y esto sería una gran mejora en términos ecológicos y ambientales, ya que traería beneficios para todos.

2-MATERIALES Y MÉTODOS

Para desarrollar las actividades planteadas en el presente proyecto inicialmente es necesario contar con los siguientes materiales:

Cáscara del Banano de rechazo.
Producto lácteo fermentado (Fuente natural del microorganismo)
Caldo MRS.
0,5 g de liofilizado
Estufa incubadora
Cajas de Petri
Asa de siembra de platino
Tubos de ensayo

Por otro lado el desarrollo práctico que se realizó se dividió en 4 etapas:

En la primera etapa se llevó a cabo el pre – tratamiento a la fuente de sustrato (cáscara de banano). Este proceso se realizó con el objetivo de separar el almidón de los demás componentes presentes en la cáscara (tales como celulosa, hemicelulosa, lignina, etc.). Una vez se aisló el almidón, se ejecutó un proceso de hidrólisis enzimática sobre éste con el fin de pasar de una solución con un polisacárido a una en la que se hallen monosacáridos libres (glucosa), los cuales si puede metabolizar el microorganismo en cuestión.

En la segunda etapa se procedió a aislar el microorganismo presente en la fuente natural (producto lácteo fermentado) empleando la técnica de aislamiento por estría. Esta técnica consiste en tomar una muestra de la fuente natural con el asa de siembra (esterilizada) y se hacen extensiones sobre la caja de Petri en cualquiera de las formas señaladas en la figura [16]. Luego se incubó la caja de Petri a 37°C durante 24 horas. De las últimas colonias esparcidas, se volvió a tomar una muestra que se depositó en otra caja de Petri y finalmente se repitió el procedimiento ya descrito. Así sucesivamente, se fueron haciendo extensiones en un número considerable de cajas de Petri y de las últimas colonias esparcidas sobre la última caja de Petri se tomó una muestra que representaría el cultivo Purificado.

En la tercera etapa se tomó el cultivo purificado y se depositó en un medio de cultivo adecuado para su óptimo crecimiento. El medio de cultivo para el mantenimiento del Lactobacillus delbrueckii bulgaricus es lo que se conoce como caldo MRS., el cual es un medio de cultivo complejo que ya viene prefabricado. Para mantener el cultivo puro y vivo Fue necesario inocular 0,5 g de liofilizado en 50 mL de caldo y posteriormente se incubó a 48°C por 24 horas. Después se efectuaron inoculaciones sucesivas cada tres días, en un nuevo caldo MRS. La relación %V/V del microorganismo con respecto al volumen de caldo empleado es de 10%. Adicionalmente, parte del medio de cultivo inoculado con la bacteria se dejó a 30°C por 5 días con el objetivo de conservar el cultivo puro y vivo.

Al finalizar la etapa de crecimiento poblacional del agente bacteriano, se procedió a inocular el microorganismo en la solución de glucosa preparada en la primera etapa. Esta vez, el medio en el que el ser vivo metabolizó la glucosa era completamente anaerobio.

3.- RESULTADOS

3.1.-DESCRIPCIÓN DEL PRODUCTO A OBTENER: BIOPLÁSTICO
Se denomina bioplástico a un tipo de plásticos derivados de productos vegetales, tales como el aceite de soja, el maíz o la fécula de patata, a diferencia de los plásticos convencionales, derivados del petróleo. Los plásticos tradicionales (polietileno, polipropileno, ABS, PET, entre otros) están sintetizados a partir del petróleo por la industria petroquímica [2]. La carencia de este combustible fósil, su carácter de resistencia a la degradación natural y el hecho de que es una fuente que, tarde o temprano, acabará por agotarse, ha llevado a algunas partes de la industria a buscar alternativas; el poliácido láctico, sintetizado a partir de la cáscara de banano, es una de las más prometedoras.












Fig. 1. Clasificación de bioplásticosFig. 1. Clasificación de bioplásticos
Fig. 1. Clasificación de bioplásticos
Fig. 1. Clasificación de bioplásticos

3.2.-DEFINICIÓN: Dentro de la literatura, se encuentra un gran número de definiciones, destacando diverso aspectos más sin embargo en el presente informe se tratara de conceptualizarlo de la forma más clara posible, El ácido poli-láctico (PLA) es un polímero biodegradable producido a partir de la unión de cientos de moléculas de ácido láctico, también es considerado como un termoplástico, es decir un plástico que a temperaturas relativamente altas, se vuelve deformable o flexible, se derrite cuando se calienta y se endurece en un estado de transición, cuando se enfría lo suficiente, Es un material altamente versátil, que se puede obtener a partir de recursos renovables al 100%, como son la maíz, la remolacha, el trigo y otros productos ricos en almidón.[1][2][3]
3.3.-CARACTERÍSTICAS: El PLA tiene múltiples características, mas sin embargo este conjunto de propiedades dependen de la composición del polímero, de su peso molecular y de su cristalinidad. [4] El ácido Poli láctico es biodegradable y reabsorbible, así que la basura de PLA una vez finalizado su ciclo de vida puede ser tirada. También procede de recursos renovables, así que la materia prima puede estar siempre disponible más sin embargo una crítica importante del polímero ocurre durante su fase de producción pues el PLA lanza dióxido de carbono y metano durante este proceso, sustancias que participan al efecto invernadero [2] [5].
Una de las características más importantes del PLA es que posee propiedades mecánicas en el mismo rango de los polímeros petroquímicos, a excepción de una baja elongación. Sin embargo esta propiedad puede ser afinada durante la polimerización. El PLA puede ser tan duro como el acrílico o tan blando como el polietileno, además se le atribuyen también propiedades de interés industrial como la suavidad, resistencia al rayado y al desgaste [6].
3.4.-USOS: Por sus amplias características y propiedades el PLA se encuentra en múltiples aplicaciones, entre las que están la medicina y en industrias como la alimentaria, la textil, de cosméticos y otras. Muchos de estos productos ya están utilizándose pero otros aún están en proceso de investigación por diversos grupos y empresas. Algunos usos específicos del PLA son:

3.4.1.-Médicos. El ácido poli láctico ha llegado a ser un producto importante en la industria médica. Al poder ser asimilado por el organismo algunos usos particulares son: estructuras biodegradables para la ingeniería de tejido, Implantes reconstructivos y bioabsorbibles, Equipos e instrumental para cirujanos, implantes para fijación de fracturas entre otros [4].

3.4.2.-Industria textil. El PLA también tiene muchas aplicaciones potenciales en su presentación como fibra. Presentan unas características muy atractivas para muchos usos tradicionales. Estos polímeros tienden a ser estables a la luz ultravioleta dando como resultado telas con poca decoloración. Entre sus aplicaciones se destacan las prendas de vestir, la tapicería de ciertos muebles, los pañales, los productos femeninos de la higiene entre otros. [4] [5]
3.4.3.-Empaquetamiento y embalaje. El PLA se encuentra aplicado en otras ramas industriales como la de producción de envases para alimentos, envolturas de distintos tipos, embalajes y otras [3].

3.5.-PRODUCCIÓN INTERNACIONAL DE ÁCIDO POLILÁCTICO
Un impedimento importante en el desarrollo del polímero ha sido el elevado costo de producción, pero gracias a los avances en la fermentación de la glucosa para obtener ácido láctico, ha experimentado una bajada importante en el costo de producción del ácido láctico y por consiguiente, un interés creciente en el polímero.

Una de las primeras compañías que desarrollo los polímeros de ácido poliláctico fue Cargill. Esta empresa comenzó a investigar la tecnología de producción de PLA en 1987, y su producción en planta data de 1992. En 1997, dicha compañía se asoció con la empresa Dow ChemicalCompany, creando NatureWorks LLC. Además de esta reconocida empresa, a nivel mundial también existen otras compañías productoras de PLA como son: Teofan (Alemania), Hycail (Holanda), MitsuiChemicalsInc (Japón), SterlingChemicals (EE.UU.), MusashinoChemical (Japón), CCA biochemical BV Netherlands con plantas en Europa, Brasil y EE.UU., ArcherDaniels Midland (ADM) (EE.UU.). [7]

Particularmente, El PLA es producido por dos compañías en el mundo: Carril Dow (NatureWorks) y Chronopol Inc. Por un lado, Cargil Dow (Minneapolis), centra su producción en la elaboración de homopolímeros lineales de alta cristalinidad, y explora el campo de los copolímeros con aceite de soya epoxidado. Esta compañía tiene una capacidad instalada de 140,000 toneladas anuales de PLA y el precio por libra del material es de alrededor de 0.75 a 0.90 dólares la libra. Por otro lado, se encuentra ChronopolInc (Golden), la cual tiene la capacidad de producir esteroisómeros 100% puros cuyas propiedades aventajan a las de las mezclas de isómeros que tiene una pureza entre 93 y 97%. Tiene una capacidad instalada entre 45.000 y 90.000 toneladas anuales y precios de 4 a 6 dólares la libra. Por otro lado, de acuerdo a datos estadísticos se conoce que el consumo de PLA en 2007 fue de alrededor de 60 mil toneladas y, hasta el momento, sólo el 30% del ácido láctico producido se utiliza para fabricar PLA. [7]





Empresa
Ubicación
Producto comercial
Cargill LCC
EE.UU.
NatureWorks
Mitsubishi
Japón
Ecoloju
Chronopol
EE.UU.
Heplon
Hycail
Holanda
Hycail HM, LM
Toyota
Japón
Toyota Eco-Plastic
PuracBiomaterials
Holanda
Purasorb*
Durect
EE.UU.
Lactel*
Shimadzu
Japón
Lacty*
Total &Galactic
Bélgica
Futerro**
Treofan
Holanda
Treofan
MitsuiChem
Japón
Lacea
* Especialidades medicinales
** En etapa de proyecto
Tabla 1. Algunas empresas a nivel mundial productoras de PLA

3.6.-FUENTE DE ENERGÍA

Mientras el plástico "tradicional" es compuesto por polietileno sintetizado a partir del petróleo, el bioplástico es compuesto por ácido poliláctico (PLA) y éste a su vez es sintetizado a partir del maíz, soja, banano entre otras fuentes de materias primas renovables. [2]

3.6.1.-Sustrato o fuente carbono. La obtención del ácido láctico ha sido ampliamente estudiada y desarrollada. El primer paso en el proceso es la extracción del almidón de la biomasa. El almidón es un polisacárido de reserva alimenticia predominante en las plantas, constituido por amilosa y amilopectina. Proporciona el 70-80% de las calorías consumidas por la mayor parte de la humanidad. Además constituye una fracción importante de un gran número de productos agrícolas, como los cereales (maíz, trigo, arroz), cuyo contenido de este carbohidrato es de 30 a 80%, las leguminosas (frijol, chícharo, haba), con 25 a 50%, los tubérculos (papa, yuca), en los que el almidón representa entre 60 y 90%, y algunas frutas, como el plátano y el mango, que en su estado verde o inmaduro alcanzan contenidos de almidón de hasta 70% en base seca. Sin embargo, para el presente proyecto se estudió específicamente la cascara de banano y la yuca, debido principalmente a su composición, pero la cáscara de banano que presenta un 39,89% de almidón, representa una potencial fuente de sustrato para el presente proyecto, sumado a su abundante producción en la región Antioqueña de Colombia.[5]

Tabla 2. Composición Química Banano Vs Yuca [32].
3.6.2.-Fuente de sustrato. El banano de rechazo, rico en almidón, puede ser utilizado como sustrato para procesos fermentativos que permitan el máximo aprovechamiento energético, a través de la generación de Ácido poliláctico (PLA).

3.7.- MERCADO DEL BANANO
El banano es exportado para ser consumido principalmente como fruta fresca, pero hay otras formas de utilización: para la fabricación de almidón y harina, para uso alimentario e industrial; como pulpa de banano para la elaboración de alimentos infantiles; como jugo de banano clarificado; como bananos deshidratados. Asimismo se han hecho esfuerzos para utilizar partes de la planta y del fruto como materia prima para la fabricación de papel y de alcohol, a partir de los desechos fibrosos. La existencia de una demanda mundial sostenida, en los países en desarrollo (PED), por su elevado crecimiento demográfico, y en los países desarrollados (PD), especialmente en los países de la OECD, en razón de la creciente preferencia de los consumidores por las frutas exóticas. [8]

3.7.1.-Zonas Productoras en Colombia. Son las zonas de Urabá y Santa marta en Colombia donde se produce banano para exportación.

3.7.1.1.-Magdalena (datos entregados por Augura en el 2011 para la zona bananera de Santa marta).
La actividad bananera de Magdalena comenzó a finales del siglo XIX siendo Santa Marta la primera y principal área de cultivo del banano en Colombia; A junio de 2012 había 12.000 has (incluyendo la Guajira) en producción, de las cuales el 41% están afiliadas a AUGURA; genera 8 mil empleos directos y 24 mil indirectos; exporta anualmente alrededor de 22 millones de cajas de banano; Corbanacol y Fundauniban, fundaciones sociales del sector, desarrollan programas de vivienda, salud, educación, recreación, cultura y deporte para mejorar las condiciones de vida de la población; los primeros cultivos se establecieron en la cara Oeste del Piedemonte de la Sierra Nevada de Santa Marta; a la economía nacional le genera ingresos por valor de 170 millones de dólares, aproximadamente. Los principales mercados a donde llega la fruta producida en Magdalena, son la Unión Europea y los Estados Unidos[8].

3.7.1.2.-Urabá (datos entregados por Augura en el 2011 para la zona bananera de Urabá).
La actividad bananera se desarrolla desde 1960 en el llamado eje o corredor bananero que conforman los municipios de Chigorodó, Carepa, Apartadó y Turbo; a junio de 2012 hay 35.000 has en producción; genera 24 mil empleos directos y 72 mil indirectos; emplea así mismo otras 3.000 personas en sus fábricas de producción de cajas, sellos, plásticos, astilleros, servicio de fumigación, y en otras actividades del proceso de integración vertical que ha desarrollado; exporta anualmente alrededor de 72 millones de cajas de banano, es decir, unas 1.440 toneladas; a la economía nacional le genera anualmente ingresos por valor de 576 millones de dólares, participando con el 35% en el total de las exportaciones antioqueñas y con el 4% en el total de las exportaciones colombianas; las compañías comercializadoras encargadas de llevar la fruta desde Urabá a los mercados internacionales, son: Uniban, Banacol, Conserba, Banafrut y Tropical.

Finalmente, el tratamiento de los desechos agroindustriales es una problemática mundial debido a la emisión de contaminantes sólidos, líquidos (lixiviados) y gaseosos (metano). La industria bananera nacional produce un significativo volumen de biomasa como desecho, generada a partir del banano que no cumple los requerimientos internacionales para su exportación; este banano denominado de "rechazo", se ha convertido en una problemática medioambiental de grandes proporciones. A pesar que una considerable parte de este banano se utiliza para suplir la demanda interna, la cantidad remanente alcanza la cifra de 6.5-10.8 ton/año*ha.

3.7.2.- Disponibilidad.
El banano de exportación se somete a un proceso de control de calidad intensivo, para que llegue a su destino en el estado de madurez acertado y libre de manchas, suciedades y cicatrices de maltrato. De acuerdo con la causa de rechazo, la fruta se clasifica en boleja, rechazo en empacadora y rechazo en puerto. Cuando las expectativas de demanda de banano de exportación no se cumplen en el tiempo estipulado, el momento de corte de los racimos se supera y no permite que sean aprovechados para exportaciones futuras. Esta fruta queda disponible en los campos y es la denominada boleja, la cual se estima entre un 5% y 10% de la producción de exportación anual (Saldarriaga, 1982).
En la etapa de selección y empaque, se presentan rechazos en las operaciones de desgaje y desmane. En la primera se inspeccionan las dimensiones de la fruta, y en la segunda, las condiciones de la cáscara. De este modo, el rechazo de empacadora resulta de la exigencia de calidad estipulada por las comercializadoras de banano. Este rechazo se estima entre un 15% y 20% del total de la producción de exportación anual. En las terminales portuarias, previamente al embarque del banano, se realiza un último control de calidad, para desechar la fruta que pudo maltratarse en el transporte desde las plantaciones a la terminal. El rechazo en puerto es mínimo y lo han estimado en 2% de las exportaciones anuales. [9]

La producción de banano se rige por un estricto control de tiempos que garantiza que, una vez la fruta arribe al consumidor internacional, su estado de madurez sea el óptimo requerido. Para cumplir esas exigencias, la fruta sale del puerto colombiano en estado verde y en condiciones controladas de maduración. De ahí que el banano de rechazo disponible en Urabá se encuentra en ese estado de madurez. El estimativo más reciente del volumen de banano de rechazo generado en Urabá lo publicó Banatura1 (2003), y fue de 250.000 toneladas al año. Considerando que en 2002 el banano producido de exportación fue de 1.077.361 toneladas [6], el estimativo del volumen de rechazo equivale a 23,2% aproximadamente. Esto significa que los estimativos hechos desde la década de 1980 han permanecido constantes a lo largo del tiempo. [8]

No obstante, cabe destacar que aunque el banano de rechazo es abundante, no se cuenta con series estadísticas y reportes en condiciones confiables de cuantificación y seguimiento, que muestren el volumen disponible real de banano para la producción de bioplásticos. A pesar de ello, al considerarse como un residuo de la industria bananera, posee un costo muy bajo y en muchos casos nulos, convirtiéndose en una potencial fuente de materia prima para el objetivo del presente proyecto, pues su obtención tan sólo está limitada por el costo del transporte.

Las tarifas para el transporte terrestre de productos hortofrutícolas varían con la distancia. En Colombia, el Ministerio de Transporte regula las tarifas para el transporte de carga en general, mientras que los fletes de transporte refrigerado son fijados por cada empresa transportadora.La relación peso/ volumen y cubrimiento del flete en el transporte por carretera es de 1 tonelada por 2 metros cúbicos con un desplazamiento puerta a puerta.


Principio del formulario
Final del formulario


Tabla 3. Fletes de transporte de carga por carretera ($/ton)
Resolución no. 002500 del 22 de febrero de 2002: "Por la cual se fijan los criterios en las relaciones económicas entre las empresas de transporte y los propietarios y/o conductores de los vehículos de carga- vigentes a partir del 1 de marzo de 2002"
Considerando que las distancias desde las ciudades de Armenia y Bogotá hasta la ciudad de Medellín varían entre 265 km y 440 km, respectivamente; y comparando este rango con las distancias de las subregiones bananeras de Urabá hasta la ciudad de Medellín, el costo del transporte del banano desde ésta región hasta la capital Antioqueña ronda los $55.839 y $62.168 por tonelada. 

3.8.-COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA: ÁCIDO POLILÁCTICO.
El ácido poliláctico es un polímero o poliéster alifático derivado del ácido láctico (ácido 2-hidroxipropanóico), cuya entidad monomérica se conoce como lactido. La manipulación de los pesos moleculares de este polímero, las mezclas entre los isómeros L (+) y D (-) y la copolimerización han permitido establecer un rango inusual de propiedades inherentes a este polímero, lo cual lo ha posicionado como un posible fuerte competidor de los plásticos derivados del petróleo.







Fig. 3. Ácido polilácticoFig. 3. Ácido polilácticoFig. 2. Ácido lácticoFig. 2. Ácido láctico
Fig. 3. Ácido poliláctico

Fig. 3. Ácido poliláctico

Fig. 2. Ácido láctico

Fig. 2. Ácido láctico




Debido a la naturaleza quiral del ácido láctico, pueden obtenerse distintos tipos de polímero: el ácido-L-poliláctico (PLLA) y el ácido-D-poliláctico (PDLA), productos resultante de la polimerización del ácido L-láctico y del ácido D-láctico, respectivamente. El PLLA tiene una cristalinidad de alrededor del 37%, una temperatura de transición vítrea ubicada entre 60 y 65ºC, una temperatura de fusión entre 173 y 178ºC y un módulo de elasticidad entre 2,7 a 16 GPa.
La temperatura de fusión y de deflexión al calor del PLLA puede incrementarse entre 40 y 50 °C y 60 y 190 °C, respectivamente, si se mezcla físicamente con su isómero PDLA. Esta optimización en cuanto a estas dos propiedades se debe a que el PDLA y el PLLA forman una estereoconflexión muy regular con mayor cristalinidad, en la que el PDLA actúa como un agente de nucleación que aumenta la velocidad con que se cristaliza el polímero. La estabilidad de la temperatura se maximiza cuando se utiliza una mezcla 50:50 de estos isómeros, pero incluso a bajas concentraciones de PDLA (3,1%), existe una mejora sustancial. [2][4]



3.9.1.-CARACTERÍSTICAS DEL MICROORGANISMO.

Luego de haber descrito algunas características del al ácido poli láctico, es de suma importancia conocer un microorganismo con el cual se va a trabajar durante todo el proyecto, y es el Lactobacillus delbrueckii bulgaricus, un microorganismo perteneciente a la clase bacilos, este microorganismo es generalmente usado para la elaboración de yogurt, además tiene la capacidad de producir mediante fermentación el ácido láctico, producto de interés para el proyecto, puesto que a partir de este sustrato, que se logra obtener el ácido poli láctico, a continuación se mencionaran las características más importantes del microorganismo.

A continuación, se definen algunas características que le otorgan identidad al microorganismo conocido como Lactobacillus delbrueckii bulgaricus:

Bajo la tinción de Gram, ésta es bacteria se clasifica como Gram-positiva (Fig. 4). Se etiqueta como probacterias, debido a que hace parte de un grupo de organismos procariotas (que no tienen el material genético contenido en un núcleo definido con membrana nuclear).


Fig. 4. Tinción de Gram-Lactobacillus delbrueckii bulgaricus

Fig. 5. Estructura química de la pared bacterianaFig. 5. Estructura química de la pared bacteriana En su pared celular existe una capa que es la responsable principal de la resistencia de la pared. Esta capa, denominada peptidoglicano, es una delgada lámina compuesta de dos derivados de carbohidrato, la N-acetilglucosamina y el ácido N-acetilmurámico, así como un pequeño grupo de aminoácidos que consta fundamentalmente de L-alanina, D-alanina, y lisina, o ácido diaminopimélico (DAP) (Fig. 5). Estos constituyentes están conectados entre sí para formar una estructura repetitiva, el tetrapéptidoglicano. Los enlaces glicosídicos que conectan los carbohidratos son muy fuertes, pero no proporcionan rigidez en todas las direcciones. Cabe resaltar, que la forma de una célula está determinada por la longitud de las depeptidoglicano, así como por la forma y el grado del entrecruzamiento de las cadenas.
Fig. 5. Estructura química de la pared bacteriana

Fig. 5. Estructura química de la pared bacteriana



El microorganismo tiene forma de bacilo y no posee las capacidades de movilizarse o formar esporas.
Estos bacilos se presentan comúnmente formando cadenas.
Se ha comprobado científicamente que son organismos anaeróbicos facultativos, por lo que pueden adaptarse para crecer y metabolizar tanto en presencia como en ausencia de oxígeno (pueden obtener energía en ausencia de oxígeno, pero el oxígeno no les es tóxico).
Son catalasa-negativos, es decir, carecen de la enzima catalasa, quien se encarga de descomponer al peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua.



Fig. 6. Lactobacillus delbrueckii bulgaricus
Posee un tamaño de 1-3mm, un aspecto untuoso, color blanco crema, borde dentado y elevación plana (Fig6).
Este microorganismo se encuentra incluido en el grupo de bacterias más importantes a nivel industrial, utilizadas para generar ácido láctico (Fig7). Al igual que otras bacterias de ácido láctico, L. delbrueckii es tolerante a pH ácido, no puede sintetizar porfirinas, y posee un metabolismo fermentativo relacionado estrictamente con el ácido láctico, el cual es el principal producto final de su metabolismo.


Fig. 7. Estructura del Ácido Láctico
Dentro del género Lactobacillus, L. delbrueckii forma parte del grupo homofermentativo, los cuales sólo producen uno de los isómeros del ácido lácticoa partir de azúcares de hexosa a través de la ruta de Embden-Meyerhof y son incapaces de fermentar pentosas. Solo cuando las fermentaciones se realizan en un medio alcalino pueden acumularse en cantidades considerables otros productos, como formiato, acetato y etanol.

L. delbrueckiisubsp. Bulgaricus crece en un número relativamente restringido de hidratos de carbono y típicamente requiere ácido pantoténico y niacina.

A continuación se presenta la clasificación científica del microorganismo trabajado.


Tabla 4. Clasificación científica del microorganismo fermentador

Particularmente, la cepa probiótica Lactobacillus delbrueckii bulgaricus aislada del tracto intestinal de terneros (Bostaurus) alcanza un crecimiento máximo in vitro, cuando las condiciones de pH y de temperatura del medio de cultivo se ajustan a 5,31 y 39,38°C, respectivamente [10] .Por otro lado, el aumento en la concentración del inóculo inicial reduce significativamente el crecimiento de esta cepa en el medio de cultivo, sin embargo, a un 5% de concentración, se alcanza el valor máximo en lo que concierne al crecimiento de esta cepa en el cultivo.




Cabe resaltar que el costo del microorganismo varía dependiendo del nivel de bioseguridad, tipo de cepa y presentación del producto [11].


TypeStrain
Yes
No
No
BiosafetyLevel
1
1
1
ProductFormat
Freeze-dried
Dried at least 5 µg in 1X TE buffer
Dried
Cost (ForProfit-Non Profit)
$60.00-$50.00
$290.00-$290.00
$290.00-$290.00
Tabla 5. Costos de cepa-Lactobacillus delbrueckii bulgaricus.


3.9.2.-FUENTE, AISLAMIENTO Y CONSERVACIÓN DEL MICROORGANISMO.

3.9.2.1.-Fuente natural del microorganismo. En general los Lactobacillus pueden encontrarse en productos lácteos, quesos, granos, productos cárnicos o de pescado, agua, aguas cloacales, cervezas, vinos, frutas y jugos de frutas, col y otros vegetales fermentados, ensilajes, masas agrias y pulpas [12], aunque también forman parte de la flora normal de la boca, el tracto gastrointestinal y la vagina de muchos animales de temperatura estable, incluyendo al hombre. También pueden encontrarse en hábitats secundarios como los fertilizantes de origen orgánico. Algunas especies individuales se han adaptado a determinados nichos ecológicos, que son de hecho sus hábitats naturales, siendo muy difícil encontrarlos fuera de éstos [13].
Pero se ha encontrado que en específico el Lactobacillus delbrueckii bulgaricus se encuentran en el intestino delgado de terneros [14], mas sin embargo el descubridor de este microorganismo Stamen Grigoroff, en 1905, lo logro aislar de leche búlgara fermentada. Lo que se conoce como "yogur búlgaro" se entiende a los productos lácteos fermentados, obtenidos como resultado de la actividad de la simbiosis de los cultivos del Lactobacillus delbrueckii bulgaricus [14].

3.9.2.2.-Aislamiento del microorganismo. Para aislar este microorganismo generalmente se usa una técnica bastante útil y práctica conocida como aislamiento en estría, para poder usar esta técnica se necesita los siguientes materiales.
Placa petri con medio de cultivo
Muestra (sólida o líquida)
Asa de siembra de platino
Con el asa estéril tomamos la muestra y hacemos extensiones en la placa. Volvemos a esterilizar el asa de siembra y extendemos parte de la extensión anterior en otra dirección. Volvemos a esterilizar el asa de siembra y volvemos a extender parte de la segunda extensión en otra dirección. Esterilizamos y repetimos la operación. Incubamos a 37 º durante 24 horas y, en la primera zona, habrá un amasijo de células. En la segunda, parte de la primera zona estará mejor extendida, y en la tercera y en la 4ª mejor aún. Si tomamos una colonia y la ponemos sobre una placa petri, tendremos un cultivo puro [15], existen dos tipos de estrías a tener en cuenta.
Estría única: depositamos la muestra lo más alejado de nosotros y realizamos la siembra en forma de zigzag. De esta forma vamos descargando la muestra del asa. Es importante no volver a repasar el trozo de medio de cultivo que ya hemos sembrado. Para conseguir que al final de la estría tengamos colonias aisladas es importante que al principio hagamos la estría más junta y que la cantidad de muestra tomada en el asa sea la adecuada.[16]
Estría múltiple: en esta técnica de aislamiento por agotamiento se realizan varias estrías. Esto se puede llevar a cabo flameando el asa de paso en paso, es decir, de estría en estría, o sin flamear el asa.[16]
[16]
3.9.2.3.-Técnica de cultivo.

Para realizar el aislamiento, inicialmente se debe inocular la muestra (yogurt) en un medio de enriquecimiento (agar MRS), para ello se toman 10mL del producto (yogurt casero), se llevan a 90 mL de agua peptonada 1% (P/V) y se procede a realizar diluciones seriadas, hasta 10-10; se hacen siembras con asa por estriado en superficie de agar MRS [1] y se incuban por 48h a 37º C en condiciones de microaerofilia (10% C02). Se aislan por resiembras en agar MRS las colonias presuntivas que presenten distintas morfologías tanto en las cajas de petri como en las observaciones microscópicas.




Fórmula (en gramos por litro)
Proteosa peptona Nº 3
10.0
Extracto de carne
8.0
Extracto de levadura
4.0
Glucosa
20.0
Monoleato de sorbitán
1 ml
Fosfato dipotásico
2.0
Acetato de sodio
5.0
Citrato de amonio
2.0
Sulfato de magnesio
0.2
Sulfato de manganeso
0.05
Agar
13.0

Tabla 6. Composición del agar MRS [30].
Para un mejor crecimiento del cultivo puro obtenido, la atmósfera debe ser aeróbica con 5-10 % CO2, a 35-37 ºC hasta 3 días o a 30 ºC hasta 5 días. En forma general, Lactobacillus delbrueckii bulgaricus es el microorganismo más utilizado en la producción a gran escala de ácido láctico, ya que tiene la ventaja consumir eficientemente glucosa y ser un microorganismo termófilo con temperatura óptima de crecimiento que oscila entre los 37°C y 41.5ºC, lo que reduce costes de enfriamiento y esterilización, así como riesgos de contaminación microbiológica en el fermentador [19]. Este bacilo no esporulado, crece efectivamente a un pH entre 5,3 y 6,5 por lo que el ácido producido debe ser continuamente neutralizado. Un medio de cultivo que cumple con las anteriores características es conocido como caldo MRS, compuesto principalmente de glucosa como fuente de carbono, de extracto de levadura como fuente compleja de nitrógeno y de sales.
Particularmente, la cepa probiótica Lactobacillus delbrueckii bulgaricus aislada del tracto intestinal de terneros (Bostaurus) alcanza un crecimiento máximo in vitro, cuando las condiciones de pH y de temperatura del medio de cultivo se ajustan a 5,31 y 39,38°C, respectivamente [18]. Por otro lado, el aumento en la concentración del inóculo inicial reduce significativamente el crecimiento de esta cepa en el medio de cultivo, sin embargo, a un 5% de concentración, se alcanza el valor máximo en lo que concierne al crecimiento de esta cepa en el cultivo. [14]

3.9.2.4.-Condiciones de conservación del microorganismo.

El medio de cultivo para el mantenimiento en general de la familia de los Lactobacillus y por ende del microorganismo con el cual se va a realizar el proyecto, es lo que se conoce como el caldo MRS, es un medio de cultivo apropiado para el enriquecimiento de lactobacilos y otras bacterias ácido lácticas a partir de productos lácteos[17]. Fue desarrollado por Man, Rogosa y Sharpe, y por su formulación permite el adecuado desarrollo de lactobacilos y otras bacterias ácido lácticas: La proteosa peptona, el extracto de carne, el extracto de levadura y la glucosa constituyen la fuente nutritiva ya que aportan nitrógeno, carbono, vitaminas y minerales. El monoleato de sorbitán, las sales de sodio, magnesio y manganeso proveen cofactores para el crecimiento bacteriano y pueden inhibir el desarrollo de algunos microorganismos. El citrato de amonio actúa como agente inhibitorio del crecimiento de bacterias Gram negativas. [18]
Se debe tener en cuenta que para mantener el cultivo puro y vivo se inocula aproximadamente 0,5 g de liofilizado en 50 ml de caldo M.R.S y se incuba a 48° C durante 24 horas; después se efectúan inoculaciones sucesivas cada tercer día, en un nuevo caldo M.R.S. [19]
La adaptación del microorganismo al medio de fermentación se da de forma gradual, usando un medio de adaptación apto y eficaz, ya que es el encargado de favorecer el crecimiento del microorganismo. El caldo de M.R.S. tiene la siguiente composición.

Tabla 7. Composición del caldo M.R.S [17]
Este caldo M.R.S, dependiendo del presupuesto del proyecto se puede comprar ya preparado, puesto que ya varias empresas, lo producen en masa, una frasco como el mostrado en la figura 9 oscila entre, $50 y 60$ dólares.

Fig. 9. Frasco marca SYNTH de caldo MRS. [22]
Se inocula este medio de adaptación con 10% (v/v) del microorganismo del medio de mantenimiento, y se procede a incubar a 48°C durante 24 horas, realizando control de esterilidad al medio.


3.10.-FUNCIONALIDAD DEL MICROORGANISMO.
El microorganismo considerado para desarrollar el presente proyecto, es el encargado de dotarnos de la materia prima fundamental (ácido láctico) transformando la glucosa obtenida del almidón, a través de la ruta metabólica de Embden – Meyerhof o glucólisis (esta ruta consiste en 9 reacciones enzimáticas consecutivas que convierten a la glucosa en 2 moléculas de piruvato y se obtiene una ganancia energética de 2 moléculas de ATP) [23], la cual al culminar da paso a la ejecución de la fermentación láctica en la que se desarrolla la acción reductora del NADH en medio anaeróbico sobre el piruvato para llegar finalmente al producto de interés ya nombrado [24].

A continuación, se explica detalladamente la ruta metabólica nombrada (comprende las dos primeras fases) y la acción reductora del cofactor sobre el piruvato (fermentación láctica):

Fig. 10. Ruta de Embden-Meyerhof [25].


Fig 11. Fermentación láctica [24].

Fase de inversión de la energía: En esta etapa de preparación (fase de 6-carbonos) se activa la glucosa con el agregado de dos grupos fosfatos provenientes del ATP. La molécula de glucosa se divide en dos moléculas de tres carbonos: el gliceraldehido-3-fosfato (G3P) y la dihidroxiacetona fosfato, ésta última luego se transforma en G3P.
Fase de "cosecha de energía" las dos moléculas de G3P se convierten finalmente a 2 moléculas de ácido pirúvico o piruvato:
Fase de oxidación (producción de energía): cada gliceraldehido-3-fosfato se oxida, liberando ~ 100 kcal. Parte de la energía producida es temporariamente guardada como NADH (reducido). Parte es usada para agregar un fosfato inorgánico a la molécula de 3 carbonos para dar origen al ácido 1-3 difosfoglicérico. El resto de la energía se libera como calor. 
En las reacciones que siguen los grupos fosfato de 1-3 difosfoglicérico son cedidos (uno por vez) al ADP (adenosíndifosfato) para formar ATP. Esto se conoce como fosforilación a nivel de sustrato. [25]
Fermentación láctica: Cómo característica propia del metabolismo del Lactobacillus delbrueckii bulgaricus, en medio anaeróbico las dos moléculas de piruvato son reducidas gracias a la acción del cofactor NADH producido anteriormente, generándose así dos moléculas de ácido D-láctico y NAD+, el cual es reutilizado para que la ruta nuevamente se desarrolle. [24]
3.11 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES PARA CRECIMIENTO Y CULTIVO

Los integrantes de la familia Lactobacillaceae y por ende la cepa Lactobacillus delbrueckiie bulgaricus requieren de ciertos macro y micro-nutrientes para que los procesos metabólicos y de crecimiento realizados por este microorganismo se puedan llevar a cabo sin ningún inconveniente, ya que alguna falencia en la cantidad de nutrientes proporcionados a este ser vivo, puede conllevar a la interrupción parcial o total de procesos fisiológicos tales como la síntesis de proteínas estructurales, generación de lípidos para la membrana celular o procesos metabólicos como la división celular, respiración, fermentación, entre otros. [26].
Esta familia de bacterias presenta particularidades para cada especie respecto a los requerimientos nutricionales. Específicamente, la nutrición del Lactobacillus delbrueckii bulgaricus implica la presencia de carbohidratos fermentables (sólo metaboliza hexosas, como la glucosa), aminoácidos, nucleótidos, ácidos grasos, vitaminas, fósforo, potasio, magnesio, zinc, manganeso, sodio entre otros. Generalmente estos requerimientos variados suelen suplirse cuando el medio de cultivo de los lactobacilos contiene carbohidratos fermentables, peptona, extracto de carne y extracto de levadura, aunque una suplementación con jugo de tomate, acetato y ésteres del ácido oleico, especialmente Tween 80, resulta estimuladora y hasta esencial para muchas especies. Por eso, estos compuestos se incluyen en el medio MRS (Vea tabla 17). [27]

A continuación se realiza una breve explicación sobre la funcionalidad de estos nutrientes dentro del metabolismo del microorganismo:

Peptona o fuente de nitrógeno:
Es un término químicamente indefinido, usado para describir productos solubles en agua, obtenidos después de la hidrólisis enzimática o acídica de proteínas. Por esta razón, este componente contiene a su vez una mezcla de aminoácidos libres y polímeros de aminoácidos (péptidos) [28].
Específicamente, se ha demostrado que el nitrógeno es uno de los micronutrientes más importantes para mantener el metabolismo de este microorganismo. Los Lactobacillus utilizan nitrógeno en forma de amonio y aminoácidos durante la fermentación. Estas formas de nitrógeno orgánico son requeridas para la síntesis de ácidos nucleicos, aminoácidos, enzimas, proteínas estructurales, para el regeneramiento de la membrana celular y para la elaboración de otros metabolitos fundamentales. Experimentalmente se ha comprobado que niveles adecuados de nitrógeno en el medio de cultivo induce a que la fermentación (consumo de carbohidratos) se ejecute un 50% más rápido en comparación con medios que poseen niveles desadecuados de nitrógeno [26].
Extracto de Levadura:
El extracto de levadura es un extracto soluble en agua formado por el autolisado de células de levadura. Es un producto rico en vitaminas especialmente del complejo B, aminoácidos y otros factores de crecimiento. Como se puede observar, esta sustancia también aporta nitrógeno el cual es utilizado en las actividades metabólicas y de crecimiento de las formas ya descritas anteriormente. En lo que concierne a las vitaminas y los factores de crecimiento, éstos se encargan de promover el correcto funcionamiento fisiológico de la célula y el crecimiento normal de la biomasa.
D-Glucosa.
Este monosacárido representa en el medio de cultivo la fracción que le otorgará a la célula la energía química necesaria para poder desarrollar los procesos de división celular, las diferentes actividades fisiológicas y metabólicas (Fermentación). Por tanto, es fundamental que el microorganismo en cuestión disponga de suficiente "combustible" ya que esto de una u otra manera incide en la eficiencia de la reproducción de la biomasa y por ende en la realización del proceso fermentativo.
Extracto de malta.
Es una mezcla de azúcares naturales obtenida de la hidrólisis enzimática de la cebada malteada, que incluye polisacáridos (90%-93%) en los que hay presencia de glucosa, maltosa, entre otros; proteínas (3%-7%); cenizas (1%-2%) y grasa (0,1%) (4). De acuerdo a esta composición, este extracto representa fundamentalmente una fuente de carbohidratos para el lactobacillus, por tanto es una fuente adicional de energía, aunque también proporciona nitrógeno y micronutrientes a este microorganismo, los cuales desempeñaran a nivel celular las funciones descritas anteriormente.
Fosfato dipotásico, acetato de sodio, citrato de amonio, sulfato de magnesio y de manganeso.
Este grupo de moléculas, son las encargadas de dotar al microorganismo de los microelementos que a pesar de estar presentes en pequeñas cantidades en el medio de cultivo, cumplen funciones muy importantes tales como: Catalizan reacciones bioquímicas, son cofactores de crecimiento, se emplean en el anabolismo de moléculas específicas (enzimas, por ejemplo) y su presencia es fundamental a la hora de ejecutar determinadas funciones celulares.

3.12 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES PARA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO.

Los requerimientos nutricionales que exige el microorganismo Lactobacillus delbrueckii bulgaricus para que se pueda llevar a cabo la producción de ácido láctico no son diferentes a los que ya se han explicado en el apartado anterior, más sin embargo por cuestiones de costes de producción el caldo MRS ya no representa el origen del que la bacteria toma la fuente de carbono que requiere para realizar el proceso fermentativo, sino que se utilizarán desechos agrícolas provenientes de los cultivos bananeros (Cáscara de banano, rica en almidón)para dotar al microorganismo de dicha fuente de carbono. Como ya ha informado la literatura, este ser vivo sólo es capaz de metabolizar hexosas libres, por lo que antes se hace necesario llevar a cabo un procesos de hidrólisis acídica con el fin de transformar las grandes cadenas de amilosa y amilopectina en moléculas libres de glucosa, la cual corresponde a la fuente de energía que utilizará el Lactobacillus sp.
A continuación se precisan algunas consideraciones con respecto a la cantidad de biomasa y glucosa en el medio fermentativo, y su influencia en la producción de ácido láctico:
La producción de la fermentación láctica aumenta, si se incrementa el porcentaje de inóculo del microorganismo y se disminuye la concentración de glucosa y viceversa, si disminuye la concentración del inóculo y aumenta la concentración de glucosa, disminuye la producción. Esto se debe a que si aumenta la presión osmótica del sustrato, se produce un efecto inhibitorio en el crecimiento del microorganismo y por ende en la producción de ácido láctico [27].
En cuanto a la productividad de ácido láctico se observa en forma general, que esta aumenta a medida que se eleva la concentración de inóculo y de glucosa en el medio de fermentación [27].
Fig. 12.Gráfica de la producción de ácido láctico.Fig. 12.Gráfica de la producción de ácido láctico.
Fig. 12.Gráfica de la producción de ácido láctico.
Fig. 12.Gráfica de la producción de ácido láctico.


3.13 CRECIMIENTO CELULAR Y PRODUCCIÓN

Las cáscaras de banano son limpiadas y colocadas uniformemente en bandejas de aluminio, dentro de una estufa a una temperatura de 60ºC durante un prolongado tiempo (aproximadamente 10 horas) [31]. Posteriormente son pulverizadas en un molino industrial. Se procura que las cáscaras de banano se reduzcan a un tamaño de partícula entre 0.1 y 0.5 mm y posteriormente se realiza el método básico de eliminación de lignina; se toma la muestra pulverizada y se sumerge en una solución de NaOH 0.1N a los 15 minutos se adicionan 0.816 g. de sulfato de calcio y se deja en reposo por 3 horas, separando el material particulado de la solución [32]. La hidrólisis ácida se lleva a cabo adicionando 50 ml de ácido sulfúrico al 5% por cada 100 gramos de cáscara de banano, a una temperatura de 125°C y 15 psi, durante 15 minutos. Al hidrolizar la cáscara de banano se obtiene un jarabe de 20g/l, concentración que hace alusión a la cantidad de azucares reductores obtenidos. Este medio se complementa con fosfato dipotásico (K2HPO4), proteosa peptona N° 3 (10 g/l) como fuente de péptidos, aminoácidos y nitrógeno), extracto de carne (10g/l), extracto de levadura (5g/l), Sorbitán monoleato (1ml/l), acetato de Sodio (5g/l) y Sulfato de Magnesio (MgSO4) como medio de fermentación óptimo para la bacteria Lactobacillus bulgaricus. Además se debe ajustar el pH a un valor de 5,5.

La fermentación se realiza en erlenmeyers de 250 ml, con un volumen efectivo de trabajo de 50 ml (se inocula aproximadamente 0,5 g de liofilizado) en anaerobiosis a 48°C y 200 rpm, en un agitador orbital, por 24 horas [32].
En forma general, Lactobacillus delbrueckii bulgaricus es el microorganismo más utilizado en la producción a gran escala de ácido láctico, ya que tiene la ventaja de consumir eficientemente glucosa y ser un microorganismo termófilo con temperatura óptima de crecimiento que oscila entre los 37°C y 41.5°C, lo que reduce costes de enfriamiento y esterilización, así como riesgos de contaminación microbiológica en el fermentador [19]. Este bacilo no esporulado, crece efectivamente a un pH entre 5,3 y 6,5 por lo que el ácido producido debe ser continuamente neutralizado y, adicionalmente para potenciar el crecimiento de esta bacteria se requiere una atmósfera en la que la concentración de CO2 sea del 5%.

Su adaptación a diferentes condiciones ambientales se ve favorecida por la producción de acidez, que restringe el desarrollo de otros microorganismos. Es un microorganismo de rápido crecimiento con pequeños genomas, metabolismo simple y relevancia industrial.

Particularmente, la cepa probiótica Lactobacillus delbrueckii bulgaricus aislada del tracto intestinal de terneros (Bostaurus) alcanza un crecimiento máximo in vitro, cuando las condiciones de pH y de temperatura del medio de cultivo se ajustan a 5,31 y 39,38°C, respectivamente [18]. Por otro lado, el aumento en la concentración del inóculo inicial reduce significativamente el crecimiento de esta cepa en el medio de cultivo, sin embargo, a un 5% de concentración, se alcanza el valor máximo en lo que concierne al crecimiento de esta cepa en el cultivo. [14]
3.14 PRODUCCIÓN DE ACIDO POLILÁCTICO.
El Cargill Dow LLC ha desarrollado un proceso continuo y barato para la producción de polímeros a base de ácido láctico. El proceso comienza con una reacción de condensación continua del ácido láctico en medio acuoso para producir un prepolímero de bajo peso molecular. Posteriormente el prepolímero se convierte en una mezcla de estereoisómeros del lactido mediante una catálisis de estaño permitiendo una reacción intramolecular de ciclización más selectiva. La mezcla de lactido es entonces purificada mediante una destilación en vacío. Finalmente, el PLA de alto peso molecular se forma a partir del método ROP en presencia del catalizador de estaño. Este sistema elimina el uso costoso y contaminante de disolventes.
 
Fig. 13. Esquema de producción de PLA vía un prepolímero.
Se han evaluado muchos catalizadores para la polimerización de la lactida, incluyendo compuestos de metales de transición: - lata, aluminio, plomo, cinc, bismuto, hierro e itrio. Incluso bases fuertes tales como los alcóxidos. Dependiendo del sistema catalizador y de las condiciones de la reacción, estos tres mecanismos permiten explicar la cinética de la reacción de polimerización que puede tener lugar: catiónicos. Los comonomeros utilizados son la caprolactona, valerolactona, dioxipentona y carbonato trimetil....etc.
Los compuestos de estaño especialmente el ácido de bis-2-etilhexanoico (octoato de estaño), son los preferidos para la polimerización de la lactida debido a su solubilidad en la lactida fundida, alta actividad catalítica, e índice bajo de ramificación del polímero. Como resultados obtenidos son: conversiones del 90% y menos de 1% de ramificación proporcionando polímeros de elevado peso molecular.
La polimerización de la lactida usando la octoato de estaño ocurre generalmente vía un mecanismo de coordinación-inserción, con la apertura del anillo de la lactida y polimerización a ambos lados de la cadena.

Fig. 14. Transformación de láctida a PLA (Método ROP)
3.14.1 DISEÑO INDUSTRIAL PARA LA PRODUCCIÓN DE ACIDO LÁCTICO.

Teniendo en cuenta todo lo explicado anteriormente se puede realizar un esquema a nivel industrial, donde se detalle ya no las diversas reacciones químicas, sino el desarrollo a gran escala de la producción de ácido poliláctico.
Fig. 15. Producción de ácido poliláctico Fig. 15. Producción de ácido poliláctico
Fig. 15. Producción de ácido poliláctico
Fig. 15. Producción de ácido poliláctico
3.15 CONSIDERACIONES BIOÉTICAS DEL PROYECTO.
En el presente proyecto se busca fundamentalmente diseñar un mecanismo eficiente para la producción de ácido poliláctico, a través de un microorganismo ya mencionado anteriormente conocido como Lactobacillus delbruecki bulgaricus. Por ende se pretende desarrollar un proceso investigativo donde se detalle todos los factores y aspectos a tener en cuenta dentro de la elaboración del proyecto.
Aunque no se estima un valor neto del costo de la investigación, se espera que los fondos, equipamiento y materiales con los cuales se desarrolla este proyecto, provengan del aporte que realiza la Universidad Nacional de Colombia, a la sección de desarrollo de investigaciones.
Dentro de las consideraciones de la propiedad intelectual del proyecto, se estima que esta sea conjunta, entre la Universidad Nacional y los investigadores del presente proyecto, esto teniendo en cuenta el aporte económico que realiza esta institución, y el aporte humano que realizan los investigadores para llevar a cabo este proyecto.
Esta investigación según la clasificación del comité de ética en investigación de la Universidad Nacional, se encuentra en el grupo 3, "investigación con microorganismo", y dentro del subgrupo, "Proyectos que incluyan experimentación con microorganismos que se hayan reportado como no patógenos al hombre y de manipulación libre".
Este proyecto si requiere la colecta de muestras vegetales, entre ellas están la biomasa residual provista por la cascara de banano, la cual es despreciada o arrojada por no cumplir estándares de calidad, sumado a lo anterior también se va a utilizar bien se una muestra de lácteos, o una muestra del intestino del ternero.
En primer lugar la cascara se va a colectar, en diferentes partes de toda Colombia, con el objetivo de aprovechar toda la materia prima, mas sin embargo como fuente inmediata, se ha planeado el valle de Aburra, y los puertos cercanos a la zona de Medellín, el microorganismo se puede obtener se manera más sencilla, pues se podría encontrar en un yogurt casero, o en su defecto en fincas aledañas donde exista producción de ganado.
El lugar donde se realizaran las manipulaciones del microorganismo, es en los laboratorios de la universidad Nacional de Colombia, cabe recalcar que estos espacios cuentan con las normas e instalaciones de bioseguridad adecuadas para el manejo del organismo.
Por último se tiene planeado que los residuos que se generen en el proyecto, los cuales no son muchos, se dispongan de manera segura, y de la forma correcta.

4.-DISCUSIÓN

La industria bananera de exportación en Colombia genera una importante cantidad de biomasa residual denominada banano de rechazo, que se caracteriza principalmente porque no se exporta, está concentrado en las empacadoras de fruta y representa un volumen importante. Actualmente una tercera parte de la fruta que no se exporta se destina al consumo interno como fruta fresca, otra tercera parte se emplea como sustrato en la producción de fertilizantes orgánicos (compost) para el cultivo de la misma fruta y, una tercera parte continúa considerándose como residuo. Son precisamente estas últimas 2/3 partes del residuo las que potencialmente se pueden usar en la producción de bioplásticos.

Como el objetivo fundamental del presente proyecto es la producción alternativa de bioplásticos (ácido poliláctico), se conoce de un grupo de bacterias lácticas que generan ácido láctico, el cual es el directo precursor del bioplástico en mención. Dentro de este grupo se encuentra Lactobacillusdelbrueckiibulgaricus, el cual es el microorganismo más utilizado en la producción a gran escala de ácido láctico.

La bacteria Lactobacillusdelbrueckiibulgaricus tiene forma de bacilo y no posee las capacidades de movilizarse o formar esporas. Su pared celular está compuesta por un capa resistente, denominada peptidoglicano, la cual provoca que se considere Gram-positiva. Comúnmente se encuentran formando cadenas. Estos organismos unicelulares y procariontes, pueden adaptarse para crecer y metabolizar tanto en presencia como en ausencia de oxígeno; además producen únicamente al isómero D (+) del ácido láctico, convirtiéndose en un microorganismo fermentador versátil y eficiente. A través de la microscopía óptica de barrido se puede evidenciar que la bacteria posee un tamaño de 1-3mm, un aspecto untuoso, color blanco crema, borde dentado y elevación plana.

Es de suma importancia aclarar que no siempre las condiciones de crecimiento y las que se requieren para producir el producto de interés son las mismas y este caso es uno de ellos. Por un lado, ya se ha nombrado que el crecimiento del Lactobacillus delbrueckii bulgaricus mejora en una atmósfera aeróbica con un porcentaje de CO2 entre 5 y 10%. Sin embargo, la ruta metabólica que desarrolla esta bacteria, no sólo requiere de una fuente de carbono para iniciarse sino que para completarse es fundamentalmente necesario que el medio sea completamente anaerobio, ya que con esto se asegura que al producirse el piruvato luego de culminar la ruta de Embden-Meyerhof, éste sea transformado en ácido D- láctico y, de esta manera se evite que el mismo entre a un ciclo de transformación aeróbico (recordemos que esta bacteria es facultativa).

La cáscara de banano posee un contenido de almidón, celulosa y hemicelulosa que representan más del 80 % de la cáscara posicionándola como una excelente fuente de carbono.

Debido a que el microorganismo fermentador usado en el actual proyecto sólo degrada glucosa y no almidón, el cual es el polisacárido más abundante de la fuente de carbono escogida (banano), se hace necesaria la ejecución de un proceso extra que permita el paso de almidón a glucosa digerible por la bacteria. Inicialmente se había planteado realizar una hidrolisis enzimática, pero debido a que éste proceso requiere la compra de enzimas (α-amilasa, β-amilasa y glucoamilasa), implicando mayores costos y mayor cantidad de tiempo en la producción del PLA, se ha optado por la hidrólisis ácida de la cascara de banano que permite la generación de azucares reductores y que sólo involucra el uso de ácido sulfúrico.

Al hidrolizar la cáscara de banano se obtiene un jarabe de 20g/l, ésta baja concentración se debe posiblemente a que al realizar la eliminación de lignina se pierden azúcares solubles, además de solubilizar parte de la celulosa con la lignina y probablemente realizar una hidrólisis básica del almidón.

Para la poli-condensación del ácido láctico a nivel experimental, se encontró que se emplea un balón de fondo redondo con 100 mL de ácido láctico obtenido de la fermentación, conectado a un condensador y un termómetro. Se agrega zinc al ácido láctico y se elimina el agua de la solución mediante calentamiento. Se aumenta la temperatura gradualmente y se adecúa el montaje para imprimirle vacío, reduciendo gradualmente la presión hasta 100 mmHg. Se mantiene la reacción hasta que el agua está presente nuevamente, momento en el cual la presión del sistema se lleva hasta 25 mmHg y se continúa con estas condiciones durante el tiempo de reacción de 24 horas. Luego se retira el balón y se envasa el producto para dejarlo enfriar [21].

El ácido poliláctico (PLA) obtenido se puede caracterizar por espectroscopia de infrarrojo y por calorimetría diferencial de barrido (DSC).

5. CONCLUSIÓN
Mediante el presente trabajo se puede concluir que la fuente de energía más óptima para realizar el proyecto es el banano, esto debido a que las características de producción, transporte y demás dieron como resultado que esta opción es la más adecuada desde el punto de vista financiero.

Mediante el presente informe se puede concluir que para producir ácido poliláctico se requiere de un microorganismo productor de ácido láctico, ya que de este último se obtiene el ácido poliláctico mediante la polimerización, el cual para este caso es el Lactobacillus delbrueckii bulgaricus, el cual gracias a sus características y propiedades brinda la capacidad de producir el sustrato que se necesita, para el proyecto de una forma eficaz.

A partir del presente proyecto se puede concluir que es de gran importancia ofrecerle al microorganismo un medio de crecimiento óptimo, con todos los componentes necesarios, además de tener presente, que se debe procurar mantener las condiciones ambientales necesarias para no inhibir el crecimiento de la bacteria a trabajar.

Por medio del presente proyecto se puede concluir que la bacteria a trabajar, mediante su metabolismo característico no solo genera el producto de interés, sino también productos distintos, los cuales impiden la recolección efectiva del producto.

5.- AGRADECIMIENTOS
Se presentan agradecimientos a la Facultad de Minas de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín, por su valiosa contribución en el préstamo y equipamiento de los laboratorios para la realización de las diversas experimentaciones, así como a las recomendaciones de la docente tutora del proyecto Ángela Adriana Ruiz Colorado.

6.- BIBLIOGRAFÍA
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[16]Moreno, Y. Aplicación de fluorocromos para el estudio de la viabilidad de las Bacterias Ácido Lácticas (BAL) presentes en productos lácteos. Departamento de Biotecnología, Universidad Politécnica de Valencia.

[17] Quillama, E., Liendo, N. (1995). "Aislamiento e identificación de bacterias lácticas" Boletín de Lima N°100. Vol. XVII. Pag: 171-180.

[18] De Man, J.C., Ragusa, M. and Sharpe, M.E. (1960).A Medium for the Cultivation of Lactobacilli. J. Appl. Bacteriol.

[19] MacFaddin. 1985. Media for isolation-cultivation-identification maintenance of medical bacteria, vol. 1.Williams & Wilkins, Baltimore, Md.

[20] Ávila, José; Ávila, Manuel; Tovar, Belkis; Brizuela, María; Perazzo, Yurimaua y Hernández, Helis. 2010. Capacidad probiótica de cepas del género Lactobacillus extraídas del tracto intestinal de animales de granja.

[21] Lacroix, Christophe and Yildirim, Selcuk.2007. Fermentation technologies for the production of probiotics with high viability and functionality.CurrentOpinion in Biotechnology. Pag. 176-183.

[22] QUIMICANET. [En Línea] http://www.quiminet.com/productos/caldo-mrs-lactobacilli-44300226324/precios.htm
[23]FERMENTACIONES MICROBIANAS. [En línea] http://www.unac.edu.pe/documentos/organizacion/vri/cdcitra/Informes_Finales_Investigacion/Octubre_2011/IF_DECHECO%20EGUSQUIZA_FIPA/CAPITULO%20N%BA%2002.pdf
[24] HIPERTEXTOS DEL ÁREA DE BIOLOGÍA. [En línea]http://www.biologia.edu.ar/metabolismo/met4.htm#lactico
[25] HIPERTEXTOS DEL ÁREA DE BIOLOGÍA. [En línea] http://www.biologia.edu.ar/metabolismo/met3glicolisis.htm
[26] FRATELLI PASINI. [En Línea] http://vinospasini.blogspot.com/2012/02/importancia-del-nitrogeno-para-las.html
[27]Bonilla M, Guarín C, Marín R. "Obtención de ácido láctico por fermentación con Lactobacillus delbrueckii bulgaricus". [En línea] disponible en: http://www.ciencias.unal.edu.co/unciencias/data-file/farmacia/revista/V23P18-24.pdf
[28]Peptonas e hidrolizados. [En línea] http://www.ms.gba.gov.ar/sitios/laboratorio/files/2012/08/PEPTONAS-E-HIDROLIZADOS.pdf

[29] MALTEXCOFOOD. [En Línea] http://www.maltexcofood.com/esp/extracto_malta.html


[30] MEDIOS DE CULTIVO. [En línea] http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/mrscaldo.htm

[31] Medina J., García F., Paricaguan b. et al, (2014) "Obtencion de ácido láctico por fermentación del mosto del fruto de cují (prosopis juliflora) y su posterior poli-condensación con zinc metálico a poli (ácido láctico) (pla)" Revista Ingeniería UC, Vol. 21, No. 2.Pag 52 – 59

[32] Monsalve J., Medina V., Ruiz A. (2006). "Producción de Etanol a partir de la cáscara de banano y de almidón de yuca" DYNA. Vol. 73, Núm. 150. Pag 21-27.