Bases Fisiológicas del Aprendizaje y la Memoria

Bases Fisiológicas del Aprendizaje y la Memoria

William James (1890): “When two elementary brain-processes have been active together or in immediate succession, one of them, on reoccurring, tends to propagate its excitement into the other.”

Santiago Ramón y Cajal (~1890): Los procesos de aprendizaje y memoria son mediados por cambios en la estructura de las conexiones sinápticas.

Donald O. Hebb (1949) “When an axon of cell A is near enough to excite a cell B and repeatedly or persistently takes part in firing it, some growth process or metabolic change takes place in one or both cells such that A's efficiency, as one of the cells firing B, is increased. “ C

B

A

Formación de Engramas

“Let us assume that the persistence or repetition of a reverberatory activity (or "trace") tends to induce lasting cellular changes that add to its stability” (Hebb, 1949)

Aprendizaje: Modificación de una conducta anterior o adquisición de una nueva conducta, debido a la experiencia. La posibilidad de evocar posteriormente esta nueva conducta, al recrear las condiciones en las que ésta fue aprendida, indica que se formó una memoria.

Plasticidad Sináptica:

Cambios en la eficiencia sináptica (potenciación o depresión de la función sináptica) producidos por ciertos patrones de actividad sináptica.

PLASTICIDAD SINÁPTICA

APRENDIZAJE Y MEMORIA

Hipótesis: Durante un proceso de aprendizaje se producen cambios plásticos en la eficiencia de las sinapsis (en los circuitos neuronales involucrados), inducidos por actividad sináptica intensa. Estas modificaciones y su persistencia en el tiempo constituyen, al menos en parte, la base fisiológica del aprendizaje y la memoria.

AUNQUE...propiedades eléctricas intrínsicas también se modifican!

The human brain has...  ~1011 Neurons  ~104 Synapses per nerve cell (some neurons, e.g. Purkinje cells, form even >100,000 synaptic contacts)  in total ~1015 synapses  ~109 synapses per mm3  wiring (axons) of about 106 km length  a typical synapse has the size of E. coli bacterium Diap E Gundelfinger

E. Gundelfinger

Plasticidad Sináptica:

Cambios en la eficiencia sináptica (potenciación o depresión) generados por la misma actividad sináptica. Efectos de corta duración: ms - min

Efectos de larga duración: horas – semanas - años

Plasticidad sináptica de corta duración: Estos fenómenos involucran modificaciones transitorias en canales de iones y en sistemas de mensajeros secundarios.

Plasticidad sináptica (y memoria) de larga duración: Requiere de síntesis de proteínas y cambios estructurales en las conexiones sinápticas.

Registro en rebanadas de cerebro

Preparación de rebanadas de cerebro de rata Rebanadas de 300-500 mm de espesor

Hipocampo Esta preparación permite realizar registros electrofisiológicos en neuronas que conservan su conectividad intacta

¿Cómo se registran los potenciales sinápticos?

registro intracelular

I-clamp

5 mV 10 ms EPSP: “excitatory postsynaptic potential”

V-clamp

También es posible registrar las corrientes postsinápticas: EPSC: ¨excitatory postsynaptic current” Vhold= -60 mV

5 mV 10 ms

registro extracelular

5 mV 10 ms

registro extracelular

decenas-cientos de µV

En regiones con alta densidad de neuronas ordenadas en capas, como el hipocampo o la corteza, se registra un potencial sináptico de campo o field EPSP (fEPSP), que puede tener una amplitud de unos pocos mV fEPSP: “field excitatory postsynaptic potential”

Registro de potenciales sinápticos: EPSP

5 mV 10 ms

1 mV fEPSP

Plasticidad sináptica de corta duración (seg – min), conceptos generales

Ejemplo de plasticidad de corta duración: Facilitación de Pulsos Pareados (Pair Pulse Facilitation, PPF)

0.4 mV 10 ms

Δt = 50 ms

Registro de potenciales sinápticos de campo (fEPSP) en rebanadas de hipocampo de rata

Facilitación de Pulsos Pareados Pair Pulse Facilitation (PPF)

Matthews, 2001

Facilitación, aumentación, potenciación post-tetánica:

Son causados por acumulación de calcio en el terminal presináptico.

Depresión sináptica de corta duración: mecanismos implicados se localizan en terminales presinápticos Disminución del pool de vesículas rápidamente liberables

Inhibición por Ca2+ de canales de Ca2+ Activación de canales de K+ activados por Ca2+

Activación de receptores presinápticos acoplados a proteína G (modulación de canales dependientes de voltaje): a) Autorreceptores. b) Circuito multisináptico de retroalimentación negativa.

Matthews, 2001

Diferentes tipos de modificaciones presinápticas (potenciación o depresión): 1. Acumulación de calcio presináptico puede producir: a) Efecto directo sobre la liberación de vesículas (pool de liberación rápida). b) Alteraciones en el reciclaje de vesículas. c) Modulación de canales de iones. 2. Activación de receptores acoplados a proteína G presinápticos: a) Modulación de canales de iones.

Conexión con Aprendizaje y Memoria: Trabajos en invertebrados (E. Kandel)

Aplysia californica

Ejemplos de aprendizaje relacionados con dos conductas reflejas en Aplysia: Habituación: reducción en la respuesta a un estímulo inocuo que se repite. Sensibilización: aumento de la respuesta producido por un estímulo intenso (estímulo sensibilizante)

Reflejo sifón - branquia

Estímulación táctil del sifón (estímulo neutro para el animal) produce la contracción de la branquia

Reflejo cola - sifón

Estímulación táctil de la cola (estímulo doloroso para el animal) produce la contracción de la cola y branquia

Reflejo sifón - branquia

Habituación: Después de varios estímulos, la respuesta deja de expresarse.

Reflejo cola - sifón

Sensibilización: Al aplicar un estímulo intenso en la cola, un posterior estímulo sobre el sifón produce la retracción de la cola y branquia. Esto ocurre incluso cuando previamente se ha inducido habituación.

Circuito neuronal involucrado en la generación del reflejo sifón–branquia:

Circuito neuronal involucrado en la generación del reflejo sifón–branquia:

20 mV 100 ms

Registros intracelulares in vivo

Registro simultáneo de neurona sensitiva y motoneurona EPSP inducido en neurona motora 24 neuronas sensitivas

3 interneuronas

6 motoneuronas

Estimulación induce descarga en neurona sensitiva

Habituación Luego de 10 estímulos táctiles sobre el sifón

Una sesión de 10 estímulos táctiles: Habituación de corta duracion (min).

4 sesiones de 10 estímulos, separadas por horas: Habituación de larga duración (semanas).

¿Mecanismo de la habituación?

Registro de las respuestas sinápticas en motoneuronas durante la estimulación repetida de las neuronas sensitivas en régimen de baja probabilidad de liberación de neurotransmisor:

neurona motora neurona sensitiva

Castellucci y Kandel (1974) realizan análisis de liberación cuántica de neurotransmisor

Ejemplo: Análisis de liberación cuántica de neurotransmisor (bajo calcio extracelular), en la placa neuromuscular: Análisis de epp:

Análisis de mepp (cuantas):

i=

0

1

2

3

Se determina: - El tamaño cuántico (q): potencial sináptico promedio producido por la liberación espontánea de una vesícula. - El contenido cuántico (m): nro. Promedio de vesículas liberadas por estimulación del nervio.

Liberación Cuántica de Neurotransmisor

“q” o = tamaño cuántico (amplitud promedio del potencial sináptico generado por la liberación espontánea de una vesícula) m = contenido cuántico (número promedio de cuantas liberados por impulso)

Determinación experimental de q y m (resumen): A. El valor de q se estima a partir del primer pico del histograma de amplitudes o del valor promedio de los minis (mepp o mEPSP). B. El valor de m puede determinarse de las siguientes maneras: a) De la expresión

m = /q

b) De la probabilidad de fallos:

m = ln(1po)

c) Del coeficiente de variación.

m = 1/(CV)2

El análisis estadístico mostró que, durante la habituación: - q no cambia. - m disminuye progresivamente.

4 sesiones de 10 estímulos

Habituación de larga duración (días).

Sensibilización: aumento en la respuesta a un estímulo táctil (inocuo) después de la exposición a un estímulo intenso (doloroso).

Modelo propuesto para el mecanismo de la sensibilización:

S-type K channels

Sensibilización de larga duración inducida por estimulación repetida de la cola

La generación de esta memoria de largo plazo requiere de transcripción génica y síntesis de nuevas proteínas. Uno de los resultados es la activación constitutiva de PKA y la fosforilación persistente de sus blancos: canales iónicos y otras proteínas involucradas en el crecimiento de nuevas conexiones sinápticas.

Cambios estructurales asociados a habituación y sensibilizacion de larga duración en Aplysia

Plasticidad sináptica de larga duración en el cerebro de mamíferos

Transmisión sináptica excitatoria en sinapsis centrales

Micrografía electrónica y diagrama de zona activa y densidad postsináptica (DPS) de sinapsis glutamatérgica central

Receptores de Glutamato

Principales receptores ionotrópicos postsinápticos en corteza e hipocampo

El receptor de NMDA (NMDAR)

Bloqueo por Mg2+ dependiente del potencial:

El canal conduce cuando existe despolarización pre y postsináptica

Corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs) registradas a distintos potenciales de membrana (V-clamp)

Las dos componentes de las EPSCs pueden separarse utilizando agentes famacológicos (CNQX: inhibidor de corrientes AMPA)

CNQX

control

peak (control)

AP5 o APV bloquea las corrientes tipo NMDA (componente tadía dependiente del potencial)

APV

control

peak

Esquema del hipocampo de rata (sección transversal) y del circuito tri-sináptico

Bliss y Lomo (1973) inducen por primera vez potenciación de larga duración (LTP) en el hipocampo (in vivo).

Potencial sináptico de campo (fEPSP)

Ubicación de electrodos de registro (Rec) y estimulación (Stim).

Potenciación de Larga Duración (LTP)

“Condicionamiento”: 10-20 Hz, 15 s o 100 Hz, 3 - 4 s, inducen potenciaciones que duran 30 min – 10 h

Preparación de rebanadas de cerebro

fEPSP

0.5 mV 5 ms

Norm. EPSP

200 150 100 50

100 Hz, 1s 0 0

40

80

120

160

Time (min)

Se estimulan dos vías sinápticas independientes, en una de ellas se induce plasticidad dependiente de actividad y la otra se utiliza como control.

Long term potentiation (LTP)

La LTP puede durar horas (rebanadas) y hasta meses (in vivo).

Mecanismo de la LTP??? Purves 2001

Coincidencia de estímulo présinaptico y despolarización de célula postsináptica genera LTP

Matthews, 2001

Registro en CA1, estímulo en colaterales de Schaeffer

(-80 mV)

Pareamiento de estímulos pre y post sinápticos (inyección breve de corriente).

LTP inducida por un único burst de 4 estímulos (100 Hz), aplicados durante un máximo de la onda theta del potencial de campo inducida por agonistas colinérgicos.

Huerta and Lisman, 1995

Participación de receptores NMDA en la inducción de LTP

AP5 (o APV), inhibidor de receptores NMDA

Norm fEPSP Slope

200

150

100

20

40

min

60

Calcio participa en la inducción de LTP 100 Hz Célula de CA1 inyectada con Fura 2, estímulos de 100 Hz en presencia o no de APV, bloqueador de NMDARs

Hay entrada de calcio a través de NMDARs ubicados cerca de la zona estimulada.

Otros experimentos: Si se inyecta BAPTA o EGTA NO se produce LTP

Transmisión sináptica normal (o basal)

Receptores de NMDAR: Detectores de coincidencia

Plasticidad Sináptica

Propiedades de la LTP

Efectos del aumento localizado de calcio en espinas

Derkach et al, 2007

Participación de quinasa dependiente de Ca2+/calmodulina (CAMKII) en inducción de LTP

CaMKII (273-302): inhibidor de CaMKII

Inyección postsináptica de CaMKII constitutivamente activa

•Registros de patch-clamp en dendritas de células piramidales de CA1 (Vm = -70 mV).

•Electrodo de estimulación a 20-40 um de la dendrita: sólo unas pocas sinapsis son activadas.

Benke et al, 1998. Nature 393:793-7

Análisis de ruido de corrientes macroscópicas:

Análisis de ruido de las corrientes de tipo AMPA: Antes la inducción de LTP:

Ver leyenda adjunta

Benke et al, 1998. Nature 393:793-7

Análisis de ruido de las corrientes de tipo AMPA: efecto de LTP

60% de las neuronas

40% de las neuronas

Benke et al, 1998

Otros trabajos: La fosforilación por CaMKII de la subunidad GluR1 de los receptores AMPA aumenta su conductancia de canal único (Derkach et al, 1999).

Estimulación tetánica induce aumento de receptores AMPA en espinas dendríticas

Se expresa subunidad GluR1 con marcador fluorescente

Shi et al, (1999). Science 284:1811

Sobreexpresión de GluR1: “marcador electrofisiológico”

hetero-oligómeros

homómeros (GluR1)

Shi et al, (1999). Science 284:1811

Expresión de una forma constitutivamente activa de CaMKII junto con GluR1 aumenta la transmisión sináptica por inserción de receptores AMPA que contienen la subunidad GluR1.

Transmisión sináptica aumentada en células infectadas

Rectificación aumentada en células infectadas

Hayashi et al, (2000)

Vías regulada y constitutiva para la inserción de receptores en las sinapsis

LTP: También hay inserción de homómeros de GluR1

Depresión de larga duración (LTD)

Esteban, 2005

Movimiento de 1 subunidad GluR2

Derkach et al, 2007

Borgdorff y Choquet, 2002

Derkach et al, 2007

Yang et al, 2008

Tyrosine kinases

Fases de la LTP LTP temprana (E-LTP)

1 x (100 Hz, 1 s)

LTP tardía (L-LTP)

4 x (100 Hz, 1 s)

Anisomicina: inhibidor de la síntesis proteica

Actinomicina D: inhibidor de la trascripción

Fases de la LTP LTP temprana (E-LTP)

LTP tardía (L-LTP)

1 x (100 Hz, 1 s)

4 x (100 Hz, 1 s)

Anisomicina: inhibidor de la síntesis proteica Actinomicina D: inhibidor de la trascripción

LTP temprana no requiere de transcripción génica ni síntesis de proteínas, contrariamente a LTP tardía.

LTP tardía (L-LTP)

transcripción

Induction of LTP

MAPK PKA Tyrosine kinases

síntesis local de proteínas

síntesis de proteínas

Blitzer, 2005. Review

Proteína quinasa A, fosforila a un inhibidor de PP1. Proteína fosfatasa 1 (PP1), desfosforila a CaMKII, GluRs, entre otros

PKA actúa como “compuerta” para la inducción de LTP tardía

Algunas proteínas sintetizadas después de inducción de LTP: • CaMKII • Factores de elongación • GluR1 • BDNF (brain derived neurotrophic factor)

transcripción génica (vía CREB) y síntesis de nuevas proteínas

Estructura y regulación de la CAMKII

Lisman et al, 2002. Nature Rev. Neurosci 3:175-190.

Distintos niveles de activación de CAMKII con distintos niveles de calcio. Persistencia del estado activado

Sin autofosforilación: ~1 s

Densidad postsináptica (DPS)

Lisman et al, 2002

Después de inducir LTP, la autofosforilación se mantiene por al menos 8 hrs.

CaMKII es la proteína más abundante en las DPS, donde se une al NMDAR, a proteínas de andamio y a elementos del citoesqueleto, en una forma que depende complejamente de su estado de activación y/o autofosforilación. NMDAR

Después de inducir LTP, aumenta la cantidad de CaMKII en espinas y DPS.

Curr Op Neurobiol 14: 318-327, 2004

Deleción del sitio de autofosforilación de CaMKII inhibe la LTP y afecta el aprendizaje

Ver leyenda adjunta

Curso temporal de las modificaciones en CaMKII y receptores AMPA después de la inducción de LTP

Colbran and Brown, 2006

Posibles mecanismos de potenciación de la transmisión sináptica por CaMKII:

Lisman et al, 2002

LTP temprana (E-LTP)

1 x (100 Hz, 1 s)

LTP tardía (L-LTP)

4 x (100 Hz, 1 s)

Cómo es que se mantiene la especificidad de la L-LTP???

Inhibidor de síntesis proteica

Si se aplica 1 tétano, se observa algo similar

Inhibidor de síntesis proteica

Si se aplica 1 tétano, se observa algo similar

Inhibidor de sintesis proteica

Si se aplica 1 tétano, se observa algo similar

Normalmente se induce sólo E-LTP con un tétano. Sin embargo, si éste se aplica después de inducir LTP en otra vía, 1 tétano basta para inducir L-LTP.

Evidencia en favor de la existencia de un “synaptic tag”: Frey and Morris, 1997

Inhibidor de síntesis proteica

Si se aplica 1 tétano, se observa algo similar

Normalmente se induce solo E-LTP con un tétano. Sin embargo, si éste se aplica después de inducir LTP en otra vía, 1 tétano basta para inducir L-LTP.

tag

Hipótesis de la existencia de un tag, supone que: - La producción de macromoléculas es dependiente de la síntesis de proteínas. - La generación del tag es independiente de la síntesis de proteínas.

Evidencia de síntesis de proteínas en dendritas:

-Presencia de poliribosomas, retículo endoplásmico y elementos de Golgi en dendritas y espinas. -Inducción de LTP y síntesis de proteínas en dendritas aisladas del soma. -Se ha observado transporte de gránulos de mRNA hacia dendritas y espinas después de inducción de LTP.

(Review: Kelleher et al, 2004).

BDNF induce síntesis local de proteínas en dendritas aisladas del soma

GFP: reportero de síntesis proteica

Aakalu et al, 2001

Retículo Endoplásmico (ER) dendrítco y el aparato de la espina (SA)

Hanus and Ehlers, 2008

El aparato de la espina

1 mm

sinaptopodina 1 mm

Jedlicka et al, 2008

Jedlicka et al, 2008

El Aparato de Golgi neuronas

Hanus and Ehlers, 2008

Cultivos neuronales Lu et al, 2008

(Review:Kelleher et al, 2004).

Schuman et al, 2006

Bramhan & Wells, 2007

Liberación de BDNF durante E-LTP y L-LTP

Lu et al, 2008

1x100 Hz o

1x100 Hz o

Lu et al, 2008

Lu et al, 2008

Depresión sináptica de larga duración (LTD) en CA1 Se induce en las sinapsis de col. de Schaeffer con CA1, pero mediante estimulación de “baja” frecuencia: 1 Hz, durante15 min)

Bear and Dudek, 1993

Depresión de larga duración: LTD (Hipocampo) Inducción de LTD también requiere la activación de receptores de NMDA

Inyección postsináptica de BAPTA o EGTA bloquea LTD

Ac Okadaico: inhibe fosfatasas PP1 y 2A PP1 se activa por defosforilación de un inhibidor

Dependiendo de la frecuencia de estimulación presináptica, se puede inducir LTP o LTD en las mismas sinapsis

Bear and Dudek, 1993

Inducción diferencial de LTP o LTD? Posibles factores que inciden en la activación diferencial de una u otra vía: • Magnitud y cinética de los cambios en la concentración de calcio (las fosfatasas dep de calcio tienen menor afinidad por este ion que las kinasas). • Activación de diferentes subunidades de receptores de NMDA (NR2A, NR2B)? Problema: no existen inhibidores específicos.

En las dendritas también hay canales dependientes del potencial. Existe propagación retrógrada de potenciales de acción desde el soma-axón hacia las dendritas.

Popagación retrógrada de Pot. Acción

dendrita apical

Axón no se muestra

Diferentes canales en dendritas

Plasticidad hebbiana inducida por descarga casi simultánea de células pre y postsinápticas. STDP: Spike timing dependent plasticity

Se induce LTP o LTD, dependiendo del orden de las descargas (pre y post)

Estimulación tetánica

STDP

0-100 ms

0-20 ms