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ORIGINALES BREVES Baja prevalencia del polimorfismo Leu7Pro en el péptido señal del preproneuropéptido Y en la población mediterránea española
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Olga Portolésa,b, José Vicente Sorlía, José Ignacio Gonzáleza, Salvador Ruiz de la Fuentea, Judith Begoña Ramíreza y Dolores Corellaa a
Unidad de Epidemiología Genética y Molecular. Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública. Universitat de València. València. b Unidad Mixta de Investigación. Hospital Clínico Universitario. València. España.
FUNDAMENTO Y OBJETIVO: Un polimorfismo común, Leu7Pro, en el péptido señal del neuropéptido Y se ha asociado con concentraciones elevadas de colesterol y arteriosclerosis en Finlandia. Nuestro objetivo fue estimar la prevalencia de dicho polimorfismo en la población española. PACIENTES Y MÉTODO: Se ha realizado un diseño transversal en 1.000 individuos procedentes de población mediterránea española. Se estudiaron dos muestras independientes compuestas por 486 individuos (muestra 1) y por 514 (muestra 2). Se determinó el polimorfismo Leu7Pro. RESULTADOS: Sólo se detectó un individuo portador de la variante Leu7Pro (0,1%). La frecuencia alélica para el alelo Pro7 en la población estudiada fue extremadamente baja: 0,005 (intervalo de confianza del 95%, 0,0001-0,0015). CONCLUSIONES: Esta bajísima prevalencia indica que el alelo Pro7 no es un importante factor genético determinante de obesidad, lípidos plasmáticos o alcoholismo en esta población. Palabras clave: Neuropéptido Y. Polimorfismos. Obesidad. Lípidos.
Low prevalence of the Leu7/Pro polymorphism in the signal peptide of preproneuropeptide Y in the Spanish Mediterranean population BACKGROUND AND OBJECTIVE: A common Leu7Pro polymorphism in the signal peptide of neuropeptide Y has been associated with increased plasma cholesterol and accelerated atherosclerosis in the Finnish population. SUBJECTS AND METHOD: A cross-sectional design was carried out in 1,000 individuals from the Mediterranean Spanish population to estimate its prevalence. Two independently collected samples consisting of 486 subjects (sample 1) and 514 subjects (sample 2) were studied. The Leu7Pro polymorphism was determined. RESULTS: We found only one individual carrying the Leu7Pro variant (0.1%). The allele frequency of the Pro7 allele was extremely low: 0.005 (95% CI,0.0001-0.0015). CONCLUSIONS: This low prevalence suggests that the Pro7 allele is not one of the genetic determinant factors affecting obesity, plasma lipids or alcoholism in this population. Key words: Neuropeptide Y. Polymorphisms. Obesity. Lipids.
Correspondencia: Dra. Olga Portolés. Departamento de Medicina Preventiva. Facultad de Medicina. Avda. Blasco Ibáñez, 15. 46010 Valencia. España. Correo electrónico:
[email protected] Recibido el 8-10-2002; aceptado para su publicación el 5-12-2002.
Desde su descubrimiento en 1982, el neuropéptido Y (NPY) ha sido implicado en la regulación de la saciedad y, recientemente, en los sistemas endocrino y cardiovascular1,2. Sintetizado en el núcleo arcuato, y expresado extensamente en el cerebro, el NPY es el principal neuropéptido con efecto anabólico. La administración central de NPY en ratones induce el almacenamiento de grasa y estimula el consumo de alimentos, inhibe también la termogénesis en el tejido adiposo marrón, descendiendo el gasto energético y favoreciendo el desarrollo de obesidad1. Debido a estos importantes efectos, el gen del NPY, localizado en el cromosoma 7q15.1, se ha considerado un importante gen candidato en la etiología de la obesidad en humanos. Tiene un tamaño aproximado de 8 kilobases y comprende 4 pequeños exones, separados por tres intrones. Este gen codifica una proteína precursora, el preproneuropéptido Y. Karvonen et al3, con el objeto de identificar variantes genéticas relacionadas con la obesidad, realizaron un cribado completo de la región codificante del NPY, y describieron por primera vez una importante variación polimórfica en su secuencia, presente en el 14% de los finlandeses. Ésta consistía en un cambio de una timidina por una citosina (T1128C) que da lugar a una sustitución de leucina por prolina en la posición 7 (Leu7Pro) del preproneuropéptido Y. El preproneuropéptido Y es un péptido de 96 aminoácidos, de los cuales 28 constituyen el péptido señal en el extremo N-terminal, y 32 constituyen el péptido C-ponderal en el otro extremo. El péptido señal dirige al preproneuropéptido Y al interior del retículo endoplásmico, en el cual el péptido señal se elimina y el restante proneuropéptido Y sufre modificaciones posteriores por varias enzimas hasta dar el NPY maduro3,4. La estructura secundaria y terciaria del péptido señal puede verse profundamente alterada por la sustitución Leu7Pro, lo que confiere una gran funcionalidad a este polimorfismo. Kallio et al4 hallaron la primera evidencia directa de las consecuencias funcionales de di-
cho polimorfismo resultando en una producción y liberación más eficiente de NPY. Los individuos con la variante Pro7 presentarían una superproducción de NPY, llegando a incrementarse en un 42% sus concentraciones plasmáticas en comparación con los homocigotos Leu7/Leu7. Además, este mismo grupo planteó que el NPY podría ser el nexo de unión entre la obesidad y el metabolismo lipídico, asociándose la variante mutada con concentraciones más elevadas de colesterol total, de colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad (c-LDL) o de triglicéridos2,3,5. Considerando los importantes resultados obtenidos en Finlandia, nuestro grupo se planteó estudiar el impacto de dicho polimorfismo en las concentraciones plasmáticas de lípidos y en el desarrollo de obesidad en población española. Como paso previo, nuestro objetivo fue conocer la prevalencia del polimorfismo Leu7Pro en la población mediterránea española. Pacientes y método Pacientes y diseño del estudio Se ha realizado un estudio transversal en dos muestras aleatorias independientes procedentes de población residente en la Comunidad Valenciana. Ambas muestras han sido más ampliamente descritas y caracterizadas en trabajos previos6,7. La primera muestra aleatoria (muestra 1) estaba constituida por 486 sujetos (144 varones y 342 mujeres) con edades comprendidas entre 7 y 85 años, seleccionados entre los individuos que acudieron a un centro de atención primaria de la provincia de Valencia, durante el período comprendido entre febrero de 2000 y marzo de 2001. Se les informó de los objetivos del estudio y se solicitó su colaboración, obteniendo el consentimiento de todos los participantes. La segunda muestra aleatoria (muestra 2) estaba constituida por 514 individuos (231 varones y 283 mujeres) con edades comprendidas entre 18 y 66 años, elegidos entre un colectivo de trabajadores de la provincia de Valencia tras expresar su consentimiento. El protocolo del estudio fue aprobado por la Dirección del Área de Salud correspondiente y por la Comisión de Investigación y Ética de la Facultad de Medicina de la Universitat de València. Para ambas muestras, las variables demográficas, clínicas y del estilo de vida se obtuvieron a partir de un cuestionario6,7. Obtención de las muestras, determinaciones bioquímicas y análisis genético A cada participante se le realizó una extracción de sangre venosa periférica tras un período de ayuno de 12 h. Una alícuota se empleó para las determinaMed Clin (Barc) 2003;120(9):337-9
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PORTOLÉS O, ET AL. BAJA PREVALENCIA DEL POLIMORFISMO LEU7PRO EN EL PÉPTIDO SEÑAL DEL PREPRONEUROPÉPTIDO Y EN LA POBLACIÓN MEDITERRÁNEA ESPAÑOLA
ciones bioquímicas, y otra se utilizó para la extracción del ADN. Los lípidos plasmáticos y el índice de masa corporal se determinaron por los métodos previamente descritos6,7. El ADN de cada individuo se obtuvo a partir de leucocitos utilizando un protocolo estándar7. El análisis del polimorfismo en el gen del NPY se determinó según el método descrito por Karvonen et al3. Para ello, se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) un fragmento de ADN de 290 pares de bases (pb) incluyendo el lugar polimórfico. Los cebadores empleados fueron: 5’-TTGGGGTGTGGGTGGCTC-3’ y 5’-CCTAGACAGACGGGTCGTAGCA-3’. Las amplificaciones se efectuaron en un volumen de 25 µL, que contenía 100 ng de ADN genómico, 2,5 mM de cada cebador, 1 mM de dNTPs, 2 mM MgCl2 y 0, 25 U de Taq polimerasa (Promega, EE.UU.). Después de una desnaturalización inicial a 95 ºC durante 5 min, se realizaron 40 ciclos con el siguiente protocolo: 30 s a 94 °C, 30 s a la correspondiente temperatura de anillamiento (67 °C), y 40 s a 72 °C. Para la extensión del amplificado, se utilizó una temperatura de 72 °C durante 5 min. Los productos de la amplificación se digirieron con la enzima de restricción BsiEI (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, EE.UU.) durante un mínimo de 4 h a 60 ºC. Los productos obtenidos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa Metaphor® al 4%, y tinción con una solución de bromuro de etidio para su identificación con luz ultravioleta. La presencia del polimorfismo en posición 1128 genera un sitio de restricción para la enzima BsiEI originándose un fragmento de 250 y otro de 40 pb. Los resultados de cada electroforesis fueron interpretados por dos investigadores, repitiendo las discrepancias si las hubiese. Además, se incluyeron un control positivo y otro negativo en cada subconjunto de muestras analizadas. Paralelamente, un 10% de las muestras elegidas de manera aleatoria y todas aquellas que presentaban un patrón de RFLP ligeramente anormal se sometieron a secuenciación directa, tras nueva amplificación y procesado utilizando el sistema ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Reaction Kit (Perkin-Elmer, PE Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) de acuerdo con un protocolo estándar y con un sistema de análisis de secuenciación ABI (Servicio de Secuenciación de la Universitat de València).
Resultados Se ha realizado el análisis genético del polimorfismo Leu7Pro en 1.000 individuos procedentes de dos muestras aleatorias independientes de población residente en la Comunidad Valenciana. Las características demográficas, antropométricas y bioquímicas de las dos muestras analizadas en este estudio se resumen en la tabla 1. En primer lugar, se estudió la muestra 1, compuesta por 486 individuos. Tras los primeros resultados de la genotipificación del NPY en dicha muestra, y tras observar una bajísima prevalencia, se decidió ampliar el tamaño de la población estudiada, recurriendo a una segunda muestra independiente de similar origen geográfico (muestra 2). La muestra 2 estaba compuesta por 514 participantes, con una media de edad menor que la anterior. En la tabla 2 se presentan los resultados del análisis genético en cada una de las muestras analizadas. De los 1.000 individuos genotipados, tan sólo se encontró una persona (una mujer), perteneciente a la muestra 1, portadora en heterocigosis de la variante Leu7Pro en el NPY. Así, la prevalencia global de este polimorfismo en la población estudiada fue del 0,1%, a la que co-
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TABLA 1 Características demográficas, bioquímicas y del estilo de vida de la población española Muestra 1 Varones (n = 144) Mujeres (n = 342) (media [DE]) (media [DE])
Edad (años) Índice de masa corporal (kg/m2) Colesterol total (mmol/l) cHDL (mmol/l) cHDL (mmol/l) Triglicéridos (mmol/l) Fumadores actuales (%) Consumidores de alcohol (%)
44,5 (18,9) 27,7 (4,3) 5,4 (1,1) 3,5 (0,8) 1,1 (0,2) 1,8 (1,2) 40,2 ( 81,3 (
45,9 (17,4) 28,2 (5,8) 5,4 (1,1) 3,5 (1,0) 1,4 (0,3) 1,4 (0,8) 22,6 ( 54,8 (
Muestra 2 Varones (n = 231) (media [DE])
Mujeres (n = 283) (media [DE])
37,4 (10,1) 26,4 (4,8) 5,3 (1,0) 3,5 (0,9) 1,1 (0,3) 1,3 (1,2) 44,6 ( 88,9 (
35,7 (10,4) 23,9 (4,2) 4,9 (0,9) 3,1 (0,8) 1,4 (0,3) 1,1 (0,7) 44,6 ( 59,9 (
DE: desviación estándar; cLDL: colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad; cHDL: colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad.
TABLA 2 Prevalencia del polimorfismo Leu7Pro en el neuropéptido Y en la población estudiada Total (n [%])
Muestra 1 (n [%])
Muestra 2 (n [%])
Genotipos Leu7Leu 999 (99,9) 485 (99,8) 514 (100,0) Leu7Pro 1 (0,1) 1 (0,2) 0 (0,0) Pro7Pro 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) Total 1.000 ( 486 ( 514 (
rresponde una frecuencia alélica de 0,005 (intervalo de confianza [IC] del 95%, 0,0001-0,0015). Discusión Éste es el primer estudio realizado en una muestra amplia de población española dirigido a estimar la prevalencia del polimorfismo Leu7Pro del NPY, por lo que no es posible comparar nuestros resultados con los obtenidos por otros grupos en nuestro país. La baja prevalencia encontrada (0,1%) para la variante Leu7 en población mediterránea contrasta con los resultados obtenidos por Karvonen et al3 en población de Finlandia, para la que estimaron una prevalencia global del 14%, con una frecuencia alélica de 0,08. Para ello incluyeron a 139 finlandeses obesos y a 144 controles no obesos procedentes de la población de Kuopio, sin hallar diferencias de prevalencia de la variante Leu7 entre casos y controles. Adicionalmente, genotipificaron a 93 obesos y 263 individuos con normopeso procedentes del Hoorn Study, un estudio de seguimiento en la población general holandesa, estimando una prevalencia para el alelo Leu7 del 6% y una frecuencia alélica de 0,03. Esta menor prevalencia de la variante Leu7Pro en Holanda, junto con los datos de nuestro trabajo (frecuencia alélica 0,005), podría apuntar a un gradiente norte-sur para este alelo, tal como se ha descrito en Europa para numerosas variantes genéticas. Sin embargo, la ausencia de datos sobre este poli-
morfismo en otros países europeos no permite confirmar todavía el posible gradiente o bien apoyar la hipótesis de que dicha variación constituye una característica genética diferencial de la población de Finlandia. Posteriores estudios con muestras más amplias de individuos de origen finés han confirmado los datos de prevalencia aportados inicialmente por Karvonen et al3. Por otra parte, este polimorfismo se ha estudiado en otras poblaciones por su posible relación con el consumo de alcohol. Con este objetivo, Makino et al8, en Japón, genotipificaron a 105 pacientes alcohólicos y a 200 trabajadores sanos, sin encontrar ningún individuo portador de la variante Leu7Pro en dicha población. Tampoco Ding et al9 hallaron ningún alelo mutado al realizar un cribado de este polimorfismo en 242 coreanos. Sin embargo, Lappalainen et al10 sí han encontrado variación genética para este polimorfismo en población europeoamericana de EE.UU., describiendo una mayor prevalencia de la variante Leu7Pro en el grupo de alcohólicos (5%) que en la población control (2%). La bajísima prevalencia de la variante Leu7Pro en población mediterránea española debería tenerse en cuenta en el diseño de posteriores estudios relacionados con la misma. En consecuencia, al contrario de lo planteado por los finlandeses, este polimorfismo no sería relevante determinando las concentraciones de lípidos plasmáticos, obesidad o el riesgo cardiovascular en nuestra población. Agradecimiento Este trabajo ha sido financiado en parte por el Fondo de Investigación Sanitaria (ref. FIS00/725) y por la Oficina de Ciencia y Tecnología de la Generalitat Valenciana (ref. CTIDIB/2002/197).
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