Diana Carolina Martín Gámez, Mónica Molano Luque, María Mercedes Bravo
Artículo de revisión
Actividad de la telomerasa como biomarcador de progresión en lesiones cervicales Telomerase’s activity as a biomarker of progression in uterine cervical lesions Diana Carolina Martín Gámez1, Mónica Molano Luque1, María Mercedes Bravo1 1 Grupo de Investigación en Biología del Cáncer. Instituto Nacional de Cancerología, ESE, Bogotá, D. C., Colombia
Resumen Los telómeros son secuencias de ADN repetidas en tándem que se encuentran al final de los cromosomas. Con cada ciclo celular los telómeros van disminuyendo su longitud, y cuando el acortamiento llega a ser crítico, se envía una señal que hace que la célula entre en senescencia. La telomerasa es la enzima responsable del mantenimiento de la longitud de los telómeros y su actividad se ha relacionado con los procesos de inmortalización celular, ya que sus niveles de acción son prácticamente indetectables en tejido sano, y elevados en líneas celulares inmortalizadas y en muestras de cáncer. Estudios en varios modelos de cáncer, incluyendo el de cuello uterino, han mostrado un aumento en los niveles de actividad de la telomerasa a medida que aumenta el grado de lesión. Por esto, la medición de la actividad de esta enzima podría ser utilizada como un marcador potencial de progresión tumoral y como una herramienta viable de selección de pacientes que posiblemente van a tener un mayor riesgo de desarrollar cáncer. En este artículo señalamos brevemente las características biológicas de la telomerasa, se reseñan algunos de los trabajos publicados acerca del análisis de su actividad como posible biomarcador de progresión y se profundiza especialmente en el modelo de cuello uterino. Palabras clave: Actividad de la telomerasa, cáncer de cuello uterino, biomarcador, progresión tumoral.
Abstract Telomeres are complex structures at the ends of human chromosomes and consist of the repeated DNA sequences. With each cell cycle division, the telomeres decrease in length until the process become critical and results in a signal that triggers the cell senescence. Telomerase is an enzyme responsible to maintain the telomere length and its activity has been associated with the cellular immortalization process. Telomerase activity is highly detected in immortalized cell lines and cancer samples, whereas nonmalignant somatic tissue shows undetectable to no telomerase activity. A number of studies in different cancer models (included cervical cancer) have demonstrated an increase in the telomerase activity with the grade of lesion, for this reason it has been proposed that measurement of telomerase activity might be used as a tumor progression marker and as a useful screening tool to select people that have a higher risk to develop cancer. The aim of this report is to give a description of the biological characteristics of the telomerase, to show a review of some studies done about its possible role as a progression biomarker and finally to go deep about its role into the cervical cancer model. Key words: Telomerase activity, cervical cancer, biomarker, tumor progression. Correspondencia Mónica Molano Luque, Grupo de Investigación en Biología del Cáncer, Instituto Nacional de Cancerologia. Avenida 1ª N° 9-85, Bogotá, D.C., Colombia. Teléfono: 334 1353. Correo electrónico:
[email protected].
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Actividad de la telomerasa como biomarcador de progresión en lesiones cervicales
Introducción La telomerasa humana es una enzima que añade a los telómeros de los cromosomas secuencias de seis nucleótidos repetidas en tándem con la secuencia 5´-TTAGGG-3´ para mantener estable su longitud y para protegerlos de la inestabilidad o de la degradación cromosomal (1). Se han detectado niveles elevados de la actividad de esta enzima en diferentes tipos de cánceres humanos, mientras que en los tejidos sanos sus niveles son muy bajos e incluso en algunos casos se ha considerado ausente (2). En diferentes tipos de cánceres se ha demostrado un aumento en la actividad de la telomerasa, entre ellos se cuentan el cáncer de pulmón, de páncreas, hepatocelular, de próstata, algunos de piel y ciertos tumores gastrointestinales (3-8). Particularmente, en muestras con diferentes grados de lesión cervical se ha observado que la actividad de la telomerasa es mayor en lesiones de alto grado y en cáncer, en comparación con las lesiones de bajo grado o sin cambios neoplásicos. Por ello se ha propuesto que la medición de la actividad de la telomerasa podría ser utilizada como marcador de progresión tumoral (9). El cáncer cervical constituye la primera causa de muerte por cáncer en mujeres, especialmente en países en vías de desarrollo (10). A escala mundial, el cáncer de cérvix ocupa el segundo lugar en incidencia y prevalencia, después del cáncer de mama, y el quinto lugar en mortalidad en cuanto a la población femenina se refiere. En nuestro país existe una alta incidencia de cáncer cervical: se calcula que 36 de cada 100.000 mujeres sufren de esta enfermedad por año (11). Existen numerosos estudios tanto de tipo molecular como epidemiológico que han demostrado una asociación entre la infección con el virus del papiloma humano (VPH) y la oncogénesis cervical. La infección con este virus es considerada un factor necesario, pero no suficiente para que las lesiones premalignas se conviertan en lesiones cancerosas, por lo que se ha referido que el cáncer cervical es de origen multifactorial (12-15). Factores relacionados con el VPH, como el tipo o la variante viral (o ambos), la persistencia de la
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infección, la carga viral y factores relacionados con el hospedero, como la edad, el número de compañeros sexuales, el uso de anticonceptivos orales y la respuesta inmune, han mostrado ser determinantes en el desarrollo de cáncer cervical; sin embargo, aún no es claro cuál es el mecanismo que lleva a que sólo pocas lesiones cervicales lleven a cáncer, regresen o sean eliminadas (13-15). En los últimos años se han incrementado los esfuerzos por identificar marcadores moleculares que permitan detectar cuáles lesiones cervicales de bajo grado tienen un mayor riesgo de convertirse en lesiones de alto grado y cáncer, ya que el VPH como indicador de progresión tumoral no es suficiente, debido a que un alto número de infecciones con tipos virales de alto riesgo se resuelven espontáneamente y no generan alteraciones en el cuello uterino (15). El análisis de la actividad de la telomerasa y su uso como un posible marcador de progresión en este tipo de cáncer amplía las expectativas de encontrar marcadores tempranos de progresión que puedan ser usados en los programas de tamizaje. En este escrito se hace una recopilación de la información existente sobre la actividad de la telomerasa en cáncer cervical y en algunos otros modelos neoplásicos; se exponen algunas de las características biológicas de esta enzima, y se referencian las publicaciones que han incluido el estudio de su actividad como marcador de progresión en muestras de tejido cervical en diferentes estadios de progresión.
Organización telomérica Los telómeros son complejos especializados de ácido desoxirribonucleico (ADN) y proteínas que se localizan en los extremos de los cromosomas eucariontes y están involucrados en varias funciones celulares, principalmente en los procesos concernientes al mantenimiento de la estructura cromosomal y en los eventos involucrados con el control de la vida de las células y su descendencia (16). La secuencia y la estructura del ADN telomérico son muy similares entre las especies eucariontes. El ADN de los telómeros tiene una conformación de doble cadena, pero frecuentemente la cadena que tiene la dirección 5`a 3` presenta un alto contenido
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en guanina (G) y sobresale 12 a 16 nucleótidos más allá de la cadena complementaria, que tiene alto contenido de citosina (C). La cadena sobresaliente forma arreglos estructurales especiales, conocidos como G-cuádruplex, ya que precisamente son las G de la cadena monofibrilar las que se aparean entre sí.
observa en las células germinales (las cuales tienen que garantizar el mantenimiento de la información genética), en las células con alto potencial regenerativo (como las hematopoyéticas) y las en células de varios tipos de cáncer, en las cuales se encuentra expresada en niveles elevados (2).
Se cree que las funciones de estos arreglos estructurales contribuyen a evitar que el ciclo celular se detenga o que se activen los mecanismos relacionados con la reparación del ADN que pueden reconocer a los telómeros como ADN dañado y posteriormente eliminarlos (17,18).
La telomerasa es una ribonucleoproteína con actividad transcriptasa reversa, compuesta por la proteína hTERT (human telomerase reverse transcriptase) y por un componente de á cido ribonucleico (ARN) denominado hTR. Para copiar el ADN telomérico, la telomerasa utiliza su componente de ARN como plantilla para sintetizar una cadena corta en sentido 5´ a 3´ hacia el extremo distal del cromosoma. Este proceso se lleva a cabo al final de la fase S del ciclo celular (25-27). Posteriormente, ADN polimerasas convencionales sintetizan la cadena complementaria, dejando siempre la cadena con alto contenido en G más larga y manteniendo así la longitud del telómero (Figura 1).
Se ha comprobado también la existencia de proteínas que se unen al ADN telomérico y que son de suma importancia en cuanto al mantenimiento, función y, particularmente, la longitud del telómero. En el caso de los humanos se ha descrito que los factores de unión a las repeticiones teloméricas (telomere repeat binding factors), TRF1 y TRF2, están involucrados en estos procesos (19,20). En condiciones fisiológicamente normales, durante cada ciclo celular se produce un acortamiento del telómero entre aproximadamente 50 y 200 nucleótidos, fenómeno que se atribuye a la incapacidad de las ADN polimerasas de replicar los extremos del ADN de los cromosomas. Actualmente se cree que este es un mecanismo de “reloj biológico o mitótico”, ya que el acortamiento del telómero se correlaciona con el número de divisiones que sufren las células, con el proceso normal de senescencia celular y con el declive de la proliferación celular (21,22). Se ha descrito la existencia de un punto crítico en el que la longitud de los telómeros es demasiado corta y se genera un mensaje que hace que la célula entre en senescencia y, posteriormente, en apoptosis. Este momento es conocido como límite de Hayflick (23). Se ha propuesto que las anormalidades en la longitud del telómero pueden ser uno de los pasos más tempranos en el proceso carcinogénico (24).
Telomerasa La telomerasa es la enzima responsable del mantenimiento de los telómeros y se encuentra normalmente en cantidades bajas o indetectables en la mayoría de las células somáticas, a diferencia de lo que se
La actividad de la telomerasa cumple un papel muy importante en el proceso de inmortalización celular, ya que es precisamente en este proceso donde las células pierden la capacidad natural de acortamiento del telómero. Para estabilizar su longitud e impedir la apoptosis es necesaria la acción de esta enzima (28). Los niveles de actividad de la telomerasa se miden mediante el ensayo TRAP (telomeric repeat amplification protocol), procedimiento descrito por primera vez por Kim en 1994 (2) y cuya metodología incluye inicialmente la amplificación de fragmentos teloméricos mediante el uso de iniciadores marcados radiactivamente, donde la telomerasa extraída de las muestras —si es que ésta se encuentra presente— añade repeticiones de ADN de seis nucleótidos al iniciador que simula la secuencia del telómero con el extremo libre 3’. Esos productos elongados son amplificados por PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Posteriormente, el amplificado se analiza en geles de poliacrilamida por electroforesis, y se visualiza por autorradiografía, donde es posible observar, en el caso de muestras con actividad de la telomerasa, una escalera de bandas que aumenta de forma progresiva desde aproximadamente 6 pares de bases.
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hTERT 3’
A.
hTR 5’
CCAATCC CCAATCCCAA 5’ GGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGG 3’ 5’
3’
B.
CCAATCC CCAATCCCAA 5’ GGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG 3’ C.
ADN pol CCAATCCCAATCCCAATCCCAATCCCAATCC GGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG 3’
Telómero
D. CCAATCCCAATCCCAATCCCAATCCCAATCC 5’ GGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG 3’
Figura 1. Actividad de la telomerasa. (A). Acoplamiento de la plantilla de ARN (hTR) de la telomerasa con la secuencia de la cadena con alto contenido en guanina del telómero. (B). Síntesis de la nueva cadena 3’ del telómero por la adición consecutiva de seis nucleótidos TTAGGG. (C). Síntesis de la cadena con alto contenido en citosina por una ADN polimerasa convencional. (D). Nueva longitud del telómero; la cadena en sentido 5’ a 3’ es más larga que su complementaria. hTERT: Human Telomerase Reverse Transcriptase. Subunidad catalítica de la telomerasa; hTR: Subunidad de ARN de la telomerasa. ADN pol: ADN polimerasa.
Durante los últimos años se ha establecido una fuerte asociación entre la acción de la telomerasa y el desarrollo de cáncer. Esta relación ha sugerido que los niveles de actividad de la telomerasa podrían ser de utilidad como marcadores de progresión tumoral (2,29).
Antecedentes sobre el análisis de la actividad de la telomerasa en cáncer En estudios moleculares en los que se ha detectado la actividad de la telomerasa mediante TRAP se ha encontrado asociación entre niveles altos de actividad de esta enzima y el desarrollo de diferentes tipos de cáncer. Entre los trabajos pioneros que han demostrado esta relación se cuentan: el de Hiyama K. et al. en 1995 (3), quienes evaluaron muestras de tejido pulmonar y encontraron que en todas
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las muestras de carcinoma de células pequeñas de pulmón la actividad de la telomerasa está elevada en relación con los controles sanos; el de Hiyama E. et al. en 1997 (4), quienes reportaron actividad elevada de la telomerasa en ocho lavados pancreáticos provenientes de pacientes con cáncer comparados con los niveles encontrados en lavados de tejido pancreático de pacientes normales; el de Nouso et al en 1996 (5), quienes publicaron que aproximadamente el 86% de las muestras de carcinomas hepatocelulares que analizaron tenían alta actividad de la telomerasa, mientras que ninguna de las muestras de tejido sano fue positiva durante los ensayos; en el trabajo de Sommerfeld et al. en 1996 (6), se demostró que cerca del 90% de los casos de cáncer de próstata tenían alta actividad de esta enzima, y, por último, el trabajo publicado en 1996 por Taylor et al. (7), demostró que en muestras provenientes de una gran variedad de tipos de cáncer de piel la actividad de
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la enzima se encuentra elevada en comparación con el tejido normal, aunque contradictoriamente se observó actividad en casi la mitad de las muestras de pacientes sanos. En trabajos más recientes se ha referido que la expresión de la telomerasa puede anteceder a la transformación en el desarrollo de cáncer; además, se propone que la detección de la proteína hTERT en el epitelio bronquial sin signos de enfermedad podría ser un biomarcador de alto riesgo para el desarrollo de cáncer pulmonar (30). También se ha sugerido que la medición de la actividad de la telomerasa mediante TRAP, sumada a la identificación de mutaciones en la proteína KIT, pueden ser una herramienta conveniente para la identificación de tumores gastrointestinales con comportamiento agresivo (8).
Actividad de la telomerasa en cáncer cervical En varios trabajos se ha reportado que la actividad de la telomerasa se encuentra elevada en muestras de cáncer cervical en comparación con su respectivo control normal. El trabajo de Gorham et al. de 1997 (31), realizado en muestras de diferentes cánceres ginecológicos, reportó la acción enzimática elevada en cánceres de cuello uterino y ovario, lo cual contrasta con lo encontrado en carcinomas endometriales donde tanto en los casos como en los controles observaron los mismos niveles de actividad, debido, tal vez, a la naturaleza proliferativa y regenerativa de este tejido. Un trabajo similar fue realizado en el mismo año por Zheng et al. (32), quienes reportaron que en cáncer de endometrio, de cuello uterino y de vagina se presenta una fuerte actividad enzimática de la telomerasa. Otro trabajo de este mismo grupo en 1997 (33), empleando únicamente muestras de exfoliados cervicales en diferentes estados de progresión, mostró que la actividad de la telomerasa va elevándose conforme aumenta el grado de la lesión. Adicionalmente, Wang et al. en 2002 (34) encon traron una actividad elevada de la telomerasa en muestras de diferentes cánceres ginecológicos (incluido el de de cuello uterino); sin embargo, al hacer la asociación con la longitud del telómero, no encontraron una relación estadísticamente significativa.
Telomerasa y VPH Aún son controversiales los trabajos que han intentado encontrar una asociación entre la presencia del VPH con los niveles de la actividad de la telomerasa; sin embargo, es importante mencionar algunos de los estudios que han reportado que los niveles de activación de esta enzima están estrechamente relacionados con la infección por este virus. En 1997, Anderson et al. (35) mostraron que los VPH de alto riesgo 16 y 18 son encontrados con más frecuencia en muestras de cáncer cervical con niveles elevados de actividad de la telomerasa; en ese mismo sentido, Kawai et al. en 1998 (36) concluyeron que la activación de la telomerasa depende del tipo de VPH infectante y que los niveles de actividad son más altos precisamente si el tipo viral presente pertenece a un grupo de alto riesgo. En estudios más recientes, como el realizado por Pinto-Tang et al. en 2005 (37) con muestras de exfoliado cervical de mujeres venezolanas con diferentes grados de lesión, el 88% de las muestras de cáncer mostraron signos de actividad, comparado con un 11% de las muestras que provenían de lesiones intraepiteliales escamosas; en este trabajo también se observó una asociación entre las muestras que tuvieron actividad de la telomerasa elevada y la infección con VPH de los tipos 16 y 18. Por el contrario, Cheah et al. en 2002 (38), en muestras de un grupo de mujeres de Malasia con cáncer de cérvix, no encontraron ninguna relación entre niveles altos de actividad de telomerasa con los tipos de VPH detectados. Se ha propuesto que el VPH está involucrado en la inmortalización mediante la activación de la telomerasa (39). Recientemente se ha comprobado que la proteína E6 del VPH-16 cumple un papel importante en la inducción y en el mantenimiento de altos niveles de la subunidad catalítica de la telomerasa (hTERT), lo que puede explicar que en las células de cáncer cervical se detecte una actividad alta de esta enzima. Adicionalmente, este hallazgo concuerda con estudios previos en los que se han mostrado niveles altos de ARN mensajero de hTERT en los casos de neoplasia intraepitelial cervical III (NIC III) que portaban ADN de VPH de alto riesgo (40,41). También se ha sugerido que la activación de la telomerasa es independiente de la degradación de
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p53 mediada por E6, y que los queratinocitos que expresan E6 sumada a una actividad de telomerasa elevada logran extender su periodo de vida, pero no se inmortalizan a menos que se exprese también la oncoproteína E7 (42). También se ha propuesto que la región central de la proteína E6 y su dominio de formación de dedos de zinc son necesarios para la activación de la telomerasa (42).
Pruebas basadas en TRAP y perspectivas para el tamizaje de cáncer cervical Algunos autores han sugerido que junto a los métodos de diagnóstico habituales (citología y detección del tipo de VPH), medir los niveles de actividad de telomerasa podría ser una herramienta de selección de citologías con lesiones intraepiteliales de bajo grado (LEI-BG), de alto grado (LEI-AG), cáncer, e incluso algunas atipias (43-47). Como ya mencionamos, el TRAP es el método por excelencia para medir la actividad de la telomerasa. Desde que fue descrito en 1994 (2), ha tenido algunas modificaciones metodológicas con el fin de
Los TRAP que llevan alguna modificación y que han sido mas utilizados en trabajos experimentales (fuera del protocolo convencional radioactivo), son los realizados mediante ELISA y los que miden la actividad de la telomerasa utilizando la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR-TR). El primero de éstos, consiste en utilizar iniciadores biotinilados para medir la actividad de la telomerasa mediante la realización de ensayos inmuno-enzimáticos fotométricos muy sensibles por medio de la técnica de ELISA. Con esta metodología el producto de la amplificación por PCR es denaturado e hibridizado con una sonda marcada con digoxigenina, específica para detectar fragmentos teloméricos; posteriormente, el híbrido es inmovilizado en placas cubiertas con estreptavidina y detectado con un conjugado (anti-digoxigenina-peroxidasa) para, en última instancia, ser visualizado por el cambio de color cuando se agrega el sustrato de la peroxidasa (48) (Figura 2).
5’
3’ A.
omitir los pasos siguientes a la amplificación, como la electroforesis y el revelado por autorradiografía, metodologías complejas que a menudo no están disponibles en un laboratorio clínico convencional.
CCAATCC
B
GGTTAG GGTTAG GGTTAG GGTTAG GGTTAG GGTTAG 3’
ADN pol B.
B
GGTTAG GGTTAG GGTTAG GGTTAG GGTTAG GGTTAG 3’ CCAATC CCAATC CCAATC CCTTAAG CC
D
C.
CCAATC CCAATC GGTTAG GGTTAG GGTTAG GGTTAG GGTTAG GGTTAG 3’
B
Cambio Color D
D.
B
B D
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Sustrato
CCAATC CCAATC GGTTAG GGTTAG GGTTAG GGTTAG GGTTAG GGTTAG 3’
Iniciador biotinilado
Estreptavidina
Sonda marcada con digoxigenina
Anti-digoxigenina-peroxidasa
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Figura 2. Detección de la actividad de la telomerasa por ELISA. (A). Si la telomerasa se encuentra presente, añade repeticiones de 6 pares de bases al iniciador biotinilado que simula la secuencia del ADN telomérico. (B). Los productos teloméricos son amplificados mediante PCR. (C). La sonda para detectar fragmentos teloméricos marcada con digoxigenina hibrida con los productos de PCR denaturados. (D). El ADN hibridado se une a la estreptavidina de la placa, posteriormente la anti-digoxigeninaperoxidasa junto al sustrato genera un cambio de color que puede ser medido fotométricamente.
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Las ventajas de este procedimiento son muchas, la principal es que puede ser realizado en cualquier laboratorio clínico, con una pequeña cantidad de muestra y sin el uso de productos radiactivos. Ha sido probado con éxito en especímenes de raspados cervicales, en los que se ha comprobado el aumento en los niveles enzimáticos de la telomerasa en lesiones con diferente grado de progresión (47); en otros tipos de cáncer, se ha propuesto utilizar estos estuches comerciales para la detección temprana de carcinomas de células escamosas orales, en muestras de saliva (49), y en casos de cáncer de Vejiga, con muestras de orina, aunque con algunas modificaciones en el método fotométrico (50). El segundo procedimiento incluye las bases metodológicas del TRAP convencional y se ha propuesto con el fin de obtener resultados cuantificables por medio de amplificaciones en tiempo real. Aunque las pruebas en líneas celulares han resultado ser promisorias, ya que han mostrado una alta sensibilidad, especificidad, ahorro de tiempo y de reactivos, solamente pueden ser realizadas en laboratorios que cuenten con el instrumental adecuado (51,52). En cáncer cervical se han realizado amplificaciones en tiempo real midiendo la expresión de alguno de los componentes de la enzima, particularmente el proteico, asumiendo que la detección cuantitativa de hTERT puede ser tomada como la medición indirecta de la actividad de la telomerasa, ya que se ha encontrado una relación directa entre la expresión de la subunidad catalítica de la telomerasa y la actividad enzimática como tal (53).
Conclusión Han sido muchos los esfuerzos en los últimos años por encontrar marcadores moleculares que puedan predecir cuáles pacientes van a desarrollar cáncer y cuáles no. Evaluar la actividad de la telomerasa ha resultado una herramienta útil como marcador de progresión tumoral, no sólo en lo que a cáncer cervical y sus lesiones precursoras se refiere, sino, además, para otros modelos de cáncer, gracias a la fuerte asociación que se ha observado entre estadios avanzados de enfermedades neoplásicas y los niveles altos de actividad de la telomerasa.
Aunque en cáncer cervical son relativamente pocos los estudios que han tratado este tópico y no es muy clara la asociación de la activación de la telomerasa con la infección por VPH, en general se ha discutido que el uso de este biomarcador podría ser útil tanto en la diagnosis como en la prognosis de las pacientes, ya que se podría realizar una prueba basada en TRAP de uso fácil en un laboratorio clínico convencional, lo cual puede resultar en el mejoramiento de los programas de tamizaje y vigilancia del cáncer cervical en países en vías de desarrollo. Sin embargo, en la actualidad se necesita realizar un mayor número de estudios en diferentes poblaciones a escala mundial y efectuar estudios de seguimiento, en busca de una asociación contundente entre los niveles de acción de la telomerasa con la progresión tumoral.
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