Artículo de investigación Cultivo y reconocimiento de hongos y protozoos a partir de muestras ambientales Cultivation and observation of fungi and protozoa from environmental samples

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Cultivo y reconocimiento de hongos y protozoos a partir de muestras ambientales Cultivation and observation of fungi and protozoa from environmental samples Luis Alberto Jiménez Medina, Sandra Isabel Moscote Padron

RESUMEN En éste trabajo se realizó el reconocimiento a los integrantes del dominio eukarya (protozoos, algas, hongos). En el caso de hongos, protozoos y algas se hizo un reconocimiento detallado de esto donde se pudo evidenciar sus tipos y el porqué de sus características físicas y biológicas. Además, para el fungi se aplicó la técnica del repique para Trichoderma, y se aisló otros hongos a partir de una gran variedad de productos naturales como el banano, aguacate, arepa, pan, fresa, mora, semillas de cannabis, semillas de naranja, entre otros. A partir del aislamiento, se logró observar las estructuras principales que facilitan ver la taxonomía del microorganismo y ésto se pudo realizar a través del microscopio. Palabras clave: Fungi, Trichoderma, eukarya, algas, protozoos. ABSTRACT In this work the recognition to members of the eukarya domain (protozoa, algae, fungi) was performed. In the case of fungi, protozoa and algae made a detailed analysis of where this was evident why their types and their physical and biological characteristics recognition. In addition to the fungi technique peal for Trichoderma it was applied, and other fungi was isolated from a variety of natural products such as bananas, avocado, corn bread, bread, strawberry, blackberry, cannabis seeds, orange seeds, among others. From isolation, it was possible to observe the main structures that facilitate see the taxonomy of the organism and this could be done through the microscope. Key words: Fungi, Trichoderma, eukarya, algae, protozoa.

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INTRODUCCIÓN A través de los años, tras estudios se halló el dominio eukarya tras descubrir dos tipos de células que hoy conocemos como eucariota y procariota. Nuestro interés son las eucariotas debido a las tantas diferencias que tenían las células u organismos estos fueron repartidos según sus similitudes a lo cual llamaron dominios en nuestro caso el dominio eukarya este es aquel que posee la categorización de microorganismos vivos que tienen unidades celulares con un núcleo verdadero, es decir que el ADN de estas células está contenido en un núcleo celular separado del resto de la célula por una doble membrana permeable. dentro de este dominio se encuentran los hongos, algas y protozoos que son subcategorías. Los microorganismos fungi, son unos de los más grandes entre los dominios y es el que está comprendido por hongos, estos organismos durante mucho tiempo estuvieron catalogados como plantas, pero los científicos se dieron cuenta de algunos aspectos un tanto diferentes con respecto a lo que conocían sobre los seres vivos y ahora son seres totalmente independientes dentro del dominio eukarya.

pequeños que sólo pueden diferenciarse bajo la lente de un microscopio 1. Hay diferentes clases de hongos que son de tipo phycomycetes, ascomycetes, basidiomycetes y deuteromycetes. Ésta clasificación se basa principalmente en las esporas sexuales y de los cuerpos fructíferos presentes durante los estadíos sexuales de su ciclo biológico. Por otro lado; las algas verdes, tienen cloroplastos con clorofila A y B, lo que les confiere su color verde característico 2. Existen dos grupos principales de algas verdes: las clorofitas y las carofitas, organismos macroscópicos que forman el grupo más relacionado con las plantas terrestres 2. Así como hay algas verdes, existen algas rojas, llamadas rodofíceas, se encuentran principalmente en hábitats marinos, aunque unas pocas especies viven en hábitats terrestres o de agua dulce 2. A diferencia de las algas verdes, las algas rojas poseen clorofila A, son notables entre las algas porque sus cloroplastos carecen de clorofila B y contienen ficobiliproteínas.

Los protozoos son organismos unicelulares, pero a diferencia de las bacterias, tienen membrana nuclear (eucariotas) 3. Es decir, estructuralmente, presentan un citoplasma rodeado por una membrana celular que Es muy diverso, pues abarca las conocidas interviene en el transporte de nutrientes y en la 4 levaduras y mohos, entre los cuales están las osmorregulación . setas. Algunos hongos son muy grandes pero Finalmente, el objetivo planteado fue observar otros son tan las principales estructuras que diferencian los microorganismos del dominio eukarya.

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MATERIALES Y MÉTODOS Para llevar a cabo la práctica, se realizó una recolección de hongos en diferentes entornos ambientales y alimentos, entre las cuales estuvieron: madera, arepa, pan, estiércol de caballo, fresas, moras, aguacate, semillas de naranja y Cannabis sativa. Luego, usando un estereoscopio, se visualizó en detalle las estructuras que diferencian sus especies. Además, se efectuaron montajes en fresco, utilizando azul de lactofenol se le dio contraste a hongos filamentosos que fueron previamente repicados bajo condiciones de esterilidad en agar nutritivo a partir de muestras almacenadas en el laboratorio, tal como el hongo Trichoderma. Cabe aclarar que, para realizar el montaje de la muestra en placa, se utilizó cinta adhesiva que permite trasladar de la muestra al portaobjetos y así visualizar estructuras microscópicas de los hongos. De igual forma, se usó diversas muestras tomadas en fuentes hídricas y se logró la visualización de algas y protozoos a través del montaje en fresco en placa. Para hacerlo, se requirió sólo de un portaobjetos, y una laminilla o cubreobjetos.

utilizadas fueron siguiente forma:

acondicionadas

de

la

a. Estiércol de caballo: Se tomó la muestra evitando el contacto con suelo y se llevó a un recipiente plástico sin tapa, incubando durante una semana a temperatura ambiente. b. Semillas de Cannabis sativa y naranja: Las semillas fueron sumergidas en agua estancada del Río Chigorodó en frasco transparente. c. Aguacate, pan, arepa, fresas y moras: A cada una, se almacenaron en recipientes plásticos diferentes y se les colocó al lado una servilleta húmeda. Para el caso específico de las moras y fresas, se requirió de un asa de punta para recolectar una porción pequeña de la muestra del hongo que surgió posteriormente a la incubación de ocho días y con una gota de azul de lactofenol se realizó el montaje en placa y visualización de microscopio a 10x y 40x (Ver anexos). Repique del hongo Trichoderma

Partiendo de un hongo puro, se realizó repique del hongo Trichoderma en un medio de cultivo PDA (Papa Dextrosa Agar) en condiciones estériles ambientadas por una cabina de flujo laminar. La técnica utilizada consiste en la punción en tres puntos, formando un triángulo Tratamiento de las muestras de hongos entre ellos. Se incuba el medio repicado a Se acondicionó durante una semana, el temperatura ambiente de laboratorio durante crecimiento de ocho muestras diferentes, a una semana. Luego se procede a visualización partir de las cuales se aisló seis géneros de morfológica. hongos que fueron visualizados en montajes frescos al microscopio. Las muestras

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Tratamiento de las muestras: Algas y protozoos Las muestras ambientales usadas fueron suministradas por personal docente de la Universidad de Antioquia en tubos falcon, éstas fueron captadas de una fuente hídrica y lodo; entre otros lugares, a partir de éstas se efectuó montaje en fresco y visualización en objetivos de 10x y 40x.

Imagen 1: Crecimiento en medio de cultivo PDA del hongo Trichoderma después de una semana de incubación a temperatura ambiente de laboratorio y asilado en lugar oscuro. Se logra observar tres figuras ovaladas donde se muestra el lugar de la punción del repique y se observa que este hongo no tuvo ningún tipo de contaminación en su medio.

Para realizar la visualización se requirió pipeta pasteur, donde se tomó una alícuota principalmente del sobrenadante en cada una de las muestras y se depositó una gota en Las descripciones que se realizan en la portaobjetos y cubriendo con laminilla para ser tabla 1, son datos obtenidos a partir del analizada con microscopio. análisis microscópico de cada género de hongo estudiado en laboratorio: A las dos muestras mencionadas anteriormente, se agregó una tercera muestra Tabla 1: Detalles macroscópicos de Aspergillus y Rhizopus en fresco con materia fecal humana preparada por la docente responsable, para éste caso se MicroorgaContaminado Observación nismo visualiza también con objetivos de 10x y 40x. RESULTADOS Y ANÁLISIS Hongos: Para el caso del hongo Trichoderma, que fue repicado en el agar PDA y dejado en incubación durante una semana, se realizó una lectura a nivel macroscópico, se pudo evidenciar el crecimiento en forma filamentosa, se evidencia un color verdoso con tres figuras ovaladas esparcidas en el medio con textura algodonosa. El medio de crecimiento del Trichoderma es difícil de contaminar al ser éste hongo un tipo de microorganismo antagónico.

Aspergillus

Rhizopus

SI

SI

En algunas zonas se encuentra pigmentación negra en forma ovaladas. Su contextura es porosa con bordes cremosos. Forma de esponja, alto crecimiento, color gris oscuro y gris claro con brillo

Características macroscópicas observadas en el laboratorio, en ambos casos se evidenció una contaminación, siendo más notable en el Aspergillus.

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Tabla 2: Detalles macroscópicos de Fusarium, Colletotrichum y Penicillium Microorganismo

Contaminad o

Fusarium

Penicillium

Colletotrichum

SI

SI

SI

Observación En algunas partes del medio se observan figuras ovaladas blancas y en el centro se encuentra el Fusarium de color rosado con una consistencia porosa. En este medio se puede observar círculos verdes oscuros de contextura porosa a lo cual se le llama hongo Penicillium. Se puede ver círculos de color negro con contextura porosa algo algodonada.

Las tablas 1 y 2, reflejan claramente las informaciones generales de los hongos repicados en el laboratorio, se recalca lo susceptibles que son éstos microorganismos a contaminarse. Por otro lado, Trichoderma, destaca al no presentar contaminantes. Otro punto evaluado de Trichoderma es que se conoce como un antagónico para otros hongos como es el caso de Fusarium 5. Por lo anterior, puede ser usado para el control de crecimiento microbiano, lo cual para ésta práctica se debió utilizad la cabina de flujo laminar y mecheros para mantener el ambiente totalmente descontaminado, pero los resultados indican que pese a las precauciones tomadas para la prueba, la mayoría de los hongos presentan contaminantes. Finalmente para los hongos, se analizaron e identificaron las estructuras microscópicas de los microorganismos. Desde esta mirada se pudo evidenciar uno de los objetivos principales de las prácticas que era reconocer las estructuras internas de estos organismos y para lograrlo se realizó el montaje en los objetivos de 10x y 40x, logrando diferenciar las estructuras fúngicas como las hifas, conidias, conidióforos, esporangios, entre otras.

Características macroscópicas observadas en el laboratorio. Al igual que la tabla 1, los tres hongos evidencian contaminación.

Algas y protozoos:

CONCLUSIONES

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Después de realizar el montaje de las muestras suministradas por la docente responsable, se procedió a identificar el tipo microorganismo basado en una guía ilustrada; es decir, comparando la estructura morfológica de las algas y protozoos. Es por ello, que se obtuvo los siguientes resultados que muestran esa caracterización superficial de los microorganismos encontrados en las diferentes muestras: lodo y fuente hídrica con algas, entre otras. (Ver tabla 3). Tabla 3: Caracterización de algas y protozoos observados Muestra

Descripción

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Posible Vólvox, estructura circular de color verde.

2

3

4

8: Heces humanas

Posible Vorticella ciliado, tres óvalos juntos, color transparente Posible Phytomonas Posibles Rotífaros, su velocidad es muy grande y se desplaza sobre la placa Giardia confirmada, hay dos y se presentan tanto con quiste como sin quiste; es decir, forma móvil y Trofozoitos, respectivamente 6

Se relacionan las muestras analizadas y dada la comparación con la guía ilustrativa se sospecha de presencia de los microorganismos colocados en la descripción. Se destaca la visualización de la Giardia en sus dos formas: Móvil y Trofozoito.

Los objetivos planteados durante las prácticas, permitieron reconocer algunas estructuras que facilitan diferenciar los hongos, algas y protozoos, métodos que son necesarios para la clasificación taxonómica de cada género del microorganismo. Por otro lado, la metodología de recolectar muestras en el exterior de la universidad, generó un acercamiento real a los hábitats de los hongos que serán común denominador en ámbitos ambientales que son propios de la carrera. En consecuencia, la identificación de estructuras a través del microscopio y estereoscopio, es un proceso experimental que permite reforzar el manejo del equipo y sus usos de acuerdo al tipo de muestra utilizada. A través de la práctica, se logró confirmar que los sustratos suministrados por el PDA (Papa Dextrosa Agar), son idóneos para el crecimiento de hongos y el crecimiento macroscópico y microscópico que tienen estos microorganismos en el medio nutritivo. Además, lo vulnerables que son para contaminarse. Finalmente, las estructuras de cada microorganismo observadas, facilitaron entender el factor diferenciador entre estos y condiciones de hábitats, como es el caso de los hongos, puesto que se relaciona a la taxonomía, al poder identificar el tipo de reproducción que posee, sea sexual o asexual.

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CONFLICTO DE INTERESES Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses. ANEXOS Imagen 6: Penicillium: La estructura de este hongo está compuesta por conidias, fiálides, hifas y conidióforo.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Imagen 2: Trichoderma: En este hongo se observaron estructuras como el conidióforo y sus fiálides.

1- BioEnciclopedia. (2015). Reino Fungi - Información y Características - Biología. Consultado en Noviembre 1, 2016, en http://www.bioenciclopedia.com/reinofungi/ 2- Madigan, M. T., Martinko, J. M., Bender, K. S., Buckley, D. H., & Stahl, D. A. (2015). Brock. Biología de los microorganismos (14th ed.). Madrid: Pearson Educación S.A.

Imagen 3: Aspergillus: La estructura de este hongo se observó compuesto por conidias, fiálides y cabezuela.

3- EscuelaPedia. (n.d.). Reino Protista (Protozoários, Protozoa). Consultado en Noviembre 4, 2016, en http://www.escuelapedia.com/reino-protistaprotozoarios-protozoa/?print=pdf 4- Usal. (n.d.). PROTOZOOS PARÁSITOS DEL HOMBRE. Consultado en Noviembre 4, 2016, en http://www.biologia.edu.ar/cel_euca/celula1.htm

Imagen 4: Rhizopus: La estructura de este hongo se pudo observar compuesto por esporangios,esporangiosporas, hifas cenocíticas y rizoides.

Imagen 5: Fusarium: En este hongo estructuralmente lo que predomina son las conidias.

5- Fernández, R., & Suárez, C. (2009). Antagonismo in vitro de Trichoderma harzianum Rifai sobre Fusarium oxysporum Schlecht f sp passiflorae en maracuyá (Passiflora edulis Sims var. Flavicarpa) del municipio zona bananera colombiana. Revista Facultad Nacional de Agronomía Medellín, 62(1), 4743–4748. 6- Dvorak, a M. (1993). Giardia Lamblia. The New England Journal of Medicine, 328(14), 1010. http://doi.org/10.1056/NEJM199304083281406

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