Aplicaciones de las Enzimas Inmovilizadas Application of Immobilized Enzymes

2014 Volumen 6, No 11. Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila

Aplicaciones de las Enzimas Inmovilizadas Application of Immobilized Enzymes Leticia Romero Cedillo, Cynthia Marcela Mejía Hernández, Arturo Sánchez Zapata, Nagamani Balagurusamy y Miriam Paulina Luévanos Escareño* Escuela de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Coahuila, Carretera Torreón-Matamoros, Km. 7.5, Torreón, Coahuila. *Correo electrónico: [email protected]

Resumen Las enzimas son biocatalizadores de origen biológico. Para llevar a cabo procesos en los que son utilizadas las enzimas como catalizadores, es importante considerar el mantenimiento y la estabilidad estructural de estas para reutilizarlas, aumentar la eficiencia de producción y facilitar la recuperación de la enzima al final de la reacción. Una enzima inmovilizada es aquella que se encuentra confinada en un espacio definido en el que se retiene su actividad catalítica y puede ser reutilizada continuamente. Se han desarrollado varias técnicas para la inmovilización de enzimas, las cuales permiten su uso y aplicación en muchas áreas como en la producción de alimentos, farmacéuticos, biomedicina, como biosensores en métodos analíticos, entre otras. Lo anterior ha sido de gran impacto al minimizar los costos de operación y la fácil recuperación de la enzima y la recuperación del producto. Palabras clave: Enzimas, inmovilización, biosensores, industria.

Abstract Enzymes are biocatalysts of biological origin. To carry out a process in which enzymes are used as catalysts, and is important to consider how to maintain the structural stability of these also find ways to reuse, increase production efficiency and facilitate the handling of the enzyme in the end of the reaction. An immobilized enzyme is one that is contained in a defined space, which retains its catalytic activity and can be reused continuously. Various techniques have been developed for the immobilization of enzymes, which allows its use and application in many areas such as food production, the pharmaceutical, biomedical, as biosensors for analytical methods, among others. The above has been a great impact have been minimized operating costs and the ease in the recovery of enzyme and product separation. Key words: Enzymes, immobilization, biosensors, industry.

INTRODUCCION Uno de los principales desafíos en el estudio de biocatalizadores, es el mantenimiento de la estabilidad estructural de la enzima durante las reacciones bioquímicas. A consecuencia de esto, se han desarrollado varias técnicas con el fin de obtener enzimas inmovilizadas que tengan eficiencia funcional y mayor reproducibilidad por lo que son utilizadas como una alternativa (Datta y col., 2013). De forma general, la inmovilización se refiere al hecho de limitar o retardar el movimiento. La enzima inmovilizada es aquella que está confinada en un espacio definido, que retiene su actividad catalítica y puede ser reutilizada de forma continua (Yu y col., 2004). En comparación con las

enzimas solubles, la inmovilización permite que el biocatalizador sea fácilmente separado de la reacción (Illanés, 2008). Además, los catalizadores pueden ser inmovilizados no solo a partir de enzimas purificadas sino también utilizando células completas (Mahmoud y col., 2009). Los antecedentes de la inmovilización se remontan al estudio de las biopelículas, las cuales son una superficie de conexiones de comunidades microbianas que consiste en múltiples capas de células incrustadas en matrices hidratadas. En el año de 1815, se realizó un primer intento de la inmovilización al utilizar de forma empírica el ácido acético y el tratamiento de aguas residuales. 1

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Figura 1. Componentes de un sistema de inmovilización: enzima, soporte y técnica de inmovilización; los métodos más comunes son (izq.) adsorción, (centro) atrapamiento y (der.) unión covalente. Las biopelículas fueron estudiadas exhaustivamente en 1940 (Kierek y col., 2005) pero fue hasta la finales de la década de los 60’s cuando comenzó a explorarse el uso de enzimas mediante el desarrollo de una técnica de inmovilización de aminoacilasa de Aspergillus oryzae para la producción de DL aminoácidos (Tosa y col., 1966). Además, también se utilizó, para la producción de L-aminoácidos e isomerización de glucosa. Finalmente a partir de 1985, se llevó a cabo la inmovilización de múltiples enzimas incluyendo la regeneración de un cofactor y la inmovilización de células, para su uso por ejemplo en la producción de L-aminoácidos a partir de ceto-ácidos a partir de reactores de membranas (Hartmeier, 1988).

entrecruzamiento, encapsulamiento y atrapamiento (Chibata y col., 1986 a). Los métodos más comunes de inmovilización son la adsorción, atrapamiento, y la unión covalente a un soporte (Figura 1). El procedimiento de inmovilización ideal para una enzima dada es aquel que le permite conservar una alta actividad catalítica con el paso del tiempo para ser utilizada continuamente (Singh y col., 2013). Dependiendo de la estructura de la proteína y del material, así como de las condiciones de la reacción será el método de inmovilización a utilizar. A continuación se hace una breve descripción de las técnicas convencionales de inmovilización.

Los componentes principales de un sistema de inmovilización enzimático son la enzima, la matriz o soporte y el método de fijación. Como consecuencia de la inmovilización enzimática, algunas de sus propiedades como la actividad catalítica o la estabilidad térmica llegan a ser alteradas, sin embargo puede conservar su funcionalidad durante varios ciclos (Brena y col., 2006).

Es el método más simple de inmovilización, se basa en enlaces débiles aunque tiene cierta eficiencia en los procesos. Intervienen fuerzas de Van der Waals, interacciones iónicas e hidrofóbicas y puentes de hidrógeno. Aunque esta técnica es de fácil preparación, bajo costo, el soporte se puede recargar, aún que hay inconvenientes en este método, uno de ellos es que el enlace es reversible y sólo se puede monitorear la reacción en periodos cortos. Hay una alta tasa de fuga del biocatalizador, enlace inestable, no es posible controlar lo anterior y por lo tanto tiene un índice de reproducibilidad bajo. Además es muy susceptible a los cambios que se producen en el ambiente como las modificaciones en el pH, temperatura y fuerza iónica. Entre los soportes más utilizados se encuentran la carboximetilcelulosa, el almidón, colágeno, sepharosa modificada, resinas de intercambio iónico, silica gel, óxido de aluminio, titanio, tierra de diatomeas, cerámica, hidroxiapatita, cerámica, etc (Joshi y col., 2005; 2006; Gorecka y col., 2011). Estos soportes generalmente dan como resultado, cantidades bajas de proteína dispuesta (1 mg/g de soporte) y la elución continúa del sistema enzima/células. Con algunos soportes, como el titanio, se forman uniones de carácter parcialmente covalente que producen un complejo activo y estable. Otros soportes

Para lo anterior, es importante tener un conocimiento pleno de las propiedades de los materiales del soporte y los procesos de inmovilización. En años recientes, se han desarrollado nuevos materiales poliméricos para ser utilizados como soportes, que permiten un buen desempeño mecánico y se ajustan a las propiedades de la enzima. La superficie del material es modificada para reducir las interacciones no bioespecíficas entre la enzima y el soporte; esto promueve la actividad de la enzima, al generarse un microambiente similar al que debe tener la proteína en su estado libre natural (Fang y col., 2011). Más adelante se describen los métodos y materiales utilizados para las técnicas de inmovilización más empleadas. Métodos de inmovilización Existen cinco métodos principales para inmovilización de enzimas o células: adsorción, unión covalente,

Adsorción

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2014 Volumen 6, No 11. Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila utilizados para la adsorción son tanino- quitosano y taninosepharosa (Abdel-Naby y col., 1999, a). Atrapamiento La técnica de atrapamiento, consiste en la inclusión de la enzima por unión covalente o no, dentro de geles o fibras (Chiang y col., 2004; Klotzbach y col., 2008; Subramanian y col., 1999). Además, minimiza la lixiviación de la enzima y mejora su estabilidad, pero con frecuencia resulta en limitaciones de transporte de sustrato / analito al sitio activo de la enzima. Sin embargo, esta técnica permite la posibilidad de adaptar el material de encapsulación para proporcionar el microambiente óptimo para la enzima, es decir, que coincida con el entorno físico-químico de la enzima y el material de inmovilización (Spahn y col., 2008). La encapsulación eficiente se ha realizado empleando alginato de calcio, que previene la perdida de la enzima y aumenta la estabilidad mecánica. El atrapamiento por medio de nanomateriales, ha revolucionado el área de inmovilización de enzimas y ha ampliado el rango de aplicaciones en el campo de la química fina, biomedicina, biocombustibles, biosensores y medicina. La disminución en la lixiviación y el aumento en el índice de eficiencia de atrapamiento, se ha reportado en la actividad lipasa de Candida rugosa, mediante el uso de quitosano como soporte; este material se considera no tóxico, biocompatible y de fácil manipulación química, además de su alta compatibilidad con la proteína dada su naturaleza hidrofílica. Así mismo, se ha reportado que la carragenina es otro soporte adecuado para lipasa, pues es un material tolerante a altas temperaturas y solventes orgánicos (Datta y col., 2013).

requiere de dos pasos: la activación del material de soporte que se lleva a cabo por la adición de un compuesto reactivo y el segundo es la modificación del esqueleto del polímero para activar la matriz. El paso de activación produce un grupo electrofílico en el material del soporte, de esta forma el soporte reacciona con los nucleófilos de las proteínas. Por ejemplo, el glutaraldehído es activado cuando reacciona con los grupos amino de las proteínas (Nisha y col., 2012). Entrecruzamiento Este tipo de inmovilización consiste en la formación de una gran estructura tridimensional compleja entre las mismas moléculas de la enzima por medios físicos o químicos (Xie y col., 2009). Por lo general en los métodos químicos se forman enlaces de unión covalente empleando ciertos agentes como el glutaraldehído, ácido dicarboxílico o tolueno disocianato. Por métodos físicos se utilizan agentes floculantes como poliaminas, polietilenamina, sulfonatos de poliestireno y fosfatos (Elnashar, 2010). Este método también es denominado cross-linking (Figura 2), es una técnica que ha sido ampliamente utilizada en la estabilización de muchas enzimas (Wong y col., 1992). El entrecruzamiento de una enzima fue descrito por primera vez Quiocho y Richards en 1964 (Quiocho y col., 1964), utilizando glutaraldehído para estabilizar los cristales de una enzima y realizar estudios de difracción de rayos X, además, también se mantuvo la actividad catalítica de la enzima.

Unión covalente La inmovilización por unión covalente, se basa en el entrecruzamiento de la enzima y el material del soporte produciendo un enlace fuerte y estable. El enlace covalente es formado entre el grupo funcional de la matriz del soporte y la superficie de la enzima que contiene residuos de aminoácidos. La unión es normalmente formada entre los grupos funcionales presentes en la superficie del soporte y los grupos funcionales pertenecientes a los residuos de aminoácidos en la superficie de la enzima. Los residuos de aminoácidos que intervienen en la formación del enlace, son los grupos los amino (NH2) de la lisina o la arginina (Tiller y col., 1999), el grupo carboxilo (COOH) del ácido aspártico o ácido glutámico, los grupos sulfhidrilo de cisteína, los grupos hidroxilo de (OH) de la serina o treonina (Chibata y col., 1986 a). Los materiales utilizados en esta técnica incluyen la poliacrilamida, agarosa y silica. Los polímeros de polisacáridos, que son muy hidrofílicos, son materiales de soporte muy populares para la inmovilización de enzimas La unión covalente de la enzima con el material del soporte,

Figura 2. Inmovilización por entrecruzamiento o crosslinking ¿Por qué inmovilizar enzimas? Existen varias razones para la preparación y uso de enzimas inmovilizadas, por ejemplo una fácil separación de la enzima del producto (Hartmeier, 1986), y la reutilización de la enzima (Buchholz y col., 1997). Esto último constituye una de las principales ventajas de las enzimas inmovilizadas, pues su utilización durante varios ciclos en los procesos a gran escala genera con el paso del tiempo, una reducción de costos (Tischer y col., 1999, a). En la figura 3, se ejemplifica un esquema de producción con enzimas inmovilizadas.

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Figura 3. Reactor de flujo continuo empleando un biocatalizador inmovilizado (*) que ejemplifica la fácil recuperación de la enzima por medio de ultrafiltración y la salida del producto. Un ejemplo típico es la utilización de glucosa isomerasa inmovilizada, enzima que permite la obtención de 12.00015.000 kg de jarabe de maíz de alta fructosa al emplear un kilogramo de la misma, durante toda la vida operativa del biocatalizador (Swaisgood, 2003). Las enzimas de uso industrial en general se exponen a condiciones extremas, tales como altas concentraciones de sustrato, un pH y temperatura elevados, por consiguiente, para la mayoría de aplicaciones industriales deben ser inmovilizadas con el objetivo de mejorar su selectividad, actividad y durabilidad (Tischer y col., 1999, b). Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar (Elnashar, 2010): 1.

Mejora de la estabilidad de la enzima frente al pH, temperatura, disolventes, contaminantes e impurezas.

2.

La posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso.

3.

La capacidad de detener rápidamente la reacción mediante la eliminación de la enzima a partir de la solución de reacción (o viceversa)

4.

El producto no está contaminado con la enzima

5.

Fácil separación de la enzima a partir del producto (especialmente útil en la industria alimentaria y farmacéutica).

Los principales inconvenientes del inmovilización (Martinek y col., 1987) son:

proceso

de

1.

La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con un diferente número de uniones al soporte.

2.

Siempre suele haber una pérdida de actividad de la enzima durante la movilización.

3.

El biocatalizador es más caro que la enzima nativa

Usos y aplicaciones de la inmovilización de enzimas La inmovilización de enzimas permite una mejora significativa de su estabilidad, lo que hace posible su empleo en la producción industrial de productos químicos, farmacéuticos, alimentos; en el tratamiento de residuos; en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades, y otras muchas aplicaciones (Arroyo, 1998). Las aplicaciones más importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden clasificar en tres partes: como sensor analítico, en el campo de la medicina y en el sector industrial. 1. Aplicaciones analíticas: como biosensores. Un biosensor es un dispositivo analítico autónomo que incorpora un material biológicamente activo en contacto íntimo con un elemento de transducción apropiado para el propósito de detectar (reversible y selectivamente) la concentración o actividad de las especies químicas en cualquier tipo de muestra (Arnold y col., 1988). Las enzimas fueron los primeros componentes biológicos utilizados en los biosensores, y siguen siendo, los elementos más comúnmente empleados. Los métodos enzimáticos son los más atractivos en los dispositivos de detección, debido a su notable especificidad acción sobre un sustrato único o 4

2014 Volumen 6, No 11. Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila Tabla 1. Enzimas inmovilizadas por un propósito clínico (Pastor y col., 2013) Enzima Alcohol deshidrogenasa acetaldehído deshidrogenasa

Enfermedad tratada y

Intoxicación con alcohol

Lizanoy col., 2001; Lizano y col., 1998.

Asparaginasa

Leucemia linfocítica aguda

Adenosina deaminasa Citocromo P450 (las células productoras de la enzima)

Melanoma humano y hepatocarcinoma Terapia de cáncer, para convertir ifisfoamida en su metabolito citotoxico

β-glucosidasa

Enfermedad de Gaucher

β-glucuronidasa

Terapia de cáncer para la activación de profarmacos anticancerigenos Infecciones orales Infarto de miocardio Terapia de sustitución en las enfermedades gastrointestinales, tratamiento de la mala absorción de grasa

Glucosa oxidasa-peroxidasa Activador t- plasminógeno Pepsina, quimiotripsina, tripsina Fenilalanina amonio liasa

Fenilcetonuria

Estreptoquinasa Ureasa (células de E. coli diseñadas para producir ureasa

Tratamiento trombotico

2. Aplicaciones médicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas. El estudio de las enzimas inmovilizadas para aplicaciones biomédicas se inició en la década de 1960 (Liang y col., 2000 a), con el objetivo de resolver algunas de las limitaciones para el uso de enzimas clínicas. Desde entonces, varios enfoques han sido utilizados en la terapia de enzimas ya sea para la detección de sustancias bioactivas en el diagnóstico de enfermedades o con el objetivo de tratar

Gaspar y col., 1998; Cruz y col., 1993; Avrami y col., 2002; Balcao y col., 2001. Heishfield, 1995; Ensor y col., 2002. Löhr y col., 2002. Belchetz y col., 1977; Korablyov y col., 1999.

Eliminación de la urea en la insuficiencia renal

grupos de sustratos (Mayank y Arya, 2014). Los biosensores pueden ser utilizados en la industria de los alimentos, agricultura y diagnóstico biomédico. El ejemplo más popular es el sensor basado en la glucosa oxidasa, utilizado por individuos que sufren diabetes para controlar los niveles de glucosa en la sangre. Alternativamente, algunos biosensores utilizan medidores sensibles de fluorescencia, lo cuales monitorean los cambios en la fluorescencia intrínseca de FAD de la glucosa oxidasa. Varios biosensores basados en la glucosa oxidasa se enumeran a continuación; 1) El monitoreo de la glucosa en las fermentaciones, 2) Biosensor de fibra óptica para el análisis de las concentraciones de glucosa en refrescos, 3) Biosensor desechable del tipo tira para la sangre y suero, 4) Biosensor para sangre (GO-HPRcolorante), 5) Biosensor térmico miniaturizado para la sangre entera y 6) Sensor de glucosa de sangre entera (Sandip y col., 2009).

Antecedente

Storm y col., 1997. Hill y col., 1997. Santini y col., 2000. Patchell y col., 2002. Chang y col., 1995; Bourget y Chang, 1995. Liang y col., 2000 (b). Wolfe y Chang, 1987; Prakash y Chang, 1996.

una condición de enfermedad (Pastor y col., 2006) Por ejemplo la L-asparaginasa se utiliza en el tratamiento de leucemias y cánceres diseminados que requieren asparragina para desarrollarse. Se ha diseñado un hemodializador de fibra hueca que contiene asparaginasa inmovilizada (Callegaro y Denti., 1983). Se han probado preparados de enzimas microencapsuladas para tratar enfermos con alteraciones genéticas, en las cuales estaban ausentes algunas enzimas. También los preparados pueden ser utilizados para mejorar la digestión, eliminando metabolitos tóxicos y prevenir el desarrollo de tumores. Debido a su aplicación práctica, el estudio de las enzimas inmovilizadas en los soportes o microencapsuladas permitirá una mejor comprensión de su funcionamiento in vivo (Dainichenko, 1988). En la tabla 1 se muestra algunas enzimas que han sido inmovilizadas por propósito clínico. 3. Aplicaciones industriales: en la industria química, farmacéutica, alimentaria y de tratamiento de residuos. Una de las principales aplicaciones de la inmovilización de enzimas a nivel industrial es para la producción de diversos L-aminoácidos, tales como L-alanina, L-isoleucina, Lmetionina, L-fenilalanina, L-triptofano y L-valina por aminoacilasa fúngica (E.C. 3.5.1.14) inmovilizada mediante unión iónica sobre DEAE-Sephadex (Aehle, 2007).

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2014 Volumen 6, No 11. Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila Tabla 2. Inmovilización de enzimas carbohidrasas con diferentes técnicas y sus aplicaciones en la industria alimentaria (Jares y col., 2013). Enzima

Soporte

α-Amilasas

Perlas de vidrio funcionalizadas

Glucoamilasa

Método de inmovilización

Aplicación

Antecedente

Unión covalente

Producción de maltooligosacáridos

Jana y col., 2013.

Polímero de polianilina

Unión covalente

Hidrólisis de almidón

Kahraman y col., 2007.

Pululanasa

Perlas magnéticas de quitosano

Unión covalente

Hidrólisis de enlaces α-(1,6) de maltotriosa.

Zhang y col., 2009

Inulinasa

DEAE-Celulosa

Adsorción

Formación de fructosa y glucosa por la hidrólisis de enlaces β-1,2 fructano de inulina.

Guiraud y col., 1981

Invertasa

Cápsulas de gel de alginato de calcio

Entrapamiento

Hidrólisis de sucrosa

Tanriseven y col., 2001; Akgöl y col., 2001.

β-galactosidasa

Polisiloxano magnéticoalcohol polivinílico compuesto (mPOS-PVA)

Unión covalente

Hidrólisis de la lactosa en la leche Síntesis de galactooligosacáridos

Neri y col., 2008; Vasiljevic y col., 2001; Vera y col., 2012

β-glucosidasa

Eupergit C

Unión covalente

Mejora de las cantidades de antioxidantes fenólicos libres de pulpa de cereza

González-Pombo y col., 2011; Krisch y col., 2012

Pectinasa

Soporte de alginato de sodio utilizando glutaraldehido

Unión covalente

Extracción, clarificación y filtración de jugos de frutas y vinos.

Li y col., 2007

Fructosiltransferasa

Eupergit C

Unión covalente

Producción de isomaltulosa

Tanriseven y col., 2005; Kawaguti y col., 2007.

Los aminoácidos son ampliamente empleados en la industria de los alimentos, nutrición, medicina y cosméticos así como materiales iniciadores de síntesis químicas. Las aplicaciones alimenticias y de nutrición solo emplean los L-isómeros activos de aminoácidos (Chibata y col., 1986 b). Uno de los aminoácidos que se producen desde 1973 con enzimas inmovilizadas es el L-aspártico, por medio de un sistema continuo que consta de una columna con enzima inmovilizada. En el sistema, la aspartasa (4.3.1.1) extraída de células de Escherichia coli se inmovilizaron por la técnica de atrapamiento en gel de acrilamida y la columna se empleó para la producción continua industrial (Tosa et al., 1973). Años más tarde, esta matriz fue sustituida por carragenina y la producción del aminoácido aumentó hasta tener un

rendimiento de 100ton/mes utilizando un reactor de 1 kilolitro (Chibata y col., 1986 b). Otros ejemplos de enzimas inmovilizadas son la enzima penicilina acilasa (amidasa (E.C. 3.5.1.11), ahora es utilizada es ampliamente en la producción del ácido-6aminopenicilanico de la pencilina G y la glucosa isomerasa (E.C. 5.3.1.18) se utiliza en la producción de jarabe de alta fructosa a partir de la glucosa (Aehle, 2007). Como ejemplo para el tratamiento de residuos, tenemos a Thiobacillus denitrificans, el cual es utilizado en el tratamiento de aguas residuales que contienen nitrato, 6

2014 Volumen 6, No 11. Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila utilizando el método de tres veces congelado/descongelado para inmovilizarlo con PVA (Zhang y col., 2008). Otras enzimas empleadas en de la industria alimentaria, son las carbohidrasas que tienen una gran aplicación como se muestra en la tabla 2. Con estas enzimas es posible obtener diferentes tipos de jarabes de azúcar, prebióticos e isomaltulosa. Las carbohidrasas más importantes son de origen microbiano e incluyen amilasas, invertasas, inulinasas, galactosidasas, glucosidasas, fructosiltransferasas, pectinasas y glucosiltransferasas (Jares y col., 2013). Para que estas enzimas sean rentables para la industria, requieren una técnica de inmovilización eficiente, simple y de bajo costo. En la siguiente tabla se muestran dichas enzimas y su método de inmovilización, así como su aplicación en la industria. CONCLUSIONES El uso y la aplicación de enzimas inmovilizadas en diferentes áreas, es muy extenso y han sido de gran impacto por que han minimizado los costes de operación y por la facilidad en la recuperación de la enzima y separación del producto. Esto se debe principalmente a la reutilización del biocatalizador inmovilizado, lo cual permite que a nivel industrial y otras áreas de aplicación sea considerado como una tecnología rentable. REFERENCIAS Abdel-Naby M. A., Sherif A. A., El-Tanash A. B. y Mankarios A. T. 1999. Immobilization of Aspergillus oryzae tannase and properties of the immobilized enzyme. Journal of Applied Microbiology. 87, 108-114. Aehle W. (ed.). 2007. Enzymes in Industry a: Production and Applications, 3 ª ed. Wiley-VCH, Weinheim Akgöl, S.; Kaçar, Y.; Denizli, A. y Arıca, M.Y. 2001. Hydrolysis of sucrose by invertase immobilized on to novel magnetic polyvinyl alcohol microspheres. Food Chem., 74, 281– 288. Arnold, M.A. y Meyerhoff, M.E. 1988. Recent Advances in the Development and Analytical Applications of Biosensing Probes. Crit. Rev. Anal. Chem., 20, 149–196. Arroyo, M. 1998. Inmobilized enzymes: Theory, methods of study and applications. Ars Pharmaceutica, Vol. 39, No. Pp-2339. Avrami V. I., Sencer S., Periclou A. P., y col. 2002. A randomized comparison of native Escherichia coli asparaginase and polyethylene glycol conjugated asparaginase for treatment of children with newly diagnosed standard-risk acute lymphoblastic leukemia: a children’s cancer group study. Blood 99, 1986–1994. Balcão V. M., Mateo C., Fernández-Lafuente R., Malcasa F. X., y Guisán J. M. 2001. Structural and functional stabilization of L-asparaginase via multisubunit immobilization onto highly activated supports. Biotechnol. Prog. 17, 537–542.

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