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ORIGINALES Aplicación de la técnica PCR-RFLP en la identificación de nematodos implicados en la anisakiasis humana
63.311
María Jesús Perteguera, Guadalupe Ortiza, Elena Garcíaa, María Floresa, Esperanza Rodrígueza, Florencio M. Ubeirab y Teresa Gáratea a
Servicio de Parasitología. Instituto de Salud Carlos III. Centro Nacional de Microbiología. Majadahonda. Madrid. Laboratorio de Parasitología. Facultad de Farmacia. Universidad de Santiago de Compostela. Santiago de Compostela. A Coruña. España.
b
FUNDAMENTO Y OBJETIVO: Desarrollo de una técnica molecular que permita la identificación específica de especie de anisákidos parásitos humanos con el mínimo de muestra, independientemente de su estado evolutivo. MATERIAL Y MÉTODO: Se utilizaron larvas de nematodos obtenidas de pescados para el consumo humano. Se realizó reacción en cadena de la polimerasa con análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción (PCR-RFLP). Para ello se amplificó el ADN de anisákidos correspondiente a las regiones ITS-1, gen del ARN ribosomal 5.8S, ITS-2 y aproximadamente 70 pares de bases del gen del ARN ribosomal 28S, incluyéndose un control de reacción interno. Los productos se digirieron posteriormente con la endonucleasa Taq I y por otra parte se secuenciaron. RESULTADOS: Se obtuvieron patrones de amplificación (fragmentos de 960 y 1.010 pb) y restricción diferentes según la especie de anisákido (Anisakis simplex/Hysterothylacium aduncum), que coincidieron con los ya descritos para los mismos parásitos pero de otras procedencias geográficas, y se confirmó una divergencia genómica. CONCLUSIONES: La especificidad del ensayo y la alta sensibilidad de la técnica, así como la ausencia de variaciones intraespecíficas, confirman la utilidad de esta prueba en la identificación de parásitos causantes de la anisakiasis humana, tanto en biopsias como a partir de las larvas extirpadas. Palabras clave: Anisakiasis. Anisakis. Hysterothylacium. PCR-RFLP.
Application of the PCR-RFLP technique for the species-specific identification of nematodes involved in human anisakiasis BACKGROUND AND OBJECTIVE: We intended to develop a molecular test allowing a species-specific identification of the anisakid human parasite independently of its evolutive stage. MATERIAL AND METHOD: Anisakid larvae were obtained from fish destined to human consumption. In the PCR-RFLP test, the DNA corresponding to the ITS-1, 5.8S rRNA gene, ITS-2 and approximately 70 of the 28S rRNA gene region was amplified and a positive control was included. Products were digested with the endonuclease Taq I and subsequently sequenced. RESULTS: Different anisakids (Anisakis simplex/Hysterothylacium aduncum) yield different amplification (960 and 1,010 bp fragments) and restriction patterns, which were in accord with previously described patterns of the same parasites from others geographical regions. CONCLUSIONS: The high sensitivity of the test and the absence of intraspecies variations confirms the utility of this assay in the identification of human parasites involved in human anisakiasis including larvae from resected biopsies. Key words: Anisakiasis. Anisakis. Hysterothylacium. PCR-RFLP.
Este trabajo ha sido financiado con un proyecto coordinado SAF:CO2-01 de la CICYT. Correspondencia: Dra. T. Gárate Ormaechea. Servicio de Parasitología. Instituto de Salud Carlos III. Centro Nacional de Microbiología. Ctra. Majadahonda-Pozuelo, km 2,2. 28220 Majadahonda. Madrid. España. Correo electrónico:
[email protected] Recibido el 5-11-2003; aceptado para su publicación el 2-3-2004.
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Med Clin (Barc) 2004;122(18):686-9
La anisakiasis es una enfermedad producida por la ingestión de pescado crudo o poco cocinado infectado por larvas de tercer estadio de anisákidos marinos, de los que el más frecuente es Anisakis simplex. En los últimos años en España esta enfermedad se ha manifestado como un parasitismo emergente1, lo que ha conducido a una investigación y mejora de los métodos diagnósticos. Se han descrito varios cuadros clínicos bien diferenciados según el lugar de asentamiento del parásito, que son el origen de las diferentes formas de la anisakiasis. Las más frecuentes son la anisakiasis gástrica y la intestinal, en las que el parásito se asienta, respectivamente, en el estómago (fundus mayoritariamente) y en el intestino (íleon sobre todo). Ocasionalmente se describen localizaciones ectópicas como hígado, peritoneo, pulmón, entre otras, que se corresponden con las denominadas anisakiasis extragastrointestinales2. En el caso de la anisakiasis gástrica, el diagnóstico se realiza habitualmente mediante extracción e identificación de la larva con endoscopia, mientras que en la anisakiasis intestinal y en algunos casos gástricos (p. ej., la variante gastroalérgica sin penetración estomacal) los métodos serológicos son de gran utilidad. El Centro Nacional de Microbiología realiza tareas de apoyo al diagnóstico de los hospitales del Sistema Nacional de Salud y cada vez le son remitidas con mayor frecuencia muestras para la detección serológica de esta enfermedad. El diagnóstico se realiza en colaboración con el Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad de Santiago de Compostela a través de un enzimoinmunoanálisis captura con anticuerpos monoclonales anti-Anisakis que detecta inmunoglobulinas G1 y E en el suero de pacientes con sospecha de infección3. Mediante este procedimiento, en el quinquenio 1998-2003 se pudo detectar 250 muestras de suero positivas procedentes de varios hospitales españoles. En el caso de extracción directa de la larva mediante endoscopia, la identificación se puede efectuar por análisis morfológico o por cortes y observación de los cordones la20
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PERTEGUER MJ, ET AL. APLICACIÓN DE LA TÉCNICA PCR-RFLP EN LA IDENTIFICACIÓN DE NEMATODOS IMPLICADOS EN LA ANISAKIASIS HUMANA
Material y método Se recogieron larvas de tercer estadio (L3) de nematodos anisákidos mediante extracción manual a partir de pescados destinados al consumo humano (pescadillas, Micromesistius poutassou). Las larvas se identificaron siguiendo criterios morfológicos (unión ventrículo-intestino, presencia o ausencia de mucro y otras). Las muestras obtenidas se procesaron individualmente. El ADN crudo de cada una de las larvas se extrajo de acuerdo con el protocolo descrito por Rodríguez et al4, con los cambios que se indican a continuación. Se añadieron 50 µl de una solución de ChelexTM al 10% a cada larva y se procedió a hervir la muestra durante 10 min a 100 °C; a continuación se la sometió a 3 procesos de congelación en N2 líquido, hervido durante 5 min a 100 °C, y homogeneización manual. Por último se recogió el sobrenadante tras una centrifugación a 12.000 rpm durante 2 min. Se sacrificó mediante dislocación cervical un ratón Swiss de 3 semanas y se procedió a la extracción de su intestino. Éste se troceó en fragmentos de 0,04 g (aproximadamente el peso de una larva) y a continuación, según el protocolo utilizado para las larvas, se extrajo el ADN, que se empleó como control. Se amplificó, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el ADN correspondiente a las regiones ITS-1, gen del ARN ribosomal 5.8S, ITS-2 y aproximadamente 70 pares de bases del gen del ARN ribosomal 28S, siguiendo la técnica descrita por Zhu et al5 y Kijewska et al6 con ligeras modificaciones (dNTPs 10 µmol cada uno; cebador NC2: 0,2 µmol; cebador NC5: 0,1 µmol). Las secuencias de los cebadores fueron: NC5 (cebador directo): 5’-GTA GGT GAA CCT GCG GAA GGA TCA TT-3’, y NC2 (cebador reverso): 5’- TTA GTT TCT TTT CCT CCG CT-3’. Se escogió este protocolo porque permite identificar hasta 11 especies de anisákidos diferentes y en nuestras condiciones de trabajo presenta una sensibilidad de aproximadamente 10-20 ng. La mitad de los productos de amplificación se visualizaron al ultravioleta tras su separación electroforética en geles de agarosa al 2% con bromuro de etidio, y la otra mitad se sometió a digestión enzimática con la endonucleasa Taq I (Roche Diagnostics, S.L., Barcelona, España), de acuerdo con las especificaciones de la casa comercial. Finalmente, los productos digeridos se visualizaron también al ultravioleta tras su separación electroforética pero en geles de agarosa al 4% con bromuro de etidio. A partir del ADN de intestino de ratón se amplificó el ADN correspondiente a un fragmento del gen de la subunidad ribosomal pequeña del ARN común a todos los mamíferos7, que sirvió como control positivo de la reacción de PCR. Como cebador directo se utilizó el oligonucleótido HUF (5’-GAGCCGCCTGGATACCGC3’), que se une exclusivamente al ADN de los mamíferos, y como reverso se empleó el cebador UNR (5’GACGGTATCTGATCGTCTTC-3’), que hibrida universalmente con un amplio rango de vertebrados como mamíferos, anfibios y pájaros. Las condiciones de trabajo de estos cebadores se adaptaron a la técnica descrita para anisákidos por Zhu et al5 y Kijewska et al6. Se unificaron las 2 PCR anteriores en una sola, utilizándose los cebadores de ambas técnicas, así como 21
ITS-1
ITS-2 5,8S
terales característicos en forma de Y2. Ambas técnicas presentan el inconveniente de que necesitan que la larva se halle en buen estado de conservación, hecho que no es siempre posible debido tanto al proceso de extracción como a la destrucción de la larva como consecuencia de la respuesta inmunitaria desarrollada frente a ella. Este problema se agrava aún más cuando la muestra procede de una localización poco frecuente que no hace sospechar una anisakiasis. Debido a ello, en este trabajo se planteó la estandarización de un método molecular que permitiese la identificación directa y específica de especie de estos parásitos a partir de una pequeña cantidad de muestra.
18S
(960) pb) (1.050 pb)
28S
A. simplex H. aduncum
A Fig. 1. A) Electroforesis en gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio de los productos de amplificación obtenidos a partir del ADN correspondiente a las regiones ITS-1, gen del ARN ribosomal 5.8S, ITS-2 y aproximadamente 70 pares de bases del gen del ARN ribosomal 28S, utilizando 6 µl del ADN genómico crudo que como mínimo contiene de 10-20 ng del ADN. Carriles: 1) marcador de peso molecular de 100 pb Ladder (BIOTOOLS); 2) una larva de Anisakis simplex grande (unos 24 mm); 3) una larva de A. simplex mediana (alrededor de 18 mm); 4) una larva de Anisakis simplex pequeña (13 mm aproximadamente); 5) una larva de Hysterothylacium aduncum; 6) una larva de H. aduncum; 7) control negativo; 8) marcador de peso molecular PCR Marker (SIGMA). B) Electroforesis en gel de agarosa al 4% con bromuro de etidio de los productos de restricción obtenidos tras digestión con la endonucleasa Taq I de los amplicones correspondientes a las regiones ITS-1, gen del ARN ribosomal 5.8S, ITS-2 y aproximadamente 70 pares de bases del gen del ARN ribosomal. Se mantiene el orden de las muestras indicado en el apartado A.
2.000 1.500 1.031 900 800 700 600 500
1.000 750 500
400 300
300
B 2.000 1.500 1.031
1.000
800
750
600 500 400 300
300 200
los ADN de parásitos y ratones, en una misma reacción. Para ello, se emplearon como control positivo los ADN con sus cebadores homólogos, los ADN de A. simplex con los cebadores NC2-NC5 y los ADN de ratón con los cebadores universales HUF-UNR. A continuación se probaron los ADN con los cebadores heterólogos, los ADN de A. simplex con los cebadores universales HUF-UNR y los ADN de ratón con los cebadores NC2-NC5. Finalmente se procedió a mezclar ambos ADN (A. simplex y ratón) con los cebadores NC2-NC5 y HUF-UNR, por separado y juntos (en todos los casos las amplificaciones se llevaron a cabo a partir de 1 µl de los 50 obtenidos tras la extracción de ADN). Al igual que en los casos anteriores, los productos de amplificación se sometieron a digestión con la enzima Taq I y después se procesaron como se ha indicado con anterioridad. Los productos obtenidos a partir de la PCR se caracterizaron mediante clonación en el vector pGEMTEasy (Promega Corporation, Madison, EE.UU.) y posterior secuenciación mediante el método de Sanger et al8 (DNA sequencing kit, BigDye, ABIPRISM, PE Biosystem, Foster City, CA, EE.UU.) en un secuenciador 373A (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Para el análisis y alineamiento de las secuencias se utilizó el programa informático de uso gratuito BioEdit 5.0 (http:// www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html).
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Resultados Se analizaron 3 grupos (10 ejemplares por grupo) de larvas de A. simplex de diferentes tamaños –grandes (unos 24 mm), medianas (alrededor de 18 mm) y pequeñas (13 mm aproximadamente)– y 10 ejemplares de Hysterothylacium aduncum, y se extrajo individualmente el ADN de cada uno de ellos (en un volumen final de 50 µl). Las amplificaciones se llevaron a cabo a partir de 1, 2, 4 y 6 µl de cada muestra, respectivamente, y se obtuvo la amplificación en todos los casos. Todos los productos resultantes de la amplificación del ADN de A. simplex mostraron un tamaño de 960 pb independientemente del tamaño de la larva (fig. 1A, carriles 2-4). En el caso de H. aduncum se obtuvo un fragmento de 1.050 pb (fig. 1A, carriles 5 y 6). La digestión de los productos de PCR de ambas especies con la endonucleasa Taq I permitió obtener fragmentos de resMed Clin (Barc) 2004;122(18):686-9
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A 400
400
300
300
200
200
100 80
100 80
B 1.031 800 600
Fig. 2. A) Electroforesis en gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio de los productos de amplificación con los cebadores universales HUF-UNR utilizando como molde ADN de ratón. Carriles: 1) marcador de peso molecular 100 pb Ladder (BIOTOOLS); 2) 1 µl ; 3) 2 µl; 4) 4 µl; 5) 6 µl; 6) 1 µl (1/10); 7) 4 µl (1/10); 8) 1 µl (1/102); 9) 4 µl (1/102); 10) negativo; 11) 1 µl (1/103); 12) 4 µl (1/103); 13) 1 µl (1/104); 14) 4 µl (1/104); 15) marcador de peso molecular 100 pb Ladder (BIOTOOLS). B) Electroforesis en gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio de los productos de amplificación con los cebadores de anisákidos NC5-NC2 utilizando como molde ADN de Anisakis simplex. Se mantiene el orden de las muestras indicados en el apartado A.
tricción específicos de especie. En el caso de A. simplex se detectó un doblete de 400 y 440 pb, respectivamente (fig. 1B, carriles 2-4), mientras que en el caso de H. aduncum se observaron 4 productos de digestión de 130, 150, 300 y 350 pb (fig. 1B, carriles 5 y 6).
La aplicación de la técnica de Kijewska et al6 al ADN de intestino de ratón utilizando los cebadores universales HUF/UNR rindió un producto de amplificación de 200 pb. Se utilizaron las mismas cantidades de molde que en la PCR de anisákidos: 1, 2, 4 y 6 µl del volumen final de 50 µl obteni-
A 2.000 1.500 1.031 800 600 400 300 200
1.000 750 500 300 150
B 1.031 800 500 400 300 200 100 80
1.000 750 500 350 150 50
Fig. 3. A) Electroforesis en gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio de los productos de amplificación obtenidos a partir de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) conjunta. Los moldes y cebadores utilizados se indican en cada uno de los carriles: 1) marcador de peso molecular de 100 pb Ladder (BIOTOOLS); 2) PCR conjunta A: molde: ADN Anisakis (cebadores NC2-NC5); 3) molde ADN Anisakis (cebadores HUF-UNR); 4) molde ADN ratón (cebadores HUF-UNR); 5) ADN ratón (cebadores NC2-NC5); 6) molde: ADN Anisakis más ADN ratón (cebadores NC2-NC5); 7) ADN Anisakis más ADN ratón (cebadores HUF-UNR); 8) ADN Anisakis más ADN ratón (cebadores NC2-NC5/HUF-UNR); 9) control negativo; 10) marcador de peso molecular de 100 pb Ladder (BIOTOOLS). B) Electroforesis en gel de agarosa al 4% con bromuro de etidio de los productos de restricción obtenidos tras digestión con la endonucleasa Taq I de los obtenidos en el apartado A. Se mantiene el orden de las muestras, salvo que en el carril 10 se sustituye el marcador de peso molecular de 100 pb Ladder (BIOTOOLS) por el marcador PCR Marker (PROMEGA).
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do tras la extracción de 0,04 g de intestino. Para comprobar la sensibilidad de la técnica se realizó la reacción con 1 y 4 µl a partir de diluciones 1/10, 1/102, 1/103, 1/104 y 1/105, y se observó reacción con todas ellas (fig. 2A). Idéntico protocolo se aplicó al ADN de los anisákidos (fig. 2B), y se detectó amplificación en este caso hasta 4 µl de la dilución 1/102. Los resultados de la unificación de la PCR de anisákidos y de la PCR de mamíferos se muestran en la figura 3A. Vemos que todos los ADN se amplificaron, como era de esperar, con los cebadores homólogos (fig. 3A, carriles 2 y 4). No se produjo amplificación de ADN con cebadores heterólogos, ni de ratón con los cebadores de anisákidos, ni de ADN de Anisakis con los cebadores de ratón (fig. 3A, carriles 3 y 5). La utilización conjunta de los ADN con cada uno de los cebadores (fig. 3A, carriles 6 y 7) o con todos ellos (fig. 3A, carril 9) no inhibe la reacción, apreciándose los productos de amplificación esperados en cada caso. La digestión de los productos de amplificación con la enzima Taq I puso de manifiesto la ausencia del sitio de restricción específico en el fragmento de 200 pb de ratón obtenido con los cebadores HUFUNR (fig. 3B), lo que permite seguir utilizando la técnica de PCR con análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción (RFLP) para la identificación de anisákidos, con la ventaja añadida de tener un control interno de la reacción en casos de biopsias. Los fragmentos de 960 y 1.010 pb de A. simplex e H. aduncum obtenidos tras la PCR se purificaron y subclonaron en el vector pGEMT-Easy. Posteriormente se secuenciaron, y entre ellos se observó una similitud nucleotídica del 44,7%. Discusión La anisakiasis es una zoonosis recientemente identificada como enfermedad humana, que se detecta cada vez con mayor frecuencia en nuestro país9. El primer caso data de 1991; se trataba de un paciente con apendicitis aguda en que se encontró una larva, diagnosticada por su morfología como A. simplex10. Desde entonces se han descrito multitud de casos en los que la especie parásita más frecuente es A. simplex. Sin embargo, existen otros anisákidos que, aunque en menor medida, también han alcanzado al ser humano, como, por ejemplo, Pseudoterranova decipiens2. Como ya se ha comentado, la confirmación definitiva de los casos se basa en el aislamiento y caracterización morfológica del nematodo, procedimiento que la mayoría de las veces no se puede llevar a cabo. En este trabajo nos hemos planteado la puesta a punto de un método molecular que permita 22
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identificar cualquier anisákido marino que pueda ocasionar enfermedad en el ser humano, a partir de muestras que incluyan tanto el ADN parasitario como el del hospedador. Se escogió este método porque presenta las ventajas de especificidad y sensibilidad deseadas. Con respecto a la especificidad, se utilizaron 2 poblaciones de anisákidos, A. simplex e H. aduncum, al encontrarse ambas especies parasitando frecuentemente los pescados empleados como fuente de material parasitario. Aunque H. aduncum es un helminto no parásito del humano, se ha descrito que porta alérgenos compartidos con A. simplex11, por lo que es importante tener en cuenta su presencia en el pescado destinado al consumo humano. Los productos obtenidos a partir de la amplificación de ADN de A. simplex e H. aduncum rindieron amplicones teóricos de 960 y 1.050 pb, que permiten diferenciar ambas especies. Además, esta identificación se confirma con el análisis de polimorfismo de ADN de dichos amplicones tras la secuenciación de los fragmentos y su digestión con la enzima Taq. Los resultados obtenidos con los anisákidos de pescados de aguas españolas coinciden con los descritos por Zhu et al5 y Kijewska et al6 con poblaciones procedentes de otras localizaciones geográficas (mar Báltico, mar de Bering, mar de Okholsk, etc.), lo que indicaría la ausencia de variaciones intraespecíficas y corrobora la utilidad de la prueba en la identificación de anisákidos independientemente de su procedencia geográfica, además de proporcionar la posibilidad de identificar otras especies de la familia Anisakidae productoras de anisakiasis humana con menor frecuencia, como Contracaecum osculatum. No se debe olvidar que el método es igualmente válido en aquellos casos en los que encontramos larvas en distinto grado
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de evolución, ya que el contenido genético es invariable en todas ellas. Así, a pesar de que el ser humano es un hospedador accidental, en el que el parásito no completa su ciclo biológico, y por lo tanto la forma más frecuente es la larva de tercer estadio (L3), en ocasiones se han encontrado infecciones humanas con estados de transición entre la L3 y la L4, así como L4 desarrolladas y adultos inmaduros12. Por último, hay que destacar que la estandarización de las condiciones de trabajo con ADN parasitario y ADN murino amplía el campo de aplicabilidad de la prueba a muestras de biopsias de pacientes con la enfermedad, lo que evitaría el empleo de la caracterización morfológica, en ocasiones tan difícil de realizar, y superaría el obstáculo de los conservantes habitualmente empleados y su interferencia con otras técnicas. Además, no se debe olvidar la ventaja que supone para estos casos la incorporación de un control de reacción interno, siempre útil y necesario. En relación con la sensibilidad de la PCR utilizada en el trabajo, le permite utilizar cantidades mínimas de la muestra a identificar, ya que el protocolo detecta de 10-20 ng de ADN crudo del nematodo, cantidad que se puede obtener a partir de una porción mínima de material parasitario. Por tanto, la aplicación de esta técnica permitiría la confirmación específica y sensible de anisákidos humanos con muestras biológicas de los pacientes afectados de anisakiasis aguda o directamente de los nematodos extraídos mediante endoscopia. Queda sin embargo por establecer en el futuro si el método propuesto puede ser también de utilidad en los casos de anisakiasis crónica, donde el material genético del parásito puede haber sido destruido en buena parte como consecuencia de la acción del sistema inmunitario del paciente.
Agradecimientos Nuestro agradecimiento al Dr. J.M. Rubio por la cesión de los cebadores HUF-UNR. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Olveira A, Sánchez-Rancano S, Conde-Gacho, Moreno A, Martínez A, Comas C. Anisakidosis gastrointestinal. Siete casos en tres meses. Rev Esp Enferm Dig 1999;91:70-2. 2. Ishikura H, Kikuchi K, Nagasawa K, Ooiwa T, Takamiya H, Sato N et al. Anisakidae and anisakiasis. Prog Clin Parasitol 1993;3:43-102. 3. Iglesias R, Leiro J, Santamarina MT, Sanmartin ML, Ubeira FM. Monoclonal antibodies against diagnostic Anisakis simplex antigens. Parasitol Res 1997;83:755-61. 4. Rodríguez E, Nieto J, Castillo JA, Garate T. Characterization of Spanish Trichinella isolates by random amplified polymorphic DNA (RAPD). J Helminthol 1996;70:335-43. 5. Zhu X, Gasser RB, Podolska M, Chilton NB. Characterisation of anisakid nematodes with zoonotic potential by nuclear ribosomal DNA sequences. Int J Parasitol 1998;28:1911-21. 6. Kijewska A, Rokicki J, Sitko J, Wegrzyn G. Ascaridoidea: a simple DNA assay for identification of 11 species infecting marine and freshwater fish, mammals, and fish-eating birds. Exp Parasitol 2002;101:35-9. 7. Rubio JM, Post RJ, Van Leeuwen WM, Henry MC, Lindergard G, Hommel M. Alternative polymerase chain reaction method to identify Plasmodium species in human blood samples: the semi-nested multiplex malaria PCR (SnM-PCR). Trans R Soc Trop Med Hyg 2002;96(Suppl 1):199-204. 8. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A 1977;74:5463-7. 9. López Penas D, Ramírez Ortiz LM, Del Rosal Palomeque R, López Rubio F, Fernández-Crehuet Navajas R, Mino Fugarolas G. Estudio de 13 casos de anisakiasis en la provincia de Córdoba. Med Clin (Barc) 2000;114:177-80. 10. Arenal JJ, Marcos JL, Borrego MH, Bowakin W, Castro J, Blanco JL. Anisakiasis como causa de apendicitis aguda y cuadro reumatológico: primer caso en la literatura médica. Rev Esp Enferm Dig 1991;79:555-8. 11. Fernández-Caldas E, Quirce S, Maranon F, Díez Gómez ML, Gijón Botella H, López Román R. Allergenic cross-reactivity between third stage larvae of Hysterothylacium aduncum and Anisakis simplex. J Allergy Clin Immunol 1998;101: 554-5. 12. Rosales M, Mascaro C, Fernández C, Luque F, Sánchez Moreno M, Parras L, et al. Acute intestinal anisakiasis in Spain: a fourth-stage Anisakis simplex larva. Mem Inst Oswaldo Cruz 1999;94: 823-6.
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