Aislamiento y crecimiento de bacterias Mesófilas Aeróbicas Totales en superficies secas

LABORATORIO N° 1 - MICROBIOLOG´IA - PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA, CALI

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Aislamiento y crecimiento de bacterias Mes´ofilas Aer´obicas Totales en superficies secas Giann Karlo Aguirre Sambon´ı

Abstract—Determining the concentration of bacteria in a sample is important for the food industry, medicine and biotechnology. However, none of the methods commonly used can to determine the exact number of microorganisms existing in a given sample. More than precision, these techniques provide insights for estimating microbial content. The mesophilic aerobic group comprises a heterogeneous group, having in common the aerobic nature and proliferation between 20 and 37 °C, in this there bacilli, cocci, intermediate forms, Gram positive and Gram negative. Therefore, this article presents two procedures, the CFU count and the OD measured in order to make an analytical relationship between the growth of TAM. Resumen—La determinaci´on de la concentraci´on de bacterias en una muestra es importante para la industria alimenticia, la medicina y la biotecnolog´ıa. Sin embargo, ninguno de los m´etodos utilizados ´ habitualmente permite determinar el numero exacto de microorganismos que existe en una determinada muestra. M´as que recuentos, estas t´ecnicas proveen medios para estimar contenidos microbianos. En la conformaci´on del grupo de mes´ofilos aerobios se ´ encuentra un grupo heterog´eneo, teniendo en comun el car´acter aerobio y proliferaci´on entre 20 °C y 37 °C, en este hay bacilos, cocos, formas intermedias, Gram positivos y Gram negativos. Por lo tanto, en este art´ıculo se presentan dos procedimientos, el recuento de UFC y la medida DO, con el fin de hacer una relaci´on anal´ıtica entre ambos para el crecimiento de MAT.

´ I. I NTRODUCCI ON L aislamiento, purificaci´on e identificaci´on de bacterias son los primeros pasos para estudios bacteriol´ogicos [1] . El aislamiento y siembra de las bacterias se realiza para poder hacer la identificaci´on de los microorganismos en la muestra.

E

Profesor: PhD. Paola Andrea Caro Hern´andez, Profesora de Microbiolog´ıa, PUJ, 2015

En este paso se pretende que los microbios de la muestra crezcan en un sustrato elaborado en el laboratorio y su aislamiento facilitar´a el estudio de dichos microbios [2]. Adicionalmente, el aislamiento y la identificaci´on pueden hacerse por diversos m´etodos, la elecci´on de la t´ecnica depende del prop´osito y del tipo de microorganismo que se desea aislar. Para la identificaci´on se incluyen criterios como el estudio de la morfolog´ıa; las reacciones frente a colorantes; y el tipo de estructuras que pueden tener como esporas, c´apsula, glucoc´alix, flagelo, etc. No obstante, algunas bacterias tienen productos metab´olicos y es de gran ayuda conocerlos dado que ser´ıa una variable m´as para la identificaci´on del microorganismo en estudio. Sin embargo, para identificar la morfolog´ıa, la coloraci´on o las reacciones bioqu´ımicas se necesitan medios de cultivo, sustrato natural o artificial o una soluci´on de ciertos nutrientes que permiten cultivar los microorganismos para su posterior uso en el laboratorio, correctamente determinados, preparados y almacenados. El e´ xito del trabajo en un laboratorio de microbiolog´ıa depende de la adecuada elecci´on y buen uso de los m´etodos de esterilizaci´on y t´ecnicas as´epticas [3] . Asimismo, en el trabajo del muestreo, el procedimiento var´ıa debido al ambiente de donde se coleccionar´an las muestras pues el sustrato o medio son una referencia u´ til para observar el comportamiento de los microorganismos con respecto a par´ametros espec´ıficos (T, pH, presi´on, nutrientes, etc.). Por lo tanto, las t´ecnicas empleadas para la determinaci´on poblacional microbiana se han desarrollado con base a: la naturaleza del material a partir del cual se toman las muestras, el tipo de microorganismo y sus condiciones de

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crecimiento. Teniendo en cuenta que las bacterias son ubicuas, entonces pueden captarse igualmente de diversos sustratos. En ambientes como el suelo y aguas de ecosistemas naturales es com´un encontrar gran diversidad de organismos, en ambientes como las cavidades gastrointestinales, mucosas de animales, zonas volc´anicas y otros, la diversidad es menor. Algunas veces los microorganismos se han adaptado a condiciones muy espec´ıficas y podr´an requerir procedimientos de trabajo para aislamiento y siembra especiales como es el caso de microorganismos anaerobios, aut´otrofos, etc. [3]. Los microbios mes´ofilos aerobios totales requieren para su cultivo una fuente de carbono, una fuente de nitr´ogeno, iones no met´alicos como el azufre y el f´osforo; elementos met´alicos (Ca, Zn, K, Cu, Mn, Mg, F +2 y F +3 ); vitaminas y agua [4]; y seg´un el objetivo la siembra se hace por agotamiento, para observar colonias separadas y hacer el estudio de la identificaci´on, o se hace en cuadr´ıcula, para hace recuento de unidades formadoras de colonias (UFC).

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III. R ESULTADOS Tras la colecci´on de muestras, siembra, cultivo, aislamiento y coloraci´on de Gram, el resultado obtenido de esta tinci´on fue: Escherichia coli, bacilo gram negativo, sacado de las heces fecales de un gato, una enterobacteria; bacilo gram positivo, obtenido del bote de basura; coco, gram positivo, extra´ıdo de la manija de la puerta. En la fase para contar UFC, los resultados, tras la siembra a profundidad y las diluciones en diferentes tiempos, fueron poblaciones de crecimiento masivo, lo que imposibilit´o su recuento en agar TSA, y en agar EMB no hubo crecimiento:

II. M ETODOLOG´I A La colecci´on de muestras de microorganismos se hizo de tres superficies, la manija de una puerta, el bote de basura de un sanitario y las heces fecales de un gato. Se sembraron las muestras en un caja de petri. El hisopo con la muestra de la basura se sembr´o en un medio de cultivo enriquecido con Agar glucosa 4 % seg´un SABOURAUD; la muestra del hisopo de las heces fecales se sembr´o en un cultivo enriquecido con Agar EMB; y la muestra del hisopo de la manija de la puerta se sembr´o en un cultivo enriquecido con TSA (agar de tripticasa de soya). Todo estos fueron sembrados en superficie e incubados a una temperatura ambiente (≈ 28°C − 37°C) durante tres d´ıas. Se hizo aislamiento por agotamiento y finalmente para su identificaci´on, en un portaobjetos, se implement´o la tinci´on de Gram. Se sembr´o a profundidad para hacer recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) de cada bacteria cada hora; se hizo las diluciones respectivas en agar TSA y EMB. Por u´ ltimo, con las cepas obtenidas, aisladas y purificadas, se caracterizaron aplicando la curva de crecimiento mediante la medida espectrofotom´etrica de la absorbancia.

Figura 1: Bacilo sembrado por extensi´on, volumen de 10 ml del cultivo mixto. Siembra 2-D.

Figura 2: Bacilo sembrado por extensi´on, volumen de 10 ml del cultivo mixto. Siembra 1-inicial

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Figura 3: Bacilo sembrado por extensi´on, volumen de 1 ml del cultivo 2-D y 9 ml de caldo nutritivo.

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Figura 5: Bacilo sembrado por extensi´on, volumen de 1 ml del cultivo 3-10−1 y 9 ml de caldo nutritivo.

gram positivo no se marc´o una medida espectrofotom´etrica. Con estos resultados se evidencia que en la colecci´on de muestras de mes´ofilos aerobios totales existe una mayor probabilidad de encontrar bacterias gram positivas, debido al coco y al bacilo muestreado, en un ambiente universitario y debido a la siembra de estos en condiciones o´ ptimas se puede inferir que su fase de adaptaci´on es breve y su fase exponencial es extensa que se prolonga m´as all´a de las tres horas. Figura 4: Bacilo sembrado por extensi´on, volumen de 1 ml del cultivo 2-10−1 y 9 ml de caldo nutritivo.

Finalmente, se aplic´o la curva de crecimiento, para cada una de las bacterias, exceptuando al coco gram positivo pues no hubo crecimiento de colonias, mediante la medida de absorbancia, los datos est´an registrados en los cuadros: Cuadro I y Cuadro II, y en las gr´aficas: Figura 6 y Figura 7, respectivamente. Seg´un los datos obtenidos, se observa que la fase exponencial se da alrededor de los 50 minutos despu´es de la primera medida para el bacilo gram positivo, es decir, su tiempo de generaci´on. Adem´as, para E. coli se muestra que su tiempo de generaci´on es menos de 90 minutos y para el coco

´ IV. D ISCUSI ON El procedimiento present´o inconsistencias, al hacer las siembras a profundidad, debido a que no se consigui´o lo que se esperaba, dado que se dio un crecimiento masivo y no se pudo hacer conteo de UFC, por lo tanto, se aconseja hacer m´as diluciones o tener menos concentrada la muestra de bacterias para el cultivo. En 1981 se desarroll´o un procedimiento para enumerar a E. coli y para ello se usaron diluciones en PBS (phosphate-buffered saline) y se pipete´o 0.2 ml de cada diluci´on en 5 placas diferentes con EMB (eosin methylene blue agar) y posteriormente las pacas de EMB fueron incubadas en una posici´on invertida a 35°C durante 24 horas [5]. Ahora bien, para un recuento de bacilos se hizo otra investigaci´on en 1998 la cual buscaba comparar el conteo de placas con el m´etodo est´andar (pour plate procedure with Plate Count Agar (PCA))

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Cuadro I: Datos de la medida espectrofotom´etrica de la absorbancia con el bacilo gram positivo que sin tinci´on presentan fluorescencia. ´ Numero

Descripci´on

Longitud de onda (nm)

Absorbancia (A)

1

Bacilos fluorescentes

600

0.007

0

2

Bacilos fluorescentes

600

0.012

49

3

Bacilos fluorescentes

600

0.041

97

4

Bacilos fluorescentes

600

0.219

162

5

Bacilos fluorescentes

600

0.317

182

Tiempo (min)

Cuadro II: Datos de la medida espectrofotom´etrica de la absorbancia con E. coli. ´ Numero

Descripci´on

Longitud de onda (nm)

Absorbancia (A)

1

E. coli

600

0.030

0

2

E. coli

600

0.210

90

3

E. coli

600

0.676

150

4

E. coli

600

0.862

180

y con m´etodos alternativos (PCA/spread plates, R2A medium/pour plates and R2A medium/spread plates). Para ello, usaron in´oculos con 0.1 ml de las muestras y 0.1 ml en las diluciones de 10−1 y de 10−2 y los resultados permitieron determinar que el conteo con el m´etodo R2A medium/spread plates, a 22°C y despu´es de 7 d´ıas de incubaci´on, tuvo m´as efectividad que con el m´etodo PCA/pour plate [6]. Adicionalmente, para el caso de los cocos gram positivos queda en incertidumbre el hecho de que no hayan presentado medida crecimiento indirecto coherente, dado que mostr´o un valor en la medida espectrofotom´etrica sin sentido. No obstante, existe la hip´otesis de que form´o conglomerado pues present´o crecimiento en cultivo en siembra a profundidad. Madigan, et al. describen este fen´omeno argumentando que algunas bacterias forman peque˜nos a grandes grumos, y en tales casos, las mediciones de OD pueden ser bastante inexactas como una medida de la masa microbiana total, adem´as pudo ser que crecieron en pel´ıculas adheridas a los lados de los tubos mimetiz´andose en el cultivo l´ıquido como crecen en la naturaleza [7]. Por otro lado, en cuanto la curva de crecimiento se encontraron investigaciones que demuestran similaridad con lo resuelto en este trabajo seg´un la densidad o´ ptica de la absorbancia, sin embargo, en esa investigaci´on midieron la turbidez de las

Tiempo (min)

diluciones 10−1 y 10−2 durante 240 minutos y cada 30 minutos tomaron la medida y por lo tanto parece que la fase exponencial fuera m´as reducida [8]. ´ V. C ONCLUSI ON El presente art´ıculo de aislamiento bacteriano revel´o una correlaci´on entre los m´etodos de medida para el crecimiento de bacterias dado que para la metodolog´ıa por recuento de placas, un procedimiento directo, las bacterias presentaron una poblaci´on masiva tras una incubaci´on de tres d´ıas y para la medida de densidad o´ ptica por absorbancia, un procedimiento indirecto, las bacterias presentaron una prolongada fase exponencial que elucid´o en la medida dando como resultados cercanos a la unidad, y debido a esta correlaci´on se puede afirmar que si en menos de cinco horas los microorganismos presentaron altos niveles de turbidez, con un volumen de 1 ml y en algunos casos de 0.5 ml, entonces para tres d´ıas de incubaci´on y con insuficientes diluciones, las bacterias iban a presentar crecimiento masivo. Ahora bien, quedan estudios pendientes tras este art´ıculo como resolver la identificaci´on taxon´omica de los microorganismos para determinar y relacionar sus productos bioqu´ımicos y hacer an´alisis biotecnol´ogico.

. -0,05

0

0,05

0,1

0,15

0

7:53 20

40

60

8:42 100

120

Tiempo, t (min)

80

9:30

140

160

Crecimiento Bacilo Gram positivo

180

10:35

200

10:55

Curva de crecimiento

Medidas

Figura 6: Absorbancia en funci´on del tiempo para medir el crecimiento del bacilo gram positivo. Los marcadores registrados en la gr´afica son la hora tomada en el momento de la medida.

Absorbancia, A (A)

0,2

0,25

0,3

0,35

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0

8:00 20

40

60

100

120

Tiempo, t (min)

80

9:30

Crecimiento E. coli

140

160

10:30

180

11:00

200

Curva de crecimiento

Medidas

Figura 7: Absorbancia en funci´on del tiempo para medir el crecimiento de E. coli. Los marcadores registrados en la gr´afica son la hora tomada en el momento de la medida.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

Absorbancia, A (A) 0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

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