AISLAMIENTO DE HONGOS MICORRÍZICOS DE ALGUNAS ESPECIES DEL GÉNERO Bletia EN DOS MUNICIPIOS DEL ESTADO DE MÉXICO

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO

FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS

AISLAMIENTO DE HONGOS MICORRÍZICOS DE ALGUNAS ESPECIES DEL GÉNERO Bletia EN DOS MUNICIPIOS DEL ESTADO DE MÉXICO TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE INGENIERO AGRÓNOMO EN FLORICULTURA

PRESENTA: MAURICIO MORENO CAMARENA MODALIDAD: TESIS

ASESORES: Dra. MARÍA DEL PILAR ORTEGA LARROCEA M. en C. JOSÉ ANTONIO LÓPEZ SANDOVAL

18 DE JUNIO DE 2013 CAMPUS UNIVERSITARIO “EL CERRILLO”, EL CERRILLO PIEDRAS BLANCAS, MUNICIPIO DE TOLUCA, MÉXICO.

“Their highly modified flowers are, in the minds of most people, their hallmark, but the best and only truly universal character for the family is their unusual early developmental (postgermination) stage, the protocorm, which is the point at which orchids form their linkage with a symbiotic fungus.” Chase, 2005. Cortaremos, penetraremos de nuevo en el sertão en busca de esas curiosas flores que sólo se abren en los encendidos aires vibrantes, esos seres híbridos, intermediarios entre las plantas y los animales, esas flores cuyas fantásticas formas golpean mis sueños febriles, que estrechan mi garganta con pérfidas hojas de serpiente, y envenenan con sus efluvios el aire que respiro, esas terribles flores de una tierra podrida… ¡Ah, pero que bellas son! Me posee de nuevo el ansia de encontrar más, más horrorosas y más maravillosamente formadas. Cazador de orquídeas Ernst Löhndorff Se podrá decir que la mariposa es una flor que vuela. Yo sueño con una que sería tan grande como cien universos, con alas cuya forma, belleza, color y movimiento ni siquiera puedo describir. Pero la veo...va de estrella a estrella, refrescándolas y perfumándolas con el soplo armonioso y ligero de su vuelo...y los pueblos que allí habitan la miran pasar, extasiados y maravillados... El Horla Guy de Maupassant Absurdity is Reason’s boogeyman. House of Mystery 29 Matthew Sturges

AGRADECIMIENTOS

Esta tesis contó con el financiamiento del proyecto PAPIIT IT101812 Implementación de Servicios Ecosistémicos en una Zona de Amortiguamiento en Ciudad Universitaria (UNAM) y CONACYT-Código de Barras de la Vida Campaña Hongos, así como dentro del programa de becas internas del Instituto de Geología de la UNAM. La presente investigación se realizó en el Laboratorio de Microcosmos Bioedáfico, el Laboratorio de Microscopía (Edafología) y el Invernadero Automatizado del Departamento de Edafología, Instituto de Geología, UNAM, bajo la dirección de la Dra. María del Pilar Ortega Larrocea. Al Dr. Gerardo Salazar del Instituto de Biología de la UNAM por la determinación taxonómica de Bletia neglecta Sosa. A la Dra. María del Pilar Ortega Larrocea por abrirme las puertas del laboratorio y todas las lecciones académicas y personales que me ha brindado hasta ahora. Al M. en C. José Antonio López Sandoval por el apoyo y la confianza así como la valiosa información compartida. A la M. en C. Iris Suárez Quijada y la M. en C. Mónica Rangel Villafranco por el apoyo técnico proporcionado durante la realización de este trabajo. A la Universidad Autónoma del Estado de México y a la Facultad de Ciencias Agrícolas que formaron académicamente a la persona que soy ahora. Al Ingeniero Agrónomo en Floricultura José Humberto Nava Bernal que amablemente compartió la localización de algunas especies en campo. ii

DEDICATORIAS

Al género Bletia y a sus hongos micorrízicos conocidos y por conocer porque me enseñaron a cambiar mi vida y mejorar. A la Dra. María del Pilar Ortega Larrocea por permitirme entrar al maravilloso mundo de la ciencia, por todas las oportunidades brindadas y el conocimiento compartido, la paciencia que tuvo (tal vez excesiva), la confianza y por esa pequeña lección sobre la ciencia que cambió mi forma de ver el mundo. Al M. en C. José Antonio López Sandoval, por el conocimiento compartido, por la confianza que tuvo en un tema que otros rechazaron. A los microcósmicos más antiguos que conozco: Néstor y Liliana que han compartido casi todo este trabajo en el laboratorio, perdón si a veces soy insoportable. A mi madre, la Sra. Felipa Camarena Dionicio por enseñarme a ser mejor cada día, a no dejarme vencer por la adversidad, a aprender algo siempre y por enseñarme tres de las más grandes fuerzas de este mundo, por permitirme esos paseos arriesgados y usar su jardín como campo de restauración, por apoyarme siempre y dejar que mis locos sueños tomen forma, poco a poco y firmemente, por soportar todos estos años lo que ella llama “mis rarezas”, por resistir estoicamente mi horrible carácter, mis manías tan irritantes, mi monstruosa falta de empatía pero cuyo conjunto que me hacen lo que soy y de las cuales usted (gracias) es casi totalmente responsable, nunca dejaré de estar agradecido. A mi padre, el Sr. Lauro Moreno Dávila por enseñarme que no podemos confiar en todas las personas y menos en nosotros mismos, por enseñarme que el temor es irrelevante si sabemos lo que tenemos que hacer. A mi hermana Patricia Moreno Camarena por ser siempre tan distraída. A mi hermana Laura Moreno Camarena por enseñarme que la fuerza de voluntad puede llevarte dentro de ti mismo. Al por ahora pequeño Leonardo Suré Mondragón Moreno, porque el mundo es tuyo y de los que vienen y por enseñarme que siempre hay algo nuevo por aprender…un día podrás leer esto, ojalá en un mundo mejor y entenderás la inspiración que representas. A Wallace, porque la ignorancia no es sinónimo de malos sentimientos. iii

A Madreselva, por enseñarme que no importa que tan lejos de tu mundo te encuentres, vivir es posible. A los que sin saberlo fueron enemigos, grandes arquitectos de mi persona, porque con sus trabas y problemas siempre me volvieron más fuerte (y más raro). A la mujer desconocida que un día me ofreció un vaso con agua y al hombre que evitó un día que tomara cierto camino. A esa persona especial que me ha enseñado tanto y que sigue sin saberlo.

iv

ÍNDICE Página AGRADECIMIENTOS .................................................................................................. ii DEDICATORIAS ........................................................................................................... iii ÍNDICE ............................................................................................................................ v LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................... ix LISTA DE CUADROS.....................................................................................................x LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... xi LISTA DE ANEXOS .................................................................................................... xiii RESUMEN .................................................................................................................... xiv ABSTRACT.................................................................................................................... xv 1.

INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 1

2.

REVISIÓN DE LITERATURA ................................................................................ 4

2.1.

Generalidades de la familia Orchidaceae ......................................................... 4

2.2.

El género Bletia spp. ............................................................................................. 5

2.2.1.

Bletia adenocarpa Reichb. f. ............................................................................... 8

2.2.2.

Bletia gracilis Lodd. ........................................................................................... 9

2.2.3.

Bletia neglecta Sosa........................................................................................... 10

2.2.4.

Bletia punctata Lex. .......................................................................................... 11

2.2.5.

Bletia purpurata A. Rich. & Galeotti .............................................................. 13

2.3.

Micorriza orquideoide ....................................................................................... 15

2.3.1.

Tipos de colonización micorrízica ................................................................ 17

2.3.2.

Germinación de la semilla y desarrollo del protocormo .......................... 18

2.3.3.

Aislamiento de endofitos micorrízicos ........................................................ 20

2.3.3.1. 2.3.4. 3.

Identificación del hongo ............................................................................ 21 Germinación simbiótica ................................................................................. 23

MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................ 24

3.1.

Selección de los sitios de recolecta ................................................................... 24

3.2.

Descripción de los sitios de recolecta .............................................................. 24

v

3.3. Descripción general de los municipios donde se ubican los sitios de recolecta .......................................................................................................................... 25 3.3.1.

Malinalco ......................................................................................................... 25

3.3.1.1.

Localización geográfica .............................................................................. 25

3.3.1.2.

Fisiografía ..................................................................................................... 26

3.3.1.3.

Orografía ...................................................................................................... 26

3.3.1.4.

Hidrografía .................................................................................................. 26

3.3.1.5.

Clima ............................................................................................................. 27

3.3.1.6.

Geología........................................................................................................ 28

3.3.1.7.

Edafología .................................................................................................... 28

3.3.1.8.

Vegetación .................................................................................................... 29

3.3.2.

Ocuilan ............................................................................................................. 30

3.3.2.1.

Localización geográfica .............................................................................. 30

3.3.2.2.

Fisiografía ..................................................................................................... 30

3.3.2.3.

Orografía ...................................................................................................... 31

3.3.2.4.

Hidrografía .................................................................................................. 31

3.3.2.5.

Clima ............................................................................................................. 31

3.3.2.6.

Geología........................................................................................................ 31

3.3.2.7.

Edafología .................................................................................................... 32

3.3.2.8.

Vegetación .................................................................................................... 32

3.4. 3.4.1.

Recolecta de raíces para el aislamiento de endofitos micorrízicos ............. 34 Caracterización semicualitativa de la colonización micorrízica .............. 35

3.5.

Aislamiento de endofitos micorrízicos ........................................................... 37

3.6.

Selección de hongos afines al complejo Rhizoctonia ...................................... 40

3.7.

Caracterización anamórfica de los aislados ................................................... 40

3.8.

Conservación de germoplasma de hongos micorrízicos orquideoides ..... 41

3.9.

Recolecta de semillas ......................................................................................... 42

3.10.

Conservación del germoplasma de orquídeas (semillas) ......................... 43

3.11. Pruebas preliminares del método de desinfestación para evaluar la germinación.................................................................................................................... 43 3.11.1.

Método del sobre en Bletia gracilis ............................................................ 43 vi

3.11.2.

Método de la jeringa en Bletia campanulata.............................................. 44

3.12. 4.

Germinación simbiótica y asimbiótica de Bletia spp. ................................ 45

RESULTADOS ........................................................................................................ 48

4.1.

Especies encontradas en los sitios de recolecta .............................................. 48

4.2.

Recolecta de raíces para el aislamiento de endofitos .................................... 51

4.2.1.

Caracterización semicualitativa de la colonización micorrízica .............. 51

4.2.1.1.

Colonización micorrízica en Bletia adenocarpa......................................... 51

4.2.1.2.

Colonización micorrízica en Bletia gracilis ............................................... 52

4.2.1.3.

Colonización micorrízica en Bletia neglecta ............................................. 52

4.2.1.4.

Colonización micorrízica en Bletia punctata ............................................ 52

4.2.1.5.

Colonización micorrízica en Bletia purpurata .......................................... 53

4.3.

Eficiencia de los métodos de aislamiento de endofitos micorrízicos ......... 57

4.4.

Selección de hongos afines al complejo Rhizoctonia ...................................... 59

4.4.1.

Caracterización morfológica de todos los aislados micorrízicos ............. 59

4.4.1.1.

Pruebas enzimáticas en los aislados micorrízicos .................................. 62

4.4.1.2.

Tinción DAPI ............................................................................................... 62

4.5.

Caracterización morfométrica .......................................................................... 63

4.5.1.

Tasa de crecimiento ........................................................................................ 63

4.5.2.

Desarrollo de monilias ................................................................................... 65

4.5.3.

Diámetro de las hifas...................................................................................... 67

4.5.4.

Distancia al septo basal .................................................................................. 69

4.5.5.

Ángulo de bifurcación ................................................................................... 70

4.6.

Conservación de germoplasma de hongos micorrízicos orquideoides ..... 71

4.7.

Descripción de los aislados micorrízicos ........................................................ 72

4.8.

Recolecta de semillas ......................................................................................... 89

4.8.1. 4.9.

Descripción cualitativa de las semillas recolectadas ................................. 90 Conservación del germoplasma de orquídeas (semillas) ............................. 90

4.10. Pruebas preliminares del método de desinfestación para evaluar la germinación.................................................................................................................... 91 4.10.1.

Método del sobre en Bletia gracilis ............................................................ 91

4.10.2.

Método de la jeringa en Bletia campanulata.............................................. 92 vii

4.11.

Germinación simbiótica y asimbiótica en Bletia spp. ................................ 93

4.11.1.

Germinación y morfogénesis en Bletia gracilis ........................................ 93

4.11.2.

Germinación y morfogénesis en Bletia neglecta ....................................... 93

4.11.3.

Germinación y morfogénesis en Bletia punctata...................................... 95

4.11.4.

Germinación y morfogénesis en Bletia purpurata ................................... 96

4.11.5.

Germinación y morfogénesis en Bletia urbana ........................................ 97

5.

DISCUSIÓN .......................................................................................................... 114

5.1.

Caracterización semicualitativa de la colonización..................................... 114

5.2.

Eficiencia de los métodos de aislamiento de endofitos .............................. 115

5.3. Caracterización morfológica y morfométrica de los aislados micorrízicos…. ............................................................................................................. 117 5.4.

Recolecta de semillas ....................................................................................... 119

5.4.1. 5.5.

Descripción cualitativa de las semillas recolectadas ............................... 119 Germinación simbiótica y asimbiótica .......................................................... 120

6.

PERSPECTIVAS Y SUGERENCIAS .................................................................. 125

7.

CONCLUSIONES ................................................................................................ 126

8.

LITERATURA CITADA ...................................................................................... 128

9.

ANEXOS................................................................................................................ 139

viii

LISTA DE ABREVIATURAS AWA

Medio Acid Water Agar

Ba

Bletia adenocarpa

Bg

Bletia gracilis

Bn

Bletia neglecta

Bp

Bletia punctata

DAPI

4´-6´diamidino-2-fenilindol

dds

Días después de siembra

EE

Error estándar

HMO

Hongos micorrízicos orquideoides

KC

Medio Knudson C

MAF

Medio de aislamiento fúngico

MAT

Medio de ácido tánico

MBA

Medio básico de avena

MCC

Clave del Laboratorio de Microcosmos Bioedáfico

MMC

Clave personal de recolector (Mauricio Moreno Camarena)

MSm

Medio Murashige and Skoog (modificado)

PDA

Medio Papa-Dextrosa-Agar

PDB

Medio Papa-Dextrosa-Caldo (Potato-Dextrose-Broath)

PVLG

Alcohol polivinílico lacto-glicerol

REPSA Reserva Ecológica del Pedregal de San Ángel

ix

LISTA DE CUADROS Página Cuadro 1. Métodos de aislamiento de endofitos micorrízicos. .............................. 38 Cuadro 2. Número de semillas sembradas in vitro con los distintos aislados y especies usadas en las pruebas de germinación simbiótica y asimbiótica. .......... 46 Cuadro 3. Raíces de orquídeas recolectadas en los diferentes sitios. .................... 50 Cuadro 4. Colonización micorrízica y estado de los pelotones de raíces de Bletia spp. .................................................................................................................................. 54 Cuadro 5. Características morfológicas de las colonias de hongos micorrízicos. 79 Cuadro 6. Características fisiológicas y morfológicas de las colonias de hongos micorrízicos. ................................................................................................................... 81 Cuadro 7. Características morfométricas de las hifas de los aislados micorrízicos. .......................................................................................................................................... 83 Cuadro 8. Características morfométricas de los aislados micorrízicos agrupados por fotobionte. ............................................................................................................... 85 Cuadro 9. Características morfométricas de los aislados micorrízicos agrupados por fotobionte. ............................................................................................................... 85 Cuadro 10. Semillas recolectadas en los tres sitios de estudio. .............................. 89 Cuadro 11. Germinación y estadios de desarrollo alcanzados en Bletia gracilis en los diferentes tratamientos. .......................................................................................... 93 Cuadro 12. Germinación y estadios de desarrollo alcanzados en Bletia neglecta en los diferentes tratamientos. .......................................................................................... 95 Cuadro 13. Germinación y estadios de desarrollo alcanzados en Bletia punctata en los diferentes tratamientos...................................................................................... 96 Cuadro 14. Germinación y estadios alcanzados en Bletia purpurata por los diferentes tratamientos ................................................................................................. 97 Cuadro 15. Germinación y estadios alcanzados en Bletia urbana con los diferentes tratamientos ................................................................................................. 98 Cuadro 16. Germinación y morfogénesis de Bletia gracilis alcanzadas a los diferentes tiempos (T0-T3) con los distintos aislados, testigo y control................ 99 Cuadro 17. Germinación y morfogénesis de Bletia neglecta alcanzadas a los diferentes tiempos (T0-T3) con los distintos aislados, testigo y control.............. 102 Cuadro 18. Germinación y morfogénesis de Bletia punctata alcanzadas a los diferentes tiempos (T0-T3) con los distintos aislados, testigo y control.............. 105 Cuadro 19. Germinación y morfogénesis de Bletia purpurata alcanzadas a los diferentes tiempos (T0-T3) con los distintos aislados, testigo y control.............. 108 Cuadro 20. Germinación y morfogénesis de Bletia urbana alcanzadas a los diferentes tiempos (T0-T3) con los distintos aislados, testigo y control.............. 111

x

LISTA DE FIGURAS Página Figura 1. Apariencia general de una especie del género Bletia................................. 7 Figura 2. Bletia adenocarpa en el sitio Club de Golf, Malinalco, Estado de México.. ............................................................................................................................................ 9 Figura 3. Bletia gracilis en el sitio Camino de Peregrinaje, Chalmita, Ocuilan, Estado de México .......................................................................................................... 10 Figura 4. Bletia neglecta del sitio Club de Golf, Malinalco, Estado de México ...... 11 Figura 5. Bletia punctata en el sitio Club de Golf, Malinalco, Estado de México. . 12 Figura 6. Bletia purpurata en la Reserva Ecológica del Pedregal de San Ángel, México D. F..................................................................................................................... 15 Figura 7. Dos tipos de colonización micorrízica de las raíces de orquídeas......... 18 Figura 8. Germinación de la semilla y desarrollo del protocormo ........................ 19 Figura 9. Características del género-forma Rhizoctonia. .......................................... 22 Figura 10. Municipios del Estado de México donde se ubican los sitios de estudio. ............................................................................................................................ 34 Figura 11. Rizósfera de Bletia gracilis en el sitio 2.. ................................................... 35 Figura 12. Diferentes estadios de los pelotones en un corte transversal de una raíz de Bletia sp. ............................................................................................................. 36 Figura 13. Crecimientos de hifas en medio MAF ..................................................... 39 Figura 14. Cápsulas ....................................................................................................... 42 Figura 15. Germinación in situ de Bletia gracilis en el Sitio 1. Desarrollo de la germinación in situ ........................................................................................................ 49 Figura 16. Colonización micorrízica del córtex de las raíces en las orquídeas .... 56 Figura 17. Diferentes aislados fúngicos obtenidos de las raíces de las plantas.... 57 Figura 18. Crecimiento de las colonias de hongos micorrízicos en PDA .............. 61 Figura 19. Reacción de los aislados en MAT ............................................................. 62 Figura 20. Tinción de núcleos por DAPI de los diferentes aislados micorrízicos. .......................................................................................................................................... 63 Figura 21. Tasa promedio de crecimiento diario de los diferentes aislados ......... 64 Figura 22. Tasas diarias de crecimiento de los diferentes aislados por fotobionte. .......................................................................................................................................... 65 Figura 23. Ancho de las monilias de los diferentes aislados ................................... 66 Figura 24. Ancho de las monilias de los diferentes aislados agrupados por fotobionte........................................................................................................................ 67 Figura 25. Diámetro de las hifas de los diferentes aislados .................................... 68 Figura 26. Diámetro de las hifas de los diferentes aislados agrupados por fotobionte........................................................................................................................ 68 xi

Figura 27. Distancia al septo basal en los diferentes aislados................................. 69 Figura 28. Distancia al septo basal en los diferentes aislados agrupados por fotobionte........................................................................................................................ 70 Figura 29. Ángulo de ramificación de las hifas de los diferentes aislados ........... 71 Figura 30. Hifas de aislados no rizoctónicos y micorrízicos. .................................. 86 Figura 31. Hifas y monilias de los aislados micorrízicos......................................... 87 Figura 32. Hifas y monilias de los aislados micorrízicos ......................................... 88 Figura 33. Semillas de diferentes especies del género Bletia: a) B. gracilis; b) B. neglecta; c) B. punctata; d) B. punctata; e) Bletia sp., contaminada con hongos; f) B. purpurata ......................................................................................................................... 91 Figura 34. Cormos de Bletia campanulata germinados con el aislado Ba05 a los 298 dds ............................................................................................................................ 92

xii

LISTA DE ANEXOS Página Anexo 1. Laminillas de respaldo de las diferentes semillas recolectadas (a) ..... 139 Anexo 2. Laminillas de respaldo de las diferentes semillas recolectadas (b) ..... 141 Anexo 3. Laminillas de respaldo de los diferentes protocormos (a) ................... 143 Anexo 4. Laminillas de respaldo del micelio externo de los diferentes endofitos aislados (a) .................................................................................................................... 145 Anexo 5. Ubicación, hábitat y fecha de montaje del micelio externo de los diferentes endofitos (a) ............................................................................................... 151 Anexo 6. Características de las monilias de los diferentes endofitos (a) ............. 157 Anexo 7. Características de las hifas vegetativas de los diferentes endofitos (a) ........................................................................................................................................ 163 Anexo 8. Laminillas de respaldo de las diferentes raíces de las plantas (a) ....... 169 Anexo 9. Patrones de colonización de las diferentes raíces de las plantas (a) ... 172 Anexo 10. Endofitos micorrízicos ingresados al Banco de Germoplasma del Laboratorio de Microcosmos Bioedáfico, ubicación y origen (a) ......................... 175 Anexo 11. Métodos de aislamiento, fechas de subcultivo y almacenamiento de los endofitos micorrízicos ingresados al Banco de Germoplasma (a) ................. 179 Anexo 12. Apariencia de las colonias de los endofitos micorrízicos ingresados al Banco de Germoplasma (a) ........................................................................................ 182 Anexo 13. Semillas de las diferentes orquídeas ingresadas al Banco de Germoplasma del Laboratorio de Microcosmos Bioedáfico, ubicación y pruebas de germinación (a) ...................................................................................................... 184 Anexo 14. Medios de cultivo empleados ................................................................. 187

xiii

RESUMEN AISLAMIENTO DE HONGOS MICORRÍZICOS DE ALGUNAS ESPECIES DEL GÉNERO Bletia EN DOS MUNICIPIOS DEL ESTADO DE MÉXICO Mauricio Moreno Camarena. Ingeniero Agrónomo en Floricultura. Universidad Autónoma del Estado de México. Facultad de Ciencias Agrícolas. Asesores: 1 Dra. María del Pilar Ortega Larrocea, 2 M. en C. José Antonio López Sandoval 1. Universidad Nacional Autónoma de México. Instituto de Geología. Departamento de Edafología. Circuito Exterior de Ciudad Universitaria. México D. F. Apartado Postal 70-296, C. P. 04511. Tel. (52) 55 56 22 42 87 ext. 141; Fax: (52) 55 56 22 43 17. [email protected]. 2. Universidad Autónoma del Estado de México. Facultad de Ciencias Agrícolas. Campus Universitario El Cerrillo, El Cerrillo Piedras Blancas Mpio. de Toluca, Méx. Código Postal 50200. Tel. (fax) 2-96-55-29 y 2-96-55-31. [email protected]

Las semillas de las orquídeas se asocian a hongos micorrízicos para su germinación y desarrollo; dichos hongos pueden emplearse en la germinación simbiótica para la reintroducción de especies amenazadas. Con el objetivo de conocer los hongos micorrízicos asociados Bletia adenocarpa, B. gracilis, B. neglecta, B. punctata y B. purpurata en algunos sitios de los municipios de Ocuilan y de Malinalco, Estado de México; se aplicaron diversos métodos de aislamiento. Se obtuvieron 28 endofitos correspondientes al anamorfo Epulorhiza; los aislados de B. punctata mostraron diferencias significativas en la tasa de crecimiento, ancho de monilias y distancia al septo basal. Se contrastó la germinación simbiótica y asimbiótica de Bletia gracilis, B. neglecta, B. punctata, B. purpurata y B. urbana con siete endófitos. Bletia neglecta, B. punctata, B. purpurata alcanzaron mayor crecimiento y desarrollo en los tratamientos simbióticos con la formación de raíces y hojas verdaderas y un mayor tamaño en menor tiempo, en comparación con los tratamientos asimbióticos. Palabras clave: Bletia, Epulorhiza, germinación simbiótica y asimbiótica. xiv

ABSTRACT AISLAMIENTO DE HONGOS MICORRÍZICOS DE ALGUNAS ESPECIES DEL GÉNERO Bletia EN DOS MUNICIPIOS DEL ESTADO DE MÉXICO Mauricio Moreno Camarena. Ingeniero Agrónomo en Floricultura. Universidad Autónoma del Estado de México. Facultad de Ciencias Agrícolas. Asesores: 1 Dra. María del Pilar Ortega Larrocea, 2 M. en C. José Antonio López Sandoval 1. Universidad Nacional Autónoma de México. Instituto de Geología. Departamento de Edafología. Circuito Exterior de Ciudad Universitaria. México D. F. Apartado Postal 70-296, C. P. 04511. Tel. (52) 55 56 22 42 87 ext. 141; Fax: (52) 55 56 22 43 17. [email protected]. 2. Universidad Autónoma del Estado de México. Facultad de Ciencias Agrícolas. Campus Universitario El Cerrillo, El Cerrillo Piedras Blancas Mpio. de Toluca, Méx. Código Postal 50200. Tel. (fax) 2-96-55-29 y 2-96-55-31. [email protected]

Orchids seed associates with mycorrhizal fungi for germination and development, these fungi can be used in symbiotic germination for reintroduction of threatened species. With the aim of knowing mycorrhizal fungi associated with Bletia adenocarpa, B. gracilis, B. neglecta, B. punctata and B. purpurata in two sites of municipality of Ocuilan and one in Malinalco, Mexico State, different isolation methods were applied. 28 endophytes correspond with the anamorphic genus Epulorhiza were isolated; Bletia punctata isolates showed significant differences in growth rate, monilioid cell size and distance to basal septum. Symbiotic and asymbiotic germination was contrasted for Bletia gracilis, B. neglecta, B. punctata, B. purpurata and B. urbana with seven endophytes, Bletia neglecta, B. punctata, B. purpurata achieved further growth and development in the symbiotic treatments presenting true roots and leaves compared with asymbiotic treatments. Keywords: Bletia, Epulorhiza, asymbiotic and symbiotic germination.

xv

1. INTRODUCCIÓN

La familia Orchidaceae presenta características que la distinguen de otras familias botánicas como son la coevolución con insectos para su polinización y la asociación con hongos micorrízicos que les permiten a las semillas germinar y absorber nutrimentos. En algunas especies, esta asociación perdura durante toda la vida de la planta. La importancia ecológica de la simbiosis micorrízica ha sido ampliamente reconocida en varios países del mundo (Shimura y Koda, 2005; Bonardeaux et al., 2007; Stewart y Kane(2007). En México existen más de 1000 especies de orquídeas, distribuidas a lo largo del territorio nacional (Hágsater et al., 2005); en el Estado de México se encuentran gran cantidad de especies, la mayoría de ellas en algún estado de amenaza. Como en otras partes del mundo, la diversidad de orquídeas mexicanas se encuentra amenazada por factores que van desde las actividades agrícolas, la ganadería, los incendios forestales, el cambio climático, la recolecta de especies para venta en mercados locales e internacionales, el desarrollo urbano, turístico y/o industrial entre otros (Soto et al., 2007). La conservación de las especies es por lo tanto necesaria y debe abordarse en una forma integral mediante el estudio enfocado a la comprensión de las interacciones de la planta con su medio. En las orquídeas estas interacciones incluyen la relación planta-hongo, los síndromes de polinización, la estructura genética de la población, los procesos evolutivos, sus requerimientos ecológicos in situ y la conservación ex situ (Swarts et al., 2007). Una de las limitantes de la aplicación de cualquier esquema de conservación en México es la gran diversidad de ecosistemas y especies. Esta diversidad impide que un solo estudio pueda ser generalizado para todas las especies o hábitats, por lo cual la información sobre una especie o género representado en diversos 1

hábitats del país es una forma viable de crear protocolos que permitan saber si pueden ser aplicados a otras especies. Uno de los métodos de conservación es la utilización de hongos micorrízicos para la propagación de semillas y su posterior reintroducción a su hábitat original con fines de restauración o la implementación de tecnologías para su uso sostenible (Ortega-Larrocea, 2008). Debido a que las orquídeas pueden ser específicas con sus hongos micorrízicos, es necesario llevar a cabo aislamientos por especie y sitio para conocer los endofitos que pueden promover la germinación y el desarrollo de las especies en estudio. El género Bletia está ampliamente distribuido en el país y bien representado en el Estado de México siendo uno de los géneros ideales para estudiar sus asociaciones micorrízicas en diversos ambientes. El interés es conocer el grado de especificidad de algunas especies para saber si la tolerancia al disturbio de algunas puede deberse a su habilidad para recurrir a una amplia gama de endofitos o si su distribución restringida se dé por el fenómeno inverso. Con la realización de esta investigación se logrará el aislamiento e identificación de los hongos asociados por localidad y especie, así como la evaluación de su capacidad para inducir la germinación y desarrollo que determinaran su aptitud como endofitos potenciales para la conservación de germoplasma orquídeahongo, el perfeccionamiento de técnicas de aislamiento y las bases para la elaboración de protocolos de conservación y aprovechamiento sostenible de especies que se encuentran en alguna categoría de riesgo. A fin de entender estas relaciones micorrízicas en algunas especies del género y contar con un banco de germoplasma tanto de semillas de orquídeas y endofitos micorrízicos se plantearon los siguientes objetivos:

2

Objetivo general Conocer los hongos micorrízicos asociados a diversas especies del género Bletia en dos localidades del municipio de Ocuilan y una localidad del municipio de Malinalco, Estado de México; para evaluar su capacidad de inducción a la germinación simbiótica.

Objetivos específicos 1. Identificar por medio de características morfológicas y morfométricas a los hongos micorrízicos aislados de raíces de plantas adultas de: Bletia adenocarpa Reichb. f., Bletia gracilis Lodd., Bletia neglecta Sosa, Bletia punctata Lex. y Bletia purpurata A. Rich. & Galeotti, en dos sitios de Ocuilan de Arteaga y uno en Malinalco, Estado de México. 2. Evaluar la germinación y morfogénesis simbiótica y asimbiótica in vitro de las especies: Bletia gracilis Lodd., Bletia neglecta Sosa, Bletia punctata Lex., Bletia purpurata A.Rich. & Galeotti y Bletia urbana Dressler. 3. Conservar en el Banco de Germoplasma del Laboratorio de Microcosmos Bioedáfico del Instituto de Geología (UNAM) el germoplasma de hongos micorrízicos asociados a plantas adultas de las especies Bletia adenocarpa Reichb. f., Bletia gracilis Lodd., Bletia neglecta Sosa, Bletia punctata Lex. y Bletia purpurata A. Rich. & Galeotti de dos sitios de Ocuilan de Arteaga y uno en Malinalco, Estado de México así como de las semillas de las mismas especies.

Asimismo se planteó la siguiente hipótesis: El uso de hongos micorrízicos orquideoides aislados de plantas adultas del género Bletia promueve la germinación de las semillas de la misma especie y de manera diferencial la de otras especies del mismo género incrementando la germinación y el desarrollo en comparación con medios de cultivo asimbióticos. 3

2. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1. Generalidades de la familia Orchidaceae Las familia Orchidaceae se divide en cinco subfamilias presentes en todas las regiones habitables del planeta: Apostasioideae (dos géneros y 16 especies); Vanilloideae (15 géneros y 250 especies); Cypripedioideae (cinco géneros y 155 especies); Orchidoideae (210 géneros y casi 5000 especies) y Epidendroideae (576 géneros y 15,000 especies) (Hágsater et al., 2005; Górniak et al., 2010). En México se han descrito 1254 especies (Soto-Arenas et al., 2007). De acuerdo con Hágsater et al. (2005) las orquídeas son plantas herbáceas con dos hábitos de crecimiento: monopódico, donde un meristemo apical da origen a un eje principal y simpódico, donde el eje está formado por vástagos consecutivos generados de meristemos laterales, basales o apicales creciendo desde los vástagos anteriores. Los pseudobulbos son tallos aéreos engrosados presentes en la mayoría de las especies epifitas. Su contraparte subterránea son los cormos, ambas estructuras almacenan agua y sustancias de reserva, usadas para sostener la producción de flores, frutos y el desarrollo de nuevas hojas. Las raíces son simples o ramificadas, carnosas, con un diámetro de 1-10 mm o más dependiendo de la especie; constan de un cilindro vascular rodeado por la endodermis, el córtex, la exodermis formada por células engrosadas e impermeables y otra capa delgada permeable. La porción más externa es el velamen, un tejido esponjoso compuesto de células sin citoplasma pero que conservan las paredes celulares y que no siempre está presente o desarrollado de la misma manera en todas las especies. Las raíces de las orquídeas epifitas suelen ser fotosintéticas, perennes y constantes a lo largo del año. Las raíces de las especies terrestres son usualmente no fotosintéticas y con una vida media de aproximadamente tres años. Estas 4

suelen presentar una marcada estacionalidad en el crecimiento y la composición, usualmente están bajo el suelo o humus. Algunas orquídeas terrestres presentan dos tipos de raíces morfológicamente distintas, unas micorrízicas y otras no micorrízicas con un xilema engrosado y mayor cantidad de amiloplastos (Bayman y Otero, 2006). Las hojas pueden presentar suculencia o ser muy delgadas, éstas últimas mueren y caen al final de la época de crecimiento permaneciendo las estructuras de almacenamiento que generarán nuevos vástagos al año siguiente (Hágsater et al., 2005). Las flores son solitarias o agrupadas en racimos o panículas, basales o apicales; la polinización es realizada por insectos y aves principalmente (Hágsater et al., 2005). El fruto es una cápsula que al madurar se abre longitudinalmente para liberar las semillas. El número de semillas por fruto varía de unas pocas miles hasta cuatro millones; las semillas miden de 0.3 a 4 mm de longitud y pesan de 0.4 a 2 μg. El embrión es diminuto e indiferenciado y las semillas carecen de reservas nutritivas (Arditti, 1992).

2.2. El género Bletia spp. Bletia Ruíz & Pavón es el género más grande de la subtribu Bletiinae (Sosa, 2007). México es su centro de diversificación encontrándose 27 especies, 18 de las cuales son endémicas (Dressler, 1968; Espejo-Serna, 2012). El género se encuentra bien representado en la Sierra Madre Occidental y el Cinturón Volcánico Transversal (Sosa, 1994). En el Estado de México se han descrito 14 especies: Bletia adenocarpa, B. campanulata, B. coccinea, B. ensifolia, B. gracilis, B. jucunda, B. lilacina, B.

5

macristhmochila, B. neglecta, B. parkinsonii, B. punctata, B. purpurata, B. purpurea y B. roezlii (Collado et al., 2009). Entre los usos tradicionales del género están la obtención del tzacuhitli o zautle, pegamento para el arte plumario, uso en mosaicos o como aglutinante para pintura (Heyden, 1995), para el control de la disentería (Bletia campanulata y B. coccinea) (Urbina, 1903) y el alivio de cortadas, quemaduras, heridas, trastornos estomacales y envenenamiento (B. purpurea) (García-Peña, 1981). En el aspecto ornamental se ha documentado la venta de Bletia macristhmochila en el mercado de Jamaica en el D. F. (Munguía, 2008). Jezek (2005) mencionó el uso ornamental del género sin referirse a alguna especie en particular. La clasificación taxonómica del género más reciente (Missouri Botanical Garden, 2011) fue: Reino: Plantae División: Magnoliophyta Clase: Equisetopsida C. Agardh Subclase: Magnoliidae Novák ex Takht. Superdorden: Lilianae Takht. Orden: Asparagales Link. Familia: Orchidaceae Juss. Subtribu: Bletiinae Benth. Género: Bletia Ruiz & Pav. La descripción del género según McVaugh (1985) (Fig. 1) es: Hierbas terrestres, erectas; con pseudobulbos subglobosos, epígeos o hipógeos, ocasionalmente tuberosos; pocas hojas (o sin ellas en la floración), plicadas, pecioladas, articuladas; inflorescencia racemosa, los escapos laterales sobre los pseudobulbos, sin hojas; sépalos subiguales, libres o los laterales un tanto connatos y gibosos en la base; los pétalos similares al sépalo dorsal; labelo libre, 6

erecto, entero o 3-lobado, la base usualmente contraída, ocasionalmente gibosa; lóbulos laterales usualmente anchos, paralelos o con las puntas extendidas; lóbulo medio erecto o recurvado, a menudo retuso o bilobado; disco usualmente lamelado; columna elongada, subterete, alada, a menudo con 2 aurículas en la base, sin base o con base corta; antera operculada, incumbente; polinias 8, cerosas; fruto cápsula cilíndrica a elipsoidal.

Figura 1. Apariencia general de una especie del género Bletia: Bletia punctata Lex. a) Hábito; b) Flor vista de frente; c) Flor, vista lateral; d) Partes florales extendidas; e) Ápice de la columna; f) Polinias. Ilustración por Manuel Escamilla basada en Sosa & Zamudio 1287 (Tomado de Sosa, 1992).

A continuación se describen las especies estudiadas en el presente trabajo.

7

2.2.1. Bletia adenocarpa Reichb. f. Es una especie endémica de México (Espejo, 2012). Se distribuye en los estados de Michoacán, Guerrero, Estado de México y Morelos (Martínez y Matuda, 1979) en bosques de encino y en el bosque tropical caducifolio; en el Estado de México se le describe en el municipio de Ocuilan (Collado et al., 2009), desde 1800 a 1900 msnm (Nava-Bernal, 2008) (Fig. 2). La descripción botánica de la especie es la siguiente (McVaugh, 1985; Nava-Bernal, 2008): Hierba terrestre, perenne, cormos elipsoides, horizontales o verticales, de 1-2 cm; raíces delgadas, blanquecinas, de 2 mm de grosor; hojas 1 -2 al tiempo de la floración, largamente pecioladas, la hoja de 15-30 cm de longitud, (1-) 2-4 cm de ancho, aparentando surgir cerca de la base del escapo floral, envueltas todas ellas por (usualmente 2) vainas cilíndricas; escapo floral de 30-70 cm de alto, los racimos menores a 15 cm de largo, con más de 15 flores, los ovarios pedicelados ascendentes, de 1-2 cm de largo, ligera a evidentemente papilosos; perianto en forma de embudo, amarillo brillante o “amarillo mantequilla” o rojo cobrizo hacia afuera y amarillo pálido adentro, el labelo con una banda roja transversal o marcas rojas submarginales o los lóbulos con venas rojas, el callo rojo; sépalos dorsales de (1.2) 1.7-2 cm de largo, 3-4 mm de ancho; sépalos laterales oblicuamente curvados, más cortos y amplios, poco mas de 5 mm de ancho; pétalos similares a los sépalos laterales; labelo de 1-1.4 de largo, obovadoflabeliforme, cuneado en la base, aproximadamente 8 mm de ancho cuando extendido, con dos lóbulos laterales obtuso ascendentes por encima de la mitad, estos ca. 3 mm de largo y ancho; lóbulo terminal oblongo, retuso, ca. 3 mm de largo y ancho, sobrepasando a los lóbulos laterales, coronado con una lamela carnosa de 1 mm de alto; columna de 8-10.5 mm de largo; fruto una cápsula elipsoide. Florece de junio a octubre.

8

Figura 2. Bletia adenocarpa en el sitio Club de Golf, Malinalco, Estado de México. Foto: MorenoCamarena, 2010.

2.2.2. Bletia gracilis Lodd. Espejo (2012) menciona que es una especie endémica de México. Crece en bosques de encino y de encino-pino a altitudes entre 1200 y 2200 msnm. En el Estado de México está descrita en los municipios de Ocuilan, Sultepec, Tejupilco y Temascaltepec (Collado et al., 2009) (Fig. 3). La descripción de la especie es la siguiente (Espejo et al., 2002; Nava-Bernal, 2008): Son plantas terrestres de hasta 25 cm de alto, con los cormos purpúreos, ovoides, de 2.5 a 3 cm de diámetro; raíces delgadas, blanquecinas, de 2 mm de grosor; hojas una a tres, cortamente pecioladas, purpúreas en el envés, verdeobscuras en el haz, plegadas, elíptico-ovadas a lanceoladas, presentes en la época de floración. Flores de ca. 2.5 cm de largo, campanuladas, de color verdeamarillento a rosado y con el labelo de color verde manzana con venas rojas o púrpuras, trilobado, con una costilla longitudinal, el lóbulo medio orbicular9

obcordado a orbicular-subcuadrado. Racimos con tres a cinco flores, péndulas; fruto una cápsula elíptica. Florece de julio a noviembre.

Figura 3. Bletia gracilis en el sitio Camino de Peregrinaje, Chalmita, Ocuilan, Estado de México. Foto: Moreno-Camarena, 2010.

2.2.3. Bletia neglecta Sosa Es una especie endémica de México (Espejo, 2012). Crece en bosque de encino, pino-encino, de abeto y en zonas abiertas de matorrales xerófitos desde 1750 a los 2740 msnm. En el Estado de México se le describe en los municipios de Ocuilan, Temascaltepec, Tepotzotlán, Texcoco y Tlalmanalco siendo la segunda especie con mayor distribución del género (Collado et al., 2009) (Fig. 4). La descripción de la especie es la siguiente (Espejo et al., 2002; Nava-Bernal, 2008): Plantas terrestres de hasta 60 cm de alto, con los cormos piriformes, de 2 a 4 cm de diámetro; raíces delgadas, blanquecinas de 1-2 mm de grosor; hojas una-dos, plegadas, verdes, lineares a lanceoladas, generalmente ausentes en la época de floración. Inflorescencia un racimo laxo, con 3-6 flores; flores de 3 a 3.5 cm de 10

diámetro, rosadas con blanco y con las venas conspicuas de color verde; labelo trilobado, recurvado y con cinco a siete quillas longitudinales. Fruto una cápsula elipsoide. Florece de octubre a enero.

Figura 4. Bletia neglecta del sitio Club de Golf, Malinalco, Estado de México. Foto: Moreno-Camarena, 2011.

2.2.4. Bletia punctata Lex. Es endémica de México, se le encuentra desde Jalisco hasta Oaxaca, Morelos, México, Puebla y Distrito Federal (Sosa, 2002). Espejo et al. (2002) mencionaron que el disturbio de la vegetación natural favorece el desarrollo de las poblaciones de esta especie. En el Estado de México se le encuentra en los municipios de Ocuilan, Temascaltepec y Tenancingo habitualmente en sitios abiertos o con algún grado de perturbación (Collado et al., 2009). En Ocuilan se le encuentra en bosque de encino seco y bosque tropical caducifolio de 1700 a 2000 msnm (Nava-Bernal, 2008) (Fig. 5). La descripción de McVaugh (1985) es: Hierba terrestre, perenne, de 65-96 cm de altura; raíces delgadas, blanquecinas, de 2 mm de grosor; cormos elipsoides a obovados; hojas comúnmente 3-4 en la 11

época de floración, (10) 20-33 cm de longitud, (2) 3-6 cm de ancho, largas, agudas, surgiendo con el escapo de vainas basales; escapo de 0.4 -1 m de altura, el racimo ca. 10-30 cm de longitud, aproximadamente 10 a 15 flores; ovarios pedicelados ascendentes o flexuosos, de 1.5-3 cm de largo; brácteas lanceoladas, de 0.8-1.5 cm de longitud; sépalos y pétalos verde-rojizo o amarillo-verdoso con venas púrpuras, el labelo color crema con venas rosa-violeta en los lóbulos; sépalos y pétalos oblanceolados, apiculados, de 1.5-1.8 cm de longitud; labelo algo declinado, ca. 1.3-1.6 cm de longitud, cuneado, subtruncado-emarginado en el ápice y de 5-8 mm de ancho, con un par de profundamente agudos y lisos lóbulos ovados de 3-5 mm de largo, bajo la parte media, aurículas conspicuas similares a lámelas en el lóbulo medio cercanas a la base; columna arcuada, 1012 mm de longitud; fruto una cápsula fusiforme, quillada. Florece de julio a septiembre.

Figura 5. Bletia punctata en el sitio Club de Golf, Malinalco, Estado de México. Foto: MorenoCamarena, 2010.

12

2.2.5. Bletia purpurata A. Rich. & Galeotti Se le encuentra en Chiapas, Baja California, Sinaloa, Durango, Nayarit, Jalisco, Michoacán, México, Morelos, Distrito Federal, Guerrero, Oaxaca, Tamaulipas, Veracruz, Chiapas en bosque de pino-encino (Sosa, 2002). En el Estado de México se le describe en los municipios de Ocuilan, Temascaltepec y Valle de Bravo (Collado et al., 2009); en Ocuilan se le encuentra desde 1700 a 2400 msnm (Nava-Bernal, 2008). Es posible que sea una especie favorecida por los disturbios, las especies de la zona central de México suelen autopolinizarse (Sosa, 2002) (Fig. 6). La descripción según Sosa (2002): Hierba terrestre, decidua, 25-60 cm de alto. Raíces pubescentes, flexuosas, blanquecinas, ca. 2 mm de grosor. Cormos creciendo verticalmente, subglobosos u ovoides, de 2-3.5 x ca. 2 cm; las vainas coriáceas, parduscas, la más externa larga, de alrededor de 15 cm de largo, llegando hasta la parte media de la base de las hojas. Hojas 1 ó 2, presentes en la floración, oblongo-elípticas hasta linear lanceoladas, largamente acuminadas, plicadas, de 10-45 x 1.5-6 cm, la base angostándose y articulada a un delgado peciolo. Inflorescencia racemosa, 20-50 cm de largo, con 1-6 flores, las flores a menudo dispuestas en un solo lado de la inflorescencia. Brácteas florales escariosas, muy distantes, triangulares, obtusas, de 5-8 mm de largo; brácteas del pedúnculo hasta de 20 mm de largo. Ovario arqueado o más bien erecto, sulcado, 1.5-2 cm de largo, ca. 2 mm de grosor. Flores resupinadas, colgantes, el perianto oblicuamente en forma de pera, hipocrateriforme, muy estrecho en la base, de 4-6 de largo, 2-2.7 cm de diámetro, tépalos púrpura-verdosos, blanquecinos, rosado sucio, o raramente cafépúrpura; labelo púrpura-rojo, rojo-pardusco o rosado púrpura, columna blanquecino-verdosa. Sépalos dorsal y laterales fusionados basalmente entre sí por 3-4 mm y muy similares, arqueados e incurvados, con los ápices aproximados, elíptico-oblanceolados, los laterales oblicuamente falcados, 13

agudos o subagudos, la base angostamente atenuada, ligeramente carnosos, a veces un poco verrucosos en los nervios, márgenes algo involutos, dorsalmente carinados, ca. 7- nervados, 25-35 x 5-8 mm. Pétalos oblanceolados, falcados, obtusos hasta subagudos o ligeramente mucronados, la base largamente atenuada-subunguiculada, de textura débil, diminutamente erosos hacia el ápice, ca. 3-nervados en la base, las venas muy ramificadas, 25-35 x 5-8 mm. Labelo con una uña de 8-9 mm de largo, adnada a los márgenes ventral es de la columna para formar un estrecho nectario; lámina entera, obovada, profundamente emarginada, la base obtusa-redondeada, de 35-55 x 20-30 mm, con los márgenes erosos, plicados y enrollados en la mitad apical; el callo con 35 quillas que recorren todo el largo del labelo; de textura débil. Columna de 2030 mm de largo, 5-7 mm de ancho, clavada, inversamente arqueada, con los márgenes ventrales prominentes y más proyectados a la altura del estigma, con dos dientes-alas ventrales, oblongo trapezoidales, cerca de la mitad, arriba de la inserción del labelo; clinandrio ligeramente prominente, cuculado, 3-dentado, carnoso. Estigma transversalmente elíptico. Rostelo laminar, de forma variable, angostamente triangular, ovado, proyectado, a veces incurvado. Antera ovoide o transversalmente elíptica, fuertemente adherida al clinandrio. Polinario poco definido, los polinios alargados, usualmente germinando en el estigma poco después de la antesis y entonces suaves, harinosos. Cápsula fusiforme, fuertemente quillada, 3-4 cm de largo, 1 cm de grosor. Florece de julio a octubre.

14

Figura 6. Bletia purpurata en la Reserva Ecológica del Pedregal de San Ángel, México D. F. Foto: Tunal-Sánchez, 2011.

2.3. Micorriza orquideoide Las micorrizas son asociaciones simbióticas esenciales entre diversos hongos y las raíces (u otro órgano en contacto con el sustrato) de la mayoría de las plantas. Las micorrizas ocurren en un órgano vegetal especializado donde el contacto íntimo entre los órganos involucrados por ambos simbiontes resulta en un desarrollo sincronizado planta-hongo responsable principalmente de la transferencia de nutrimentos (Brundrett, 2004). Cabe señalar que los organismos que viven dentro de los tejidos vegetales de forma asintomática se denominan endofitos y pueden abarcar desde agentes patógenos latentes hasta organismos benéficos que pueden colonizar el córtex de raíces vivas. Se caracterizan por la ausencia de hifas especializadas, no presentan desarrollo sincronizado ni tampoco existe intercambio de nutrimentos (Brundrett, 2004). 15

En la micorriza orquideoide ovillos de hifas, denominadas pelotones (hyphal coils) invaginan las células del córtex de la raíz, tallos o protocormos de plantas de la familia Orchidaceae (Smith y Read, 2008; Brundrett, 2004). Tal asociación es esencial para la germinación de las semillas y el crecimiento de las plantas adultas. La mayoría de estos hongos corresponden a los anamorfos del géneroforma Rhizoctonia (Brundrett, 2002). Estas relaciones micorrízicas se conocen desde hace más de 100 años, siendo Bernard en 1904 (Smith y Read, 2008) quien aisló e identificó a Rhizoctonia como el principal simbionte. Actualmente, la mayoría de los hongos endofitos que se conoce

que

forman

asociaciones

micorrízicas

con

las

orquídeas

son

Basidiomicetos de este género-forma (Batty et al., 2002). Las orquídeas se asocian a tales hongos para la germinación de las semillas y para proveerse de nutrimentos orgánicos e inorgánicos incluso en etapas adultas de las plantas (Brundrett, 2002). En este sentido, las orquídeas se clasifican en: a) fotosintéticas; b) mico-heterotróficas, que necesitan asociarse a hongos para su supervivencia y c) mixotróficas, que realizan fotosíntesis y complementan sus requerimientos de carbono a través de la asociación con hongos micorrízicos (Dearnaley, 2007). Los beneficios principales de esta relación son la transferencia de carbono de fuentes complejas del suelo de la planta al hongo y viceversa. A diferencia de otras plantas, las orquídeas muestran una alta especificidad en sus relaciones con hongos del suelo, siendo este un factor limitante en su adaptación a los cambios del hábitat. Sin embargo, varias especies de orquídeas presentan los mismos hongos si crecen en un mismo sitio y diferentes si se desarrollan en lugares diferentes, tal habilidad de asociarse a diferentes hongos puede proveerles de varias opciones en cuanto a fuentes de carbono (Ortega-Larrocea y González, 2008). 16

Los hongos micorrízicos asociados a las orquídeas tienen diversas funciones, ya sea como descomponedores de materia orgánica, agentes patógenos o endofitos de otras plantas como en algunas coníferas (Sen et al., 1999; Ortega-Larrocea y González, 2008).

2.3.1. Tipos de colonización micorrízica Existen dos formas de colonización micorrízica en las orquídeas; la tolipofagia (Fig. 7a) que ocurre en la mayoría de las especies de orquídeas; donde el hongo forma pelotones dentro de las primeras capas de células corticales. En la zona de colonización los pelotones son densos, en estas células el hongo es digerido por el huésped y finalmente se reduce a una masa granular. Por otro lado, la ptiofagia es común en especies micoheterótrofas (Fig. 7b), en este caso el hongo coloniza el córtex externo y algunas células epidérmicas. Los pelotones presentan un crecimiento menos denso y al penetrar en la parte media del córtex, el crecimiento se limita a una sola hifa que no prolifera ni forma pelotones, su crecimiento se detiene y es digerida por la planta. Las paredes celulares de la planta se engruesan alrededor del hongo formando un crecimiento tubular que probablemente previene la proliferación del hongo. Las células colonizadas presentan numerosas mitocondrias asociadas a las hifas del hongo pero separadas por el plasmalema del huésped. El componente fúngico degenera por autolisis o es digerido por el huésped (Leake, 1994).

17

Figura 7. Dos tipos de colonización micorrízica de las raíces de orquídeas: a) Tolipofagia. Raíz de Platanthera chlorantha (Custer) Rchb. f. Digestión de pelotones amontonados en unas cuantas células. De izquierda a derecha: epidermis, capa de células hospedantes, capa de fagocitos, capa de almacenamiento y endodermis; b) Ptiofagía. Raíz de Gastrodia callosa J.J. Sm. De izquierda a derecha: epidermis colapsada; subepidermis con las células de paso perforadas por el hongo; dos capas de propagación del hongo; capa de grandes fagocitos penetrados por hifas espiraladas con su protoplasma dispersado y parcialmente reabsorbido y con ptiosomas esféricos y colapsados, dos capas de almacenamiento con granos de almidón; endodermis (Tomado de Reyes, 1973).

2.3.2. Germinación de la semilla y desarrollo del protocormo Las orquídeas atraviesan por una fase no fotosintética y dependen de una fuente externa de nutrimentos y carbono. Si las semillas se dispersan en un sustrato húmedo, el embrión se embebe y dependiendo de la especie, rompe la testa y produce rizoides. El desarrollo se detiene de no existir una fuente exógena de carbohidratos o si no hay colonización con algún (algunos) hongo (s) micorrízico (s) compatible (s) que estimule (n) la gluconeogénesis y la movilización de reservas antes de iniciar la fotosíntesis (Smith y Read, 2008). La estructura formada luego de la germinación se llama protocormo (Fig. 8a), es redondeado o elíptico y presenta algunos rizoides unicelulares en la base y un meristemo apical (Fig. 8a flecha delgada). En algunas especies terrestres, el ápice se alarga para formar rizomas que continúan el crecimiento (Chang et al., 2005). Smith y Read (2008) mencionaron que la simbiosis entre el embrión y el hongo puede tener tres resultados: (a) interacción micorrízica, con la formación de 18

pelotones; (b) interacción parasítica, donde las células de la orquídea son invadidas por hifas de crecimiento desorganizado resultando en la muerte del protocormo y (c) resistencia, donde el hongo es separado de los tejidos de la orquídea. Estas interacciones pueden ser simultáneas en una población de protocormos. Los embriones embebidos son colonizados por las hifas del hongo correspondiente. Conforme penetra las células del embrión, la hifa invagina la membrana plasmática de la célula de la orquídea y es rodeada por una capa de citoplasma. Dentro del protocormo, el hongo se difunde de una célula a otra colonizando la región basal. El crecimiento y la anastomosis de las hifas dan origen a los pelotones (Fig. 8a flecha gruesa) (Fig. 8b) (Smith y Read, 2008) que son posteriormente digeridos lo que puede permitir la re-colonización de las células por nuevas hifas, la formación de nuevos pelotones y continuar así con la asociación a lo largo de la vida de la planta (Brundrett, 2002).

Figura 8. Germinación de la semilla y desarrollo del protocormo: a) Protocormo de Bletia gracilis germinado simbióticamente 13 días después de siembra. b) Pelotón no digerido en protocormo de Bletia gracilis. Microscopía de campo claro. Fotos: Moreno-Camarena, 2012.

19

2.3.3. Aislamiento de endofitos micorrízicos Los hongos micorrízicos son aislados de raíces de orquídeas adultas usando fragmentos de raíz esterilizados o a través de la separación y colocación de pelotones individuales en medios de cultivo no específicos como el medio de aislamiento fúngico (MAF) (Mitchell, 1989), medio Czapek Dox (Chutima et al., 2011) entre otros. En general, el medio debe ser simple en sales minerales y pobre en compuestos orgánicos para evitar la proliferación de hongos de rápido crecimiento y bacterias (Currah et al., 1997). Ortega-Larrocea (2008) recomendó realizar el aislamiento en la época de floración o al establecerse nuevas hojas por tratarse de la época con mayor actividad fisiológica. Las raíces a recolectar deben ser adyacentes a los tejidos del cormo y no deben almacenarse más 12 horas para evitar la proliferación de microorganismos cohabitantes de la rizósfera. El velamen, en las especies que lo presenten, debe retirarse ya que los endofitos que habitan en él suelen ser diferentes a los del córtex (Currah et al., 1997). Las raíces seleccionadas deben desinfestarse en soluciones con etanol e hipoclorito de sodio (NaOCl) (cloro comercial) (Johnson et al., 2007), o desinfestación superficial con peróxido de hidrógeno (Bonnardeaux et al., 2007) o únicamente en NaOCl (Ortega-Larrocea, 2008). La raíz pueden sembrarse colocando rodajas muy delgadas directamente sobre el medio de aislamiento pero se tiene la desventaja de que no es posible determinar el origen del crecimiento del ápice de la hifa. Otro método consiste en la disección del córtex para liberar los pelotones, esta práctica debe hacerse en una gota de agua destilada estéril para poder recuperar los pelotones, someterlos a un lavado y colocarlos en los diferentes medios de aislamiento (Currah et al., 1997).

20

Los medios de aislamiento con pelotones o explantes deben incubarse en oscuridad a 25 °C, los recrecimientos pueden observarse a partir de las 24 horas, estos ápices debe subcultivarse a un medio rico (papa dextrosa agar-PDA) para evaluar sus características o como medio de almacenamiento (Currah et al., 1997; Ortega-Larrocea, 2008).

2.3.3.1.

Identificación del hongo

Los hongos micorrízicos orquideoides son taxonómicamente problemáticos ya que la mayoría de los aislados son estériles en cultivo, aunque algunos de los aislados han producido posteriormente fases sexuales que permiten reconocer a un amplio rango de basidiomicetos. El grupo artificial Rhizoctonia incluye anamorfos del género Ceratorhiza Moore, Epulorhiza Moore y Moniliopsis Ruhland (Zelmer et al., 1996). Además de las especies de Rhizoctonia, otros hongos saprófitos y patógenos de plantas como Marasmius, Xerotus, Fomes y Armillaria han sido reportados como simbiontes importantes. El género Rhizoctonia incluye saprofitos y patógenos de plantas agresivos muy difundidos como R. solani y R. goodyerae-repentis que pueden estimular la germinación y crecimiento de varias orquídeas (Leake, 1994). Antes de poder asignar un aislado al complejo Rhizoctonia deben documentarse las características como color, el ancho de las hifas, fíbulas entre las células (clamp connections), presencia de monilias, patrón de ramificación entre otros. El género Rhizoctonia se caracteriza por presentar colonias estériles de color blanco, crema a castaño, esponjosas o lisas, microscópicamente carecen de fíbulas, presentan ramificaciones en ángulo recto, una contracción en la base de la hifa y un septo en la ramificación cercana a su punto de origen; frecuentemente presentan cadenas de hifas engrosadas de forma elipsoide o

21

esférica que pueden ser estructuras de dispersión o supervivencia denominadas monilias (Currah et al., 1997) (Fig. 9a, b). Otro rasgo morfológico que puede usarse en la clasificación de Rhizoctonia es el número de núcleos presentes en las células jóvenes; el complejo fitopatógeno Rhizoctonia solani (teleomorfos: Thanatephorus, Ceratobasidiales) posee células multinucleadas.

Células

binucleadas

se

han

observado

en

hongos

correspondientes al género Ceratobasidium (Ceratobasidiales) y Tulasnella (Tulasnellales). Cepas uninucleadas se observan en algunos anamorfos de Ceratobasidium (Otero et al., 2002). Para la observación del número de núcleos en las hifas se usa la tinción por medio de 4´- 6´diamidino-2-fenilindol (DAPI) que tiñe los núcleos celulares para ser observados por medio de fluorescencia (Fig. 9a) (Currah et al., 1997).

Figura 9. Características del género-forma Rhizoctonia: a) tinción con DAPI (4´-6´diamidino-2fenilindol), hifas binucleadas (flechas blancas delgadas), ángulos cercanos a 90° e hifas de alrededor de 4 µm de ancho (flecha blanca gruesa); b) microscopía de campo claro de monilias (flecha negra delgada) y septo basal (flecha negra gruesa). Fotos: Moreno-Camarena, 2012.

La utilización de pruebas enzimáticas puede ser usada para diferenciar entre aislados de Ceratorhiza y Epulorhiza ya que la mayoría de los aislados

22

correspondientes a Ceratorhiza producen celulasa y polifenol oxidadasas, siendo capaces de crecer en medios adicionados con ácido tánico. Los aislados negativos a polifenol oxidasa, correspondientes a Epulorhiza no sobreviven en este medio. La reacción positiva se considera cuando se forma un halo café oscuro alrededor del inóculo en la parte superior e inferior del medio; una reacción débil considera sólo un cambio en la parte superior del medio; la reacción negativa no denota ningún cambio (Zelmer et al., 1996).

2.3.4. Germinación simbiótica Los endofitos aislados deben cultivarse con semillas de orquídeas antes de ser designados como micorrízicos (Dearnaley, 2007). La germinación simbiótica se realiza en medios digeribles por el hongo como la avena. Las semillas deben colocarse en el medio equidistantes al inóculo: éste consta de un cubo de agar de aproximadamente 0.5 cm3 conteniendo el aislado que debe estar colocado en el centro, los subcultivos posteriores no requieren inoculación (Ortega-Larrocea, 2008).

23

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Selección de los sitios de recolecta Se efectuaron algunas exploraciones previas entre los meses de octubre (2009) y noviembre (2010) en las zonas donde se reportaron las especies de orquídeas en la literatura (Nava-Bernal, 2008). En los sitios de colecta (Nava-Bernal, com. pers.), se comprobó su presencia in situ y se determinó la ubicación de los ejemplares de interés. Se seleccionaron plantas con flor para la determinación taxonómica de las especies mediante las claves de Dressler (1968) y McVaugh (1985). La determinación de Bletia neglecta la hizo el Doctor Gerardo Salazar del Instituto de Biología, UNAM.

3.2. Descripción de los sitios de recolecta Con base a las exploraciones previas, se seleccionaron tres zonas de recolecta considerando la presencia de plantas con flor que pudieran ser determinadas taxonómicamente. Se seleccionaron tres sitios a los que se les adjudicó algún nivel de disturbio (cercanos a zonas urbanas, si presentaron deforestación o se encontraban cercanos a los senderos). Los sitios 1 y 2 correspondieron al municipio de Ocuilan de Arteaga, el sitio 3 se localizó en el municipio de Malinalco. A continuación se describen los sitios de recolecta seleccionados para el presente trabajo:



Sitio 1: Chalmita, Ocuilan de Arteaga, Estado de México, entre las coordenadas 18° 55’ 41.44’’N y 99° 25’ 46.02’’ W a una altura de 2571 msnm. Vegetación bosque de encino, las poblaciones se ubicaron en la ladera de un cerro con orientación norte-sur, en donde se encontraron Bletia adenocarpa, B. 24

gracilis, B. punctata y B. purpurata. Además de estas especies, se encontraron algunas especies de los géneros Habenaria, Malaxis, Aulosepalum y Liparis. Este sitio se ubicó en las cercanías de una zona de recreo de los peregrinos al Santuario de Chalma. 

Sitio 2: Camino de Peregrinaje a Chalma, comunidad de Chalmita, Ocuilan de Arteaga, Estado de México, entre coordenadas 18° 55’ 56.63’’N y 99° 24’ 35.88’’ W a una altura de 2566 msnm. Vegetación bosque mixto de pinoencino, en ella se encontraron Bletia gracilis y B. purpurata. Esta zona se ubica en las cercanías del camino Morelos-Chalma usado por los peregrinos al Santuario de Chalma en donde existe explotación forestal de autoconsumo, recolecta de hongos comestibles, musgo y saqueo selectivo de algunas especies epifitas.



Sitio 3: Club de Golf, Colonia San Sebastián, Malinalco, Estado de México entre coordenadas 18° 59.735’’ N, 99° 28.514’’ W y 18° 59.490’’ N, 99° 28.606’’ W a una altura de 2186 msnm. Vegetación bosque de encino, donde se encontraron Bletia purpurata, B. adenocarpa, B. neglecta y B. campanulata; esta zona se ubicó en las cercanías del club de Golf Malinalco y cercana a la carretera Chalma-Malinalco, la rodean campos de cultivo y es visitada por algunos peregrinos al Santuario de Chalma.

3.3. Descripción general de los municipios donde se ubican los sitios de recolecta 3.3.1. Malinalco 3.3.1.1.

Localización geográfica

El municipio se localiza en el extremo sur de la porción occidental del Estado de México, entre las coordenadas geográficas: máximas 19° 01’ 58’’ latitud N y 99°

25

35’ 24’’ longitud W; mínimas: 18 o 45’ 18’’ latitud N y 99 o 25’ 43’’ longitud W (Fig. 10). Su altura va desde 850 a 2600 msnm, limita al norte con los municipios de Joquicingo y Ocuilan; al sur con Zumpahuacan y el Estado de Morelos; al este, con el municipio de Ocuilan y el Estado de Morelos y al oeste con los municipios de Tenancingo y Zumpahuacan (Schneider, 1999).

3.3.1.2.

Fisiografía

El municipio se localiza en la provincia fisiográfica de la Sierra Madre del Sur y la subprovincia de las Sierras y Valles Guerrerenses, en la Gran Sierra Volcánica Compleja del Eje Neovolcánico. La mayoría de sus elevaciones corresponden a los períodos Terciario y Cuaternario y las formaciones sedimentarias al Cretácico (Ayuntamiento Constitucional de Malinalco, 2009).

3.3.1.3.

Orografía

Las formaciones orográficas más importantes se localizan en la sección norte como el cerro la Loma (2700 msnm), otras formaciones importantes son el cerro del Picacho, cerro de Cuamila, cerro de Monte Grande, cerro las Canoas, cerro Gallinero, cerro los Encinos, cerro la Ascensión, cerro de la Campana, cerro de los Ídolos, cerro del Mirador, Orquemes, Toxquihuatl, Matlalac y el Tonatichi (Schneider, 1999).

3.3.1.4.

Hidrografía

El municipio se localiza en la Cuenca del río Amacuzac, en la Región Hidrológica RH–18 del Balsas. Se divide en las subregiones de Alto Balsas y Medio Balsas. En la subregión del Alto Balsas se localiza la cuenca del río

26

Amacuzac, subdividida en las subcuencas: Alto Atoyac, Tlapaneco; Nexapa; Alto Amacuzac y Bajo Amacuzac. Malinalco se ubica dentro de la microcuenca del Alto Amacuzac, conformada por ríos permanentes como el río Chalma, e intermitentes como los ríos Malinalco, Tepolica y Colapa. En esta microcuenca predominan escurrimientos del período de lluvias que descargan en las partes bajas pasando a formar parte del sistema de drenaje de los ríos principales, el Río San Miguel, Río Tepolica y río Chalma, algunos escurrimientos desaparecen en la parte baja. En la posición norte de la microcuenca, la red hidrográfica está formada por el río San Miguel o Malinalco con una extensión de 22 942 m y una serie de ramificaciones que se extienden hacia las partes más altas de la microcuenca. También se encuentra el río Tepolica, ubicado en el lado oriente del río Malinalco con una extensión de 11 693 m y sus respectivas ramificaciones. El río Chalma se localiza al sureste de la cabecera municipal y tiene una extensión de 15 383 m; nace en las inmediaciones del municipio de Ocuilan entrando hacia el municipio de Malinalco en la comunidad de Chalma y sale de la comunidad de San Andrés Nicolás Bravo hacia el Estado de Morelos (Ayuntamiento Constitucional de Malinalco, 2009).

3.3.1.5.

Clima

El clima predominante se clasifica como A(C)w2(w)ig w" (García, 2004), el cual corresponde a: clima semicálido, subhúmedo con lluvias en verano, la temperatura media anual es 21 °C y la precipitación media anual es de 1087.3 mm. La mayor incidencia de lluvias es durante agosto con un valor de 144.7 mm, la mínima precipitación se registra noviembre con un valor de 10.8 mm (Ayuntamiento Constitucional de Malinalco, 2009).

27

3.3.1.6.

Geología

El municipio se localiza en la Provincia Geológicas del Eje Neovolcánico y de la Sierra Madre del Sur, por lo que su estructura geológica se compone por rocas ígneas extrusivas: basalto, toba y brecha volcánica de la era Cenozoica de los períodos Terciario y Cuaternario y rocas sedimentarias: calizas de la era Mesozoica del período Cretácico. Las rocas ígneas extrusivas de basaltos pueden encontrarse al norte, este y sureste del municipio, intercaladas al este con rocas ígneas extrusivas de brecha volcánica. Las aluviales son el resultado del acarreo y depósito de materiales. La brecha volcánica es una roca constituida por fragmentos angulosos, provenientes de erupciones volcánicas y se localiza en el lado noroeste del municipio, corresponde a la zona montañosa y en está corre una falla normal de Norte a Sur, de San Nicolás hasta Jalmolonga, con una extensión de 6.5 kilómetros y en forma perpendicular a ella se presentan cuatro fracturas, quedando dicha falla al oeste de la Cabecera Municipal. Las rocas sedimentarias se ubican del centro del municipio hacia el sur y suroeste, predominando las del tipo calizas, ya que abarcan aproximadamente el 50% del territorio; en esta área afloran rocas ígneas extrusivas de basaltos en las zonas montañosas de Monte Grande y Palmar de Guadalupe (Ayuntamiento Constitucional de Malinalco, 2009).

3.3.1.7.

Edafología

Según el Ayuntamiento Constitucional de Malinalco (2009) se encuentran cinco tipos de suelo según el sistema de clasificación de la FAO: Feozem, Luvisol crómico, Acrisol húmico, Rendzina y Vertisol pélico. Los suelos residuales y aluviales se localizan al sur del territorio, en el poblado de San Andrés, Nicolás Bravo, hacia el sur de esta misma población colindando 28

con el Estado de Morelos en donde se presentan rocas sedimentarias de arenisca-conglomerado. Los Feozem se localizan hacia el norte, en la comunidad de San Sebastián y áreas aledañas; son de consistencia suave, fértiles y ricos en materia orgánica, con una capa superficial obscura y se usan generalmente en el cultivo de granos, legumbres y hortalizas. Existen también las unidades de suelo Feozem háplico (Hh/2) con clase textural media y fase lítica (lecho rocoso entre 10 y 50 cm de profundidad) y Litosol más Feozem háplico (L+Hh/2), con clase textural media. De Palmar de Guadalupe hasta Chalma se desarrolla el Feozem háplico (Hh+1/2) con texturas de gruesa a media. El Luvisol crómico se encuentra desde la cabecera municipal de Malinalco, presenta la unidad de suelo denominada Luvisol crómico más Feozem lúvico (Lc+Hl/2), con clase textural media. El Acrisol húmico más Acrisol órtico con textura media (Ah + Ao /2) se localiza en Monte Grande. La mayor parte del área con rocas sedimentarias presenta la unidad de suelo Rendzina más Litosol (E + L/2), con clase textural media y fase lítica cuyo lecho rocoso oscila entre 10 y 50 cm de profundidad. El Vertisol pélico (Vp/3) se manifiesta al sur del territorio, en la población de San Andrés Nicolás Bravo, es de clase textura fina y con fase lítica profunda con permeabilidad media. Es un lecho rocoso de entre 50 y 100 cm. de profundidad.

3.3.1.8.

Vegetación

La flora de Malinalco se compone en un 76% de plantas herbáceas y en un 23% de plantas leñosas; las familias mejor representadas son Asteraceae, Poaceae, Fabaceae, Solanaceae, Mimosaceae, Acanthaceae, Malvaceae, Verbenaceae, Rubiaceae, Pteridaceae, Lamiaceae, Euphorbiaceae, Cucurbitaceae, Apiaceae y (Martínez de La Cruz, 2010). 29

La vegetación predominante es de selva baja caducifolia (Miranda y HernándezXolocotzi, 1963) o bosque tropical caducifolio (Rzedowski, 2006); las especies arbóreas más comunes son: Bursera fagaroides (Kunth) Engl., B. morelensis Ramirez, Ceiba aesculifolia (Kunth) Britten & Baker f., Erythrina spp., Eysenhardtia polystachya (Ortega) Sarg., Ficus petiolaris Kunth, Heliocarpus terebintthinaceus (DC.) Hochr., Ipomoea murucoides Roem. & Schult., Lysiloma acapulcensis (Kunth) Benth. - Conafor y Pseudobombax ellipticum (Kunth) Dugand. También existen algunas cactáceas de los géneros Mammillaria spp., Opuntia spp., Pereskia spp. y Stenocereus spp., algunas especies epifitas de los géneros Tillandsia y de la familia Orchidaceae. En la cima de los cerros se desarrollan además bosques de Pinus y Quercus y zacatonales de Muhlenbergia macroura (Kunth) Hitchc. Un tipo de vegetación más limitado es el Bosque de Galería con Taxodium, Salix y Alnus (Aguilera-Gómez y Rivas-Manzano, 2006; Hernández-Mejía et al., 2008).

3.3.2. Ocuilan 3.3.2.1.

Localización geográfica

El municipio de Ocuilan se localiza en la parte sureste del Estado de México, entre las coordenadas 19° 08’ 09” N y 18° 52’ 31”N; y 99° 16’ 25”W y 99° 30’ 08”W (Secretaría de Desarrollo Urbano, 2003). La altura media es de 2 340 m snm, limita al norte con Xalatlaco y Santiago Tianguistenco; al sur y oriente con Morelos y al poniente con Malinalco y Joquicingo. La extensión es de 344.84 km 2 (Gobierno del Estado de México, 2005) (Fig. 10).

3.3.2.2.

Fisiografía

El municipio de Ocuilan está ubicado en el sistema montañoso que forma parte de la Sierra de las Cruces, en donde abunda el material ígneo producto de acciones volcánicas (Ayuntamiento Constitucional de Ocuilan, 2009). 30

3.3.2.3.

Orografía

Destacan por su altura los cerros de Zempoala con 3500 msnm, donde predominan los bosques de coníferas y surgen diversos manantiales, los cerros Tuxtepec, Metepec y Olotepec, la Culebra, Fraile, Zistepec, Caballete, la Leona, la Orqueta, Jaltepec, el Volador, Capultepec y Tepetzingo el Grande, Cerro del aire, Loma de la llovizna, la Loma, Tierra vieja y el Chivo (García, 1999; Gobierno del Estado de México, 2005).

3.3.2.4.

Hidrografía

El municipio forma parte de la Región Hidrológica de la Cuenca del Balsas. Los ríos con mayor importancia son el Río Chalma, que nace en el cerro Zempoala, corre de norte a sur y se enriquece con los afluentes Árbol del Ahuehuete; el río Tlaxipehualco, el cual nace en el cerro el Obraje y fluye de norte a sur y el río Mexicapa se ubica al oriente del Municipio (Secretaría de Desarrollo Urbano, 2003).

3.3.2.5.

Clima

El clima del área corresponde a un Cb(w2)(w) (igw”) según Köppen modificado por García (2004), localmente se presentan tres tipos de clima; al norte es templado semi-frío, al sur el clima es semi-cálido o sub-húmedo en tanto que en el centro el clima es templado sub-húmedo. La temperatura media anual del municipio es 15.5 °C y la precipitación pluvial es de 402 milímetros (Gobierno del Estado de México, 2005).

3.3.2.6.

Geología

En el centro, norte y sur del municipio, existen rocas de ácidas a intermedias; calcialcalinas de arco perimetral del Oligoceno-Mioceno, con depósitos 31

piroclásticos y volcanoclásticos, (clave Tomv). Existen a los noroestes rocas volcánicas del Plioceno-Cuaternario, de intermedias a básicas predominando las alcalinas, (clave PQv). Al suroeste del municipio se encuentran rocas clásticas y volcanoclásticas del periodo Plioceno Cuaternario, resultantes de actividad volcánica (Secretaría de Desarrollo Urbano, 2003).

3.3.2.7.

Edafología

El suelo pertenece a la clasificación de los Andosoles úmbricos (FAO), los cuales presentan una capa superficial oscura o negra porosa y blanda, rica en materia orgánica. Se localizan en el centro, oriente, poniente y norte del municipio. En el sur y sureste, se encuentran Feozem y una mínima porción de Vertisoles que se localizan en la Lagunita, Chalmita y Pueblo Nuevo (Secretaría de Desarrollo Urbano, 2003).

3.3.2.8.

Vegetación

Existen en el norte del municipio bosques de coníferas formados por pinos y oyameles; en el centro y en el sur predominan bosques mixtos compuestos por Quercus, Cupressus, Fraxinus y Alnus. Los bosques de coníferas tienden a extinguirse debido a la tala clandestina e inmoderada que se lleva a cabo en diversas partes del municipio y por vecinos de diversas comunidades (Gobierno del Estado de México, 2005). El bosque de Abies se presenta a altitudes de 2700-3500 msnm en suelos profundos, bien drenados, ricos en materia orgánica, húmedos durante todo el año donde la precipitación media anual es de 1000 a 1400 mm, la temperatura media anual es de 7.5 a 13.5 °C. Es un bosque perennifolio de 20 a 40 m, con uno o dos estratos arbóreos, el suelo está cubierto de musgo y los líquenes como las epífitas dominantes. Las especies dominantes son Abies religiosa (Kunth) Schltdl. 32

& Cham., Alnus firmifolia Fernald, Quercus laurina Bonpl., Salix oxylepis C.K. Schneid. y Prunus serotina Ehrh. (Rzedowski y Calderón, 1979). El bosque mesófilo de montaña se ubica en laderas abruptas y fondos de cañadas, es un área reducida, se desarrolla de 2500 a 2800 msnm, en sitios protegidos de insolación y vientos fuertes, con una precipitación media anual de más de 1000 mm y una temperatura promedio de 12 a 14 °C. Los suelos son ricos en materia orgánica, profundos, húmedos casi todo el año. La altura promedio es de 10 a 25 m, es un bosque denso, de hoja perenne y siempre verde. Hay gran presencia de plantas epifitas. Las especies dominantes son Clethra mexicana DC., Cornus disciflora DC., Ilex tolucana Hemsl. y Quercus laurina Bonpl. (Rzedowski y Calderón, 1979). Los bosque de Pinus de desarrollan desde los 2350 a 4000 msnm, son siempre verdes, la precipitación media es de 700 a 1200 msnm, los suelos son profundos, someros y a veces rocosos, las trepadoras y epífitas son escasas, las especies dominantes son Pinus leiophylla Schiede ex Schltdl. & Cham., Pinus montezumae Gordon & Glend. y Pinus hartwegii Lindl. (Rzedowski y Calderón, 1979). El bosque de Quercus prospera en altitudes de 2350 a 3100 msnm, sobre suelos profundos o someros, la precipitación media anual es de 700 a 1200 mm, son bosques de 5 a 12 m y moderadamente densos. Las plantas epifitas no son frecuentes pero aumentan cerca de cauces de ríos. Entre las especie dominantes se encuentran Quercus rugosa Née, Q. mexicana Bonpl., Q. crassipes Bonpl., en los lugares más secos se desarrollan Quercus microphylla Née, Q. greggii (A. DC.) Trel. y Q. mexicana Bonpl., con 3 a 5 m de alto y bastante abiertos (Rzedowski y Calderón, 1979).

33

Figura 10. Municipios del Estado de México donde se ubican los sitios de estudio.

3.4. Recolecta de raíces para el aislamiento de endofitos micorrízicos La recolecta de muestras de raíces y/o plantas se efectuó entre los meses de julionoviembre (2010), de acuerdo a los periodos de floración de las especies seleccionadas que permitieron asegurar su determinación taxonómica. La recolecta consistió en excavar alrededor de la planta localizando la cadena de cormos y seleccionando raíces de aspecto sano: completas, turgentes, sin heridas o necrosis (Fig. 11). Las raíces se cortaron de la parte basal del cormo, cuidando la orientación base-ápice y se almacenaron en papel aluminio con un poco de suelo rizosférico dentro de una hielera con gel refrigerante. En los casos en que las raíces fueron en extremo delgadas y debido a la lejanía de los sitios de estudio al laboratorio se extrajo la planta completa con suelo para continuar con el muestreo de raíces en el Invernadero del Instituto de Geología de la UNAM.

34

Figura 11. Rizósfera de Bletia gracilis en el sitio 2. Foto: Moreno-Camarena, 2011.

3.4.1. Caracterización semicualitativa de la colonización micorrízica Una vez en laboratorio, las raíces seleccionadas se lavaron bajo agua del grifo con un cepillo de dientes suave o un pincel para retirar la materia orgánica adherida, posteriormente se lavaron repetidamente con agua destilada. Se documentó sus longitudes, aspectos y colores, todas las raíces se trabajaron sobre una placa de gel refrigerante para alargar la vida de los pelotones. Para la caracterización de la colonización se hicieron preparaciones permanentes de segmentos transversales del córtex cortados aproximadamente cada 5 o 10 mm según la longitud de la raíz y manteniendo la orientación base-ápice (Anexo 8, pág. 170). Los segmentos de córtex se colocaron en un portaobjetos y fueron teñidos con fucsina ácida (0.01%) y alcohol polivinílico lacto-glicerol (PVLG). Las preparaciones se observaron en un microscopio óptico Leica DME a (40 y 100×) realizando una descripción cualitativa de la digestión de los pelotones o

35

de la apariencia citoplasmática y de las paredes de las hifas, de acuerdo a 3 estadios: a) pelotones digeridos, con apariencia colapsada donde no se observan hifas individuales (Fig. 12 flecha blanca delgada), b) pelotones parcialmente degradados en proceso de digestión donde se reconoce algo de la estructura celular o de la pared del hongo en los extremos (Fig. 12 flecha blanca gruesa), c) pelotones sin digestión aparente donde se observa en la totalidad de la estructura las paredes de las hifas (Fig. 12 flecha negra). Se consideró también el porcentaje de colonización del segmento asignándose valores semicuantitativos de 0 a 100 % en intervalos mínimos de 5.

Figura 12. Diferentes estadios de los pelotones en un corte transversal de una raíz de Bletia sp. Microscopía de campo claro. Foto: Moreno-Camarena, 2012.

36

3.5. Aislamiento de endofitos micorrízicos Debido a que el aislamiento de los endofitos micorrízicos no fue efectivo según los protocolos estandarizados en el laboratorio (método 1), se hicieron modificaciones a los mismos para evaluar su efectividad. Los métodos de aislamiento siguieron el siguiente esquema básico: limpieza de los segmentos seleccionados, desinfestación por medio de una solución en condiciones estériles, lavado para retirar restos de la solución desinfestante, almacenamiento o siembra directa en el medio de aislamiento. Se usaron nueve métodos que se muestran en el Cuadro 1.

37

Cuadro 1. Métodos de aislamiento de endofitos micorrízicos. MÉTODO

LIMPIEZA DEL TEJIDO

SOLUCIÓN DE DESINFESTACIÓN

1

Agua del grifo

2

Agua del grifo

3

Agua destilada

4

Agua destilada

Cloramina T 1% (p:v) (5 minutos)

5

Agua del grifo

6

Agua destilada

NaOCl 10% + 2 gotas de Tween 20 (15 minutos) Cloramina-T 1% (p:v) (5 minutos)

7

NaOCl al 10% + 2 gotas de Tween 20 (15 minutos) NaOCl al 10% + 2 gotas de Tween 20 (15 minutos)

LAVADOS

ALMACENAMIENTO

MEDIO (pH)

Agua destilada estéril (3 por 10 minutos)

Streptomicina 2% Gentamicina 1%

Agua destilada estéril (3 por 10 minutos)

Streptomicina 2% Gentamicina 1%

Agua destilada estéril (15 a 20 minutos) Streptomicina 2% Gentamicina 1% (2 por 5 minutos) Agua destilada estéril (3 por 10 minutos)

Siembra directa

Streptomicina 2% Gentamicina 1%

MAF (pH 5.85)

Streptomicina 2% gentamicina 1% (2 por 5 minutos) Agua destilada estéril (3 por 5 minutos) Agua destilada estéril (3 por 5 minutos)

Streptomicina 2% Gentamicina 1%

MAF (pH 5.85)

Siembra directa

Streptomicina 2% - Agua destilada estéril: alcohol Siembra directa Gentamicina 1% 96: NaOCl: H2O2 (5 minutos) 8 Streptomicina 2% - Cloramina T 1% (p:v) Lavado en Streptomicina 2% Gentamicina 1% (10 minutos) Gentamicina 1% y siembra directa (24 horas) 9 Streptomicina 2% - NaOCl 10% (2 minutos) Agua destilada estéril Lavado en Streptomicina 2% Gentamicina 1% (3 por 5 minutos) Gentamicina 1% y siembra directa (24 horas) MAF: Medio de aislamiento fúngico (Clements, 1988); AWA: Medio Acid water agar; MBA: Medio básico de avena

MAF (pH 6) AWA MBA

MAF (pH 5.85) MAF (pH 5.85)

MAF (pH 5.85) MAF (pH 5.85) MAF (pH 5.85)

38

El método de aislamiento 1 se aplicó a segmentos colonizados de la raíz sin retirar el velamen, el método 2 de aplicó a protocormos hallados en el Sitio 1 correspondientes a Bletia gracilis y a una especie no determinada de Malaxis. En los métodos del 3 al 9 se usaron segmentos colonizados de córtex previamente separados del velamen, sometiéndolos directamente al proceso de desinfestación. También el pH del medio (MAF) se modificó en estos métodos a 5.85. En todos los métodos donde la solución desinfestante constaba de hipoclorito de sodio se utilizó la marca comercial Puro Sol® (5 % de cloro activo). Ningún periodo de almacenamiento sobrepasó las 24 horas a excepción del método 1 en el cual algunos segmentos se almacenaron por 96 horas en refrigeración debido a la gran cantidad de muestras. En todos los casos los explantes y pelotones se incubaron en obscuridad a 25 ± 1°C. Una vez que se registró algún crecimiento de hifas desde explante o pelotón (Fig. 13a, b), éstas se subcultivaron a medio papa dextrosa agar (PDA, pH 6.8) procurando colocar sólo un ápice hifal por caja Petri. Las cepas aisladas de Bletia gracilis por el método 6 se subcultivaron en medio PDA + 50 mgL-1 de novobiocina (pH 6.74) (Johnson et al., 2007).

Figura 13. Crecimientos de hifas en medio MAF: a) pelotón de la planta MMC035; b) segmento de córtex, planta MMC008. Fotos: Moreno-Camarena, 2011.

39

3.6. Selección de hongos afines al complejo Rhizoctonia De forma inicial todas las colonias con esporangios y colores oscuros, verdes, negros, rojizos, amarillos o con coloraciones diferentes al blanco, amarillocremoso, claras o hialinas se descartaron. Para la determinación de los aislados afines al género Rhizoctonia se tomó en condiciones estériles, una pequeña porción de micelio de la colonia cubriendo completamente el medio PDA y se montó en un portaobjetos con fucsina ácida al 0.01 % y PVLG (Anexos 4- 7 pág. 146-163), esta preparación se observó en un microscopio óptico Leica DME (40 y 100×) para buscar las características correspondientes a Rhizoctonia.

3.7. Caracterización anamórfica de los aislados Para la determinación a nivel del género anamórfico de los aislados se utilizaron las claves de Currah et al. (1997). Para la caracterización morfológica de la colonia (color, tasa de crecimiento, apariencia, textura) se realizaron subcultivos de todos los aislados afines al género Rhizoctonia en medio PDA pH 6.8 incubándose en obscuridad a 25 ± 1°C. Se colocó una pastilla del aislado de interés en la parte central de la caja Petri registrando su tasa diaria de crecimiento y caracterizándola cuando la colonia cubrió completamente el medio en la caja. Para la determinación del color se emplearon las Cartas Munsell para el color de suelo (Munsell, 1994). Para la diferenciación entre los géneros anamorfos Epulorhiza y Ceratorhiza se realizaron subcultivos de los aislados seleccionados en medio de ácido tánico (MAT) (Davidson et al., 1938) (Zelmer et al., 1996). Se sembró una pastilla del aislado de interés en una caja Petri con este medio incubándose en obscuridad a 25 ± 1°C y evaluando su reacción luego de 10 días de cultivo. Para la tinción y observación de los núcleos por medio de DAPI se realizaron subcultivos de los aislados en medio papa dextrosa caldo (PDB) incubándose en 40

luz a 25 ± 1°C y 50 µMol/m/s en agitación constante (120 rpm). En condiciones estériles, se tomó una pequeña muestra de micelio que se colocó en una membrana de nitrocelulosa (Millipore®, 1.2 μm) a las que se agregaron 200 µL de formaldehído, dejándose en esta solución por 20 minutos. Posteriormente se agregaron 200 µL de solución de 4´-6´diamidino-2-fenilindol (DAPI) (5 μg/mL) y se dejaron teñir por 20 minutos en oscuridad; finalmente las muestras se colocaron en un equipo de vacío (Manifold 11225, Millipore) y se lavaron tres veces con 200 µL de agua destilada estéril aplicando vacío entre cada lavado. La muestra se colocó en un portaobjetos con unas gotas de solución glicerina-agua destilada (1:1) con un cubreobjetos y se procedió a la observación y toma de microfotografías en un microscopio con módulo de epifluorescencia OLYMPUS BX51. A partir de las microfotografías se realizaron mediciones con el programa Image Pro Plus, (Media Cybernetics, Versión 5.1.259) del diámetro de las hifas, ángulo de ramificación, distancia al septo basal, ancho y largo de monilias así como el número de células en la cadena. Se realizaron pruebas de comparación de medias para la tasa diaria de crecimiento (n=4), largo y ancho de monilias (n=15), diámetro de las hifas (n=26), ángulo interno y distancia al septo de la ramificación (n=10), se corroboró la normalidad de los datos por medio de una prueba de Kolmogorov-Smirnov (p