ACTIVIDAD FUNGICIDA DE LA AFININA Y DEL EXTRACTO CRUDO DE RAÍCES DE Heliopsis longipes EN DOS ESPECIES DE Sclerotium FUNGICIDAL ACTIVITY OF AFINNIN AND Heliopsis longipes CRUDE ROOT EXTRACT ON TWO Sclerotium SPECIES Enrique Ramírez-Chávez1, Luis Lucas-Valdez1, Gil Virgen-Calleros2 y Jorge Molina-Torres1 1
Departamento de Biotecnología y Bioquímica. CINVESTAV-IPN, Unidad Irapuato. Apartado Postal 629. 36500, Irapuato, Gto. (
[email protected]). 2Departamento de Producción Agrícola del CUCBA. Universidad de Guadalajara. Las Agujas, Zapopan, Jal. México.
RESUMEN
ABSTRACT
La exploración de los recursos florísticos permite encontrar compuestos bioactivos que se pueden utilizar como alternativa en el control de fitopatógenos. La tintura obtenida de las raíces de Heliopsis longipes (Gray) Blake se ha utilizado en medicina tradicional en la Sierra Gorda, en el área central de México, para aliviar afecciones de la piel causadas por hongos. En este trabajo se estudió la actividad fungicida de la afinina purificada, la alcamida mayoritaria en raíces de Heliopsis longipes, y del extracto crudo de la raíz de la misma planta, sobre los fitopatógenos Sclerotium cepivorum y S. rolfsii. Se observó una actividad inhibitoria del crecimiento del micelio producido, en función del peso seco, en cada tipo de fracción adicionada al medio caldo papa dextrosa (PDB). En los mismos ensayos se evaluó el efecto sobre el contenido de ácidos grasos y ergosterol presentes en el micelio, para elucidar el posible mecanismo de inhibición del fungicida natural. Los resultados mostraron que con una concentración de 25 µ g/mL, la mayor concentración evaluada de afinina purificada, o del extracto crudo, el desarrollo micelial de las dos especies de Sclerotium se inhibió completamente. El efecto de la afinina o el extracto crudo sobre los ácidos grasos mayoritarios en el micelio de ambos hongos indicaron que conforme se incrementó las concentraciones del inhibidor el contenido de estos ácidos disminuyó hasta valores no detectables en la mayor concentración evaluada. Un efecto similar se presentó para el contenido de ergosterol en las dos especies de Sclerotium, el cual disminuyó cuando aumentó tanto el extracto crudo como la afinina purificada. Se estimó una dosis letal media similar para la afinina purificada y para ésta contenida en el extracto crudo: en el caso de S. rolfsii entre 15 y 20 µ g/mL y para S. cepivorum entre 5 y 10 µ g/mL. Sin embargo, el efecto general del extracto crudo y de la afinina purificada fue similar en ambos hongos.
The exploration of floristic resources permits discovery of bioactive compounds that may be used as alternatives for the control of phytopathogens. At the Sierra Gorda, in Central México, the tincture obtained from the Heliopsis longipes (Gray) Blake roots, has been used in traditional medicine to alleviate skin diseases caused by fungi. This research involves the study of the fungicidal activity of purified affinin, which is the major alkamide in the root of the Heliopsis longipes and of the crude root extract from the same plant, on the phytopathogens Sclerotium cepivorum and S. rolfsii. Growth inhibitory activity was observed when either fraction, crude extract or affinin, was added to the potato dextrose broth (PDB) medium. This activity was estimated by the dry weight of the mycelium produced. In the same assay, the effect on the fatty acids and ergosterol content in the mycelium was evaluated to explain the possible inhibitory mechanism of this natural fungicide. The results showed that in a concentration of 25 µ g/mL, the greatest concentration tried with purified affinin or crude extract, the development of mycelium was completely inhibited in both Sclerotium species. The effect of the affinin or the crude extract on the main fatty acids of the mycelium of both fungi indicated that, as the concentration of the inhibitor is increased, the content of fatty acids decrease to undetectable levels. A similar effect was observed in the ergosterol content in both Sclerotium species; it is: the sterol diminished when either the crude extract or the purified affinin was introduced and the concentration increased. It was estimated that a medium lethal dose is similar for purified affinin and for the crude extract; the medium lethal dose for S. rolfsii was in the range of 15 to 20 µ g/mL and that for the S. cepivorum was in the range of 5 to 10 µ g/mL. However, the general effect of the crude extract and the purified affinin was similar in both fungi. Key words: Heliopsis longipes, Sclerotium cepivorum, Sclerotium rolfsii, biological control, plant extracts.
Palabras clave: Heliopsis longipes, Sclerotium cepivorum, Sclerotium rolfsii, control biológico, extractos vegetales.
INTRODUCTION
S
ynthetic fungicides are largely used to control phytopathogenic fungi; however, non-discriminatory use of these products has caused various problems such as toxicity to people using them, as well as
Recibido: Febrero, 1998. Aprobado: Agosto, 1999. Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 34: 207-215. 2000. 207
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INTRODUCCIÓN
L
os fungicidas sintéticos son ampliamente utilizados para el control de hongos fitopatógenos; sin embargo, el uso indiscriminado de estos productos ha originado diversos problemas, como toxicidad a los usuarios y daños al medio, por lo que se deben extremar las precauciones al utilizarlos (Wilson y Wisniewski, 1989). Estos productos pueden actuar en forma preventiva o en algunos casos terapéuticamente. A pesar de esto los fungicidas sintéticos son de uso cotidiano y en México su consumo fue cercano a 20 000 toneladas en 1992 (AMIPFAC, 1993). Ante esta situación, una alternativa prometedora es el uso de los productos naturales derivados de las plantas para el control de hongos fitopatógenos (Montes y Figueroa, 1995). En el caso de microorganismos fitopatógenos existe información de cerca de 400 especies de plantas con propiedad fungicida y se estima que esta propiedad es una característica que se presenta frecuentemente en algunos metabolitos secundarios (Grainge y Ahmed, 1988). Por ejemplo, en plantas con actividad antifúngica, se ha sugerido que algunos compuestos, denominados bioactivos, presentes en los extractos o aceites esenciales, son los responsables de dicha actividad (Shukla y Tripathi, 1987). Müller-Riebau et al. (1995) encontraron que los compuestos timol y carvacrol fueron los principios activos mayoritarios encontrados en Satureja thymbra y Thymbra spicata, respectivamente. Estos productos naturales mostraron buena actividad antifúngica al compararlos con algunos fungicidas comerciales, y en una concentración de 100 µg/mL hubo una inhibición completa del micelio de los fitopatógenos: Rhizoctonia solani, Fusarium moniliforme, Sclerotinia sclerotiorum y Phytophthora capsici. Saxena y Mathela (1995) detectaron la actividad antifúngica de dos compuestos: acetato de iridodial-βmonoenol y actidina, aislados de Nepeta leucophyla y N. clarkey, colectados en la región del Himalaya. Estos compuestos mostraron actividad contra fitopatógenos tales como Sclerotium rolfsii y Macrophomina phaseolina en dosis de 160 µg/mL y 240 µg/mL, respectivamente. La mayoría de las plantas que se han explorado en estudios de actividad biocida tienen antecedentes de aplicaciones en la medicina tradicional, algunos como tonificantes, vermífugos, saborizantes, edulcorantes, condimentos, etc. El “chilcuague” [Heliopsis longipes (Gray) Blake], comúnmente conocido en la región de la Sierra Gorda al norte de Guanajuato, presenta una actividad importante como insecticida (Fisher, 1957) y sus raíces han sido utilizadas como vermífugo, anestésico local, así como condimento de alimentos y saborizante de bebidas (Martínez, 1994). Esta planta acumula afinina en las raíces y en las semillas. Este compuesto (Figura 1),
damage to the environment. For this reason, caution should be taken when handling them (Wilson and Wisniewski, 1989). These products can act as preventatives or for therapeutic purposes. Notwithstanding the above, synthetic fungicides are used daily. In México fungicide consumption was almost 20 000 tons in 1992 (AMIPFAC, 1993). As a result of this situation, a promising alternative is the use of natural products derived from plants to control phytopathogenic fungi (Montes and Figueroa, 1995). In the case of phytopathogenic microorganisms, there is information about 400 plant species with fungicidal properties, and it is estimated that this characteristic is frequent in some secondary metabolites (Grainge and Ahmet, 1988). For example, in plants with antifungal activity it has been suggested that some compounds, called bioactive, found in extracts of essential oils, are responsible for such activity (Shukla and Tripathi, 1987). MüllerRiebau et al. (1995) found that thymol and carvacrol were the main active ingredients found in Satureja thymbra and Thymbra spicata, respectively. These natural products showed effective antifungal activity when compared with some commercial fungicides. In a concentration of 100 µg/mL there was a complete mycelium growth inhibition of the phytopathogens: Rhyzoctonia solani, Fusarium moniliforme, Sclerotinia sclerotiorum and Phytophthora capsici. Saxena and Mathela (1995) detected antifungal activity of two compounds: iridodial-β-monoenol acetate and actidine, isolated from Nepeta leucophyla and N. clarkey, collected in the Himalaya region. These compounds showed activity against phytopathogens such as Sclerotium rolfsii and Macrophomina phaseolina in 160 µg/mL and 240 µg/mL doses respectively. Most of the plants explored in studies of biocide activity have antecedents in traditional medicine, some as tonics, vermifuge, flavors, sweeteners, condiments, etc. “Chilcuague” [Heliopsis longipes (Gray) Blake], commonly known in the Sierra Gorda north of Guanajuato, presents an important insecticide property (Fisher, 1957). Its roots have been used as vermifuge, local anesthetic, as well as food condiment and flavoring for drinks (Martínez, 1994). This plant accumulates affinin in its roots and seeds. This compound is formed by a fatty acid chain containing 10 carbons with three unsaturated bounds, linked to an isobutylamide (Figure 1). There is a report on the effect of affinin activity on the domestic fly (Crombie and Krasinki, 1962), on a lepidopterous population: Diaphania hyalinata, and on a dipter: Aedes aegipty (Jacobson, 1971). The extract obtained from other plants related to the Heliopsis longipes has also presented favorable results in the treatment of certain mycosis (athlete’s foot) and viruses in the case of Herpes simplex and Herpes zoster
RAMÍREZ-CHÁVEZ ET AL.: ACTIVIDAD FUNGICIDA DE Heliopsis longipes
Figura 1. Fórmula estructural de la afinina N-isobutil 2E,6Z,8E decatrien amida, principal componente bioactivo presente en el extracto lipídico crudo de las raíces del chilcuague (Heliopsis longipes). Figure 1. Structural formula of N-isobutil 2E, 6Z, 8E decatrien amid affinin, principal bioactive component, present in the lipidic crude extract of the roots of Heliopsis longipes.
formado por un ácido graso de una cadena alifática de 10 carbonos con tres insaturaciones unido a una isobutilamina, pertenece al grupo de compuestos denominado alcamidas olefínicas. Existen informes de la actividad de la afinina con poblaciones de la mosca doméstica (Crombie y Krasinki, 1962) y con poblaciones de un lepidóptero: Diaphania hyalinata y un díptero: Aedes aegipty (Jacobson, 1971). El extracto obtenido a partir de otras plantas parientes de Heliopsis longipes también ha presentado resultados favorables en el tratamiento de algunas micosis (pie de atleta) y de virus en el caso de Herpes simplex y Herpes zoster (Ospina et al., 1986). Sin embargo, se desconoce la actividad de la afinina sobre hongos fitopatógenos. Una de las ventajas de obtener sustancias tales como la afinina, producidas por biosíntesis de plantas, es que no tienen efectos secundarios en el ecosistema, dado que pueden ser metabolizados por uno u otro organismo, a diferencia de los fungicidas químicos comúnmente aplicados hasta ahora. En el presente trabajo se evaluó la actividad fungicida de la afinina purificada, así como del extracto crudo de las raíces de H. longipes en dos especies de Sclerotium, que son importantes fitopatógenos agrícolas. MATERIALES Y MÉTODOS Los especímenes de Heliopsis longipes se colectaron en Puerto de Tablas, municipio de Xichú, ubicado en la Sierra Gorda de Guanajuato, a altitudes entre 1500 y 2500 m en terrenos alterados de bosque de encinos (Quercus spp.) y con pendientes pronunciadas. La precipitación anual del lugar oscila entre 500 y 1000 mm con una estación de lluvias que ocurre de mayo a septiembre. Para la obtención del extracto crudo, 10 g de raíces secas y perfectamente homogeneizadas, fueron extraídas con 50 mL de acetato de etilo en un sistema de extracción continua (Tecator, Soxtec System HT 1043 Extraction Unit, Suecia) durante 2 h a 80 oC. El extracto así obtenido se resuspendió en 2 mL de etanol, se cuantificó la concentración de afinina por cromatografía de gases y se guardó a −4 oC hasta su posterior utilización en los experimentos.
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(Ospina et al., 1986). However, the effectiveness of affinin on phytopathogenic fungi is unknown. One of the advantages of obtaining substances such as affinin, produced by biosynthesis of plants is that there are no secondary effects on the ecosystem. These bioactives can be metabolized by one or another organism contrary to the chemical fungicides commonly used to date. In this research the fungicidal activity of purified affinin was evaluated. Also the crude extract of the roots of H. longipes in two Sclerotium species, important agricultural phytopathogens, was evaluated. MATERIALS AND METHODS The specimens of Heliopsis longipes were collected in Puerto de Tablas, municipio de Xichu, located in the Sierra Gorda in Guanajuato at altitudes between 1500 and 2500 m in terrain which once was oak forest (Quercus spp.) and on steep slopes. Annual precipitation of this location is between 500 and 1000 mm and a rainy season from May to September. To obtain the crude extract, 10 g of perfectly homogenized dried root were extracted with 50 mL of ethyl acetate in continuous extraction system (Tecator, Soxtec System HT 1043 Extraction Unit, Sweden) during 2 h at 80 oC. The extract obtained was resuspended in 2 mL of ethanol; the concentration of affinin was quantified by gas chromatography and kept at −4 oC until later use in the experiments. The affinin was purified from the crude extract by means of thin layer chromatography (TLC) on 20x20 glass plates covered with a 0.5 mm thick layer of silica (Silica Gel 60 G, Merck). The plates were developed with a solvent system consisting of hexane:ethyl acetate (2:1 v/v). Then they were air dried, sprayed with a 0.02 % fluorescein solution in ethanol and were observed under ultraviolet light. The affinin appears as a dark blue line with a retention index (Rf) of 0.5. This band was collected from the plates and the components were eluted with ethyl acetate and then evaporated to dryness with a nitrogen stream. This fraction, containing affinin, was resuspended again in ethanol and was submitted to high resolution liquid chromatography (HPLC), in a Microbondapack column C18 (Waters). Acetonitrile: water in a gradient from 40 to 70 % for 80 minutes at a flow of 1 mL/min was used as a solvent system. Affinin, the highest peak with retention time of 23 minutes, was collected. The purity and quantification of this amide was determined by gas chromatography (GC) in Hewlett Packard Mod. 5890 provided with a flame ionization detector (FID) and an injector with a split of 1:80. A Supelco SP-2330 capillary column (30 m long x 0.32 mm i.d.) was used. The conditions for this operation were 200 oC temperature of the injector and 250 oC for the detector. The temperature of the oven was set at the beginning to 150 oC for 3 minutes, with a temperature increase rate of 4 oC/minute up to a final temperature of 230 oC which was maintained for 15 minutes. Helium was used as carrier gas and 1 µL was injected as a sample. Experiments Wild strains of two species of Sclerotium: S.cepivorum and S. rolfsii which were used, were provided by the Ecological Biochemical
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La afinina se purificó a partir del extracto crudo mediante cromatografía en capa fina (TLC) sobre placas de vidrio de 20x20 cm cubiertas con una capa de gel de sílice (Silica Gel 60 G, Merck) de 0.5 mm de espesor. Las placas se desarrollaron con un sistema de solventes constituido por hexano:acetato de etilo (2:1 v/v), después de lo cual se secaron al ambiente, se asperjaron con una solución de fluoresceína a 0.02 % en etanol y se observaron bajo luz ultravioleta. La afinina se presenta como una banda azul-oscura con una retención relativa (Rf) de 0.5. Esta banda se colectó de las placas y los componentes se eluyeron con acetato de etilo el cual posteriormente se evaporó a sequedad con una corriente de nitrógeno. Esta fracción, conteniendo la afinina, se resuspendió en etanol y se sometió a cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), en una columna Microbondapack C18 (Waters). Como sistema de solventes se utilizó acetonitrilo:agua en un gradiente de 40 a 70 % en 80 minutos a un flujo de 1 mL/min. Se colectó el pico mayoritario que presentó un tiempo de retención de 23 minutos correspondiente a la afinina. La pureza y cuantificación de esta amida se determinó por cromatografía de gases (CG) en un equipo Hewlett Packard Mod. 5890 equipado con un detector de ionización de flama (FID), y un inyector con un radio de partición 1:80. Se utilizó una columna capilar Supelco SP2330 (dimensiones de la columna: 30 m x 0.32 mm i.d.). Las condiciones de operación fueron 200 oC para la temperatura del inyector y 250 oC para la del detector. La temperatura del horno se programó de manera que la inicial fuera 150 oC por 3 minutos, con una tasa de incremento de 4 oC/minuto, hasta una temperatura final de 230 oC la que se mantuvo por 15 minutos. Se utilizó helio como gas acarreador y se inyectó 1 µL de muestra. Experimentos Se utilizaron cepas silvestres de dos especies de Sclerotium: S. cepivorum y S. rolfsii, proporcionadas por el Laboratorio de Bioquímica Ecológica del CINVESTAV, Unidad Irapuato. La actividad antifúngica de la afinina purificada y del extracto crudo conteniendo esta amida se evaluó con base en la capacidad de inhibición del desarrollo micelial de cada una de las dos especies de Sclerotium en condiciones in vitro. Se efectuaron dos experimentos, uno utilizando afinina, y otro utilizando el extracto crudo. En cada experimento se evaluaron cuatro concentraciones de afinina: 5, 10, 15 y 25 µg/mL contra S. rolfsii, y S. cepivorum, además de un testigo (0 µg/mL) en ambos casos. Alícuotas de las fracciones evaluadas se incorporaron al medio papa-dextrosa (PDB) previamente esterilizado en matraces de 125 mL conteniendo 50 mL de medio cuando la temperatura de éste fue de aproximadamente 50 oC. Por cada concentración hubo tres repeticiones que fueron inoculadas con discos de micelio de 5 mm de diámetro y se incubaron en la oscuridad a 18 y 25 oC, para S. cepivorum y S. rolfsii respectivamente. Después de 10 días de incubación se determinó el peso seco del micelio, variable a la cual se aplicó un análisis de varianza de clasificación simple. Extracción de lípidos totales. El micelio seco se sometió a la extracción de lípidos totales, utilizando el sistema de extracción continua Soxtec (ya mencionado) con un sistema de solventes de extracción cloroformo-metanol (2:1 v/v). El tiempo utilizado para la extracción fue de dos horas. Posteriormente el extracto lipídico se
Laboratory of CINVESTAV, Unidad Irapuato. The antifungal activity of purified affinin and the crude extract containing the amide was evaluated taking into account the mycelium development inhibition of each one of the two Sclerotium species in vitro. Two experiments were performed, one using affinin, the other using crude extract. In each experiment four concentrations of affinin were evaluated: 5, 10, 15 and 25 µg/mL vs S. rolfsii, and S. cepivorum, and a control (0 µg/mL) in both cases. Aliquots of the evaluated fractions were incorporated in the potato-dextrose broth (PDB) medium previously sterilized in 125 mL flasks containing 50 mL of the medium its temperature being approximately 50 oC. For each concentration there were three replications which were inoculated with disks of mycelium 5 mm in diameter and incubated in darkness at 18 and 25 oC for S. cepivorum and S. rolfsii respectively. After 10 days of incubation, the dry weight of the mycelium was determined; a simple classification analysis of variance was applied. Extraction of total lipids. The dry mycelium obtained was submitted to the extraction of total lipids using the Soxtec continuous extraction system (already mentioned) with a chloroform-methanol (2:1 v/v) solvent extraction system. The extraction time was two hours. Later, the lipidic extract was reduced to dryness and redissolved to a volume of 1 mL with the same extraction solvent. Quantification of fatty acids. For the quantification of fatty acids present in the mycelium, the fatty acids were submitted to saponification; lipid extracts were derived, obtaining methyl-esters in accordance with the AOCS technique (1997). For this purpose a 500 µL aliquot of the lipid extract was used, 1 mL of a methanolic solution of hydroxy of potassium 0.5 M was added and incubated at 90 oC for 10 minutes. Later 1 mL of boron trifluoride in methanol was added and it was again incubated at 90 oC for 10 minutes. This solution was allowed to cool. 2 mL of water were added to it. Last, the methyl-esters were extracted with 3 mL of n-hexane, the organic fraction was separated and taken to a volume of 200 µL with absolute ethanol. The separation and quantification of fatty acids was done by GC, using the equipment previously mentioned to evaluate affinin. The calibration curves of the fatty acids were elaborated previously. The contents of the fatty acids are reported as total micrograms in the culture. Quantification of ergosterol. The ergosterol was purified from the lipid fraction before saponification, from which 90 µL were applied to a TLC plate, collaterally applying 20 µL of a standard of ergosterol to a concentration of 1 µg/µL. The plate was developed in a chloroformmethanol (2:1 v/v) system. After 2 h the plate was removed and the solvent was evaporated; later it was sprayed with fluorescein at 0.02 % in ethanol to identify the band corresponding to ergosterol by means of ultraviolet light at 250 nm. The band corresponding to ergosterol with a Rf of 0.58 was separated from the plate. It was extracted with 3 mL of ethyl acetate and resuspended in 100 µL of ethanol. This sample was quantified by GC in the same equipment, using a capilar column HP-1, 5 m x 0.53 mm and similar conditions to those previously mentioned. The ergosterol content appears as total micrograms in the culture.
RESULTS AND DISCUSSION The initial development of the mycelium in both fungi, on the basis of its dry weight in each culture was higher
RAMÍREZ-CHÁVEZ ET AL.: ACTIVIDAD FUNGICIDA DE Heliopsis longipes redujo a sequedad y se llevó a un volumen de 1 mL con el mismo solvente de extracción. Cuantificación de ácidos grasos. En este caso se saponificaron y derivaron los extractos lipídicos, obteniéndose metil-ésteres según la técnica de la AOCS (1997). Para esto se utilizó una alícuota de 500 µL del extracto lipídico, se adicionó 1mL de solución metanólica de hidróxido de potasio 0.5 M y se incubó a 90 oC durante 10 minutos. Después se le adicionó 1 mL de trifluoruro de boro en metanol y nuevamente se incubó a 90 oC por 10 minutos. Se dejó enfriar y se le adicionaron 2 mL de agua. Por último se extrajeron los metil-ésteres con 3 mL de n-hexano, se separó la fracción orgánica y se llevó a un volumen de 200 µL con etanol absoluto. La separación y cuantificación de ácidos grasos se llevó a cabo por cromatografía de gases, mediante el equipo mencionado para la evaluación de afinina. Previamente se elaboraron las curvas de calibración de los ácidos grasos mayoritarios. El contenido de ácidos grasos se reporta como microgramos totales en el cultivo. Cuantificación de ergosterol. El ergosterol se prepurificó a partir de la fracción lipídica antes de la saponificación, de la cual se aplicaron 90 µL a cromatografía en placa fina, aplicando colateralmente 20 µL de un estándar de ergosterol a una concentración de 1 µg/µL. La placa se desarrolló en un sistema de solventes cloroformo-metanol (2:1 v/v). Después de 2 h, la placa fue retirada y se dejó evaporar el solvente; posteriormente se asperjó con fluoresceína a 0.02 % en etanol para identificar la banda correspondiente a ergosterol mediante luz ultravioleta a 250 nm. La banda correspondiente a ergosterol con un Rf de 0.58 se separó de la placa, se extrajo con 3 mL de acetato de etilo y se resuspendió en 100 µL de etanol. Esta muestra se cuantificó por cromatografía de gases en el mismo equipo de CG, empleando una columna capilar HP-1 de 5 m x 0.53 mm y condiciones similares a las anteriormente mencionadas. El contenido de ergosterol se presenta como microgramos totales en el cultivo.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN El desarrollo inicial del micelio de ambos hongos, con base en su peso seco por matraz de cultivo, fue mayor en el testigo (Figura 2) y dicho desarrollo empezó a disminuir aun a las concentraciones mínimas de afinina, tanto en forma purificada como de extracto crudo en el medio. Sin embargo, hubo una respuesta diferencial en función del fitopatógeno. Así, en S. rolfsii (Figura 2a) hubo disminución continua del peso seco en el micelio al aumentar la concentración del compuesto activo en el extracto de raíces de 5 a 25 µg/mL, nivel en el cual el desarrollo micelial se inhibió casi por completo (90 %); un efecto similar presentó la afinina purificada en esta gama de concentraciones, observándose una inhibición de 80 % a la concentración de 25 µg/mL. En S. cepivorum (Figura 2b) y a la concentración de 10 µg/mL el efecto del extracto crudo sobre el micelio fue mayor que en S. rolfsii, pues la inhibición fue ligeramente superior a 60 %. En las concentraciones mayores, 15 y 25 µg/mL, el efecto se incrementó paulatinamente hasta
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in the control (Figure 2). This development started to diminish even at the minimum concentration of affinin in its purified form as well as in the crude extract. However, there was a difference in the response of each phytopathogen. In S. rolfsii (Figure 2a) there was a continuous diminishing of dry weight in the mycelium as the concentration of the active component in the root extract raised from 5 to 25 µg/mL at which level the mycelium development was inhibited almost completely (90 %); a similar effect was observed in the purified affinin in these concentrations, a reduction of 80 % to the concentration of 25 µg/mL. In S. cepivorum (Figure 2b) at a concentration of 10 µg/mL the effect of the crude extract on the mycelium was greater than in S. rolfsii, since the reduction was slightly above 60 %. In higher concentrations, 15 and 25 µg/mL, the effect increased gently until it reached a reduction of 80 % at 25 µg/mL, at which concentration the purified affinin presented a slightly higher fungicidal activity (Figure 2b). The estimates of average lethal doses for purified affinin, as well as for crude extract, for S. rolfsii varied between 15 and 20 µg/mL and for S. cepivorum between 5 and 10 µg/mL. However, the general effect of the crude extract and the purified affinin was practically the same in both fungi. With respect to fatty acid contents in S. rolfsii, the affinin did not present a significant effect on palmitic acid (C16:0), ester acid (C18:0) or oleic acid (C18:1). However, the affect on linolenic acid (C18:2) was different. At a concentration of 25 µg/mL, it diminished 75 % with respect to the control, while at 5, 10 and 15 µg/mL, no significant differences were noticed between these concentrations. Conversely, the content of all fatty acids mentioned at a dose of 25 µg/mL (Figure 3a) diminished from 85 to 100 %. This may suggest the activity of minor components other than affinin such as other alkamides present in the crude extract (Molina Torres et al., 1995, 1996) may affect the synthesis of these acids, therefore diminishing their contents. With reference to the contents of the fatty acids C16:0, C18:0, C18:1, C18:2, and C18:3 present in S. cepivorum, a similar pattern was observed in each of them. They diminished from 70 to 90 % from concentrations as low as 10 µg/mL of purified affinin and crude extract (Figure 3b). It should be pointed out that the differences in the amount of linolenic acid found in Figures 3a and 3b is characteristic of each species. On the other hand, the accumulation of ergosterol in the cultures of S. rolfsii (Figure 4a) was less when the medium contained crude extract even in the lowest concentration of 5 µg/mL, without noticeable change at 10 and 15 µg/mL; however, with 25 µg/mL the presence of ergosterol was not detected. Purified affinin at a concentration of 5 to 15 µg/mL had a greater effect than the crude extract which inhibited the accumulation of
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Figura 2. Efecto de las concentraciones del extracto crudo ( ) de Heliopsis longipes y afinina purificada ( ) sobre el peso seco del micelio de Sclerotium rolfsii (a) y S. cepivorum (b). Las barras horizontales indican la desviación estándar de tres repeticiones. Figure 2. Effect of the crude extract ( ) concentrations of Heliopsis longipes and purified affinin ( ) on the dry weight of the mycelium of Sclerotium rolfsii (a) and S. cepivorum (b). The horizontal bars indicate standard deviation of three replications
alcanzar una inhibición de 80 % a 25 µg/mL, concentración en la cual la afinina purificada presentó una actividad fungicida ligeramente mayor (Figura 2b). Las estimaciones de las dosis letales medias tanto para la afinina purificada como para ésta en el extracto crudo, para S. rolfsii varió entre 15 y 20 µg/mL y para S. cepivorum entre 5 y 10 µg/mL. Sin embargo, el efecto general del extracto crudo y de la afinina purificada prácticamente fue similar en ambos hongos. Con respecto al contenido de ácidos grasos en S. rolfsii, la afinina no presentó efecto significativo sobre los ácidos palmítico (C16:0), esteárico (C18:0), oleico (C18:1), excepto para el ácido linoleico (C18:2), en el cual a la concentración de 25 µg/mL hubo una disminución de 75 % con respecto al testigo, mientras que a concentraciones de 5, 10 y 15 µg/mL, no se observaron diferencias significativas entre éstas. Por otro lado, el extracto crudo disminuyó de 85 a 100 % el contenido de todos los ácidos grasos mencionados anteriormente a la dosis de 25 µg/mL (Figura 3a). Esto podría sugerir la actividad, además de afinina, de componentes minoritarios,
ergosterol between 50 and 70 % respectively, in relation to the control, while in concentrations of 25 µg/mL the presence of this sterol was not detected (Figure 4a). The effect on S. ceviporum by the presence of the crude extract in the medium presented a great variability in concentrations of 5 to 15 µg/mL. However, at a concentration of 25 µg/mL inhibition was total. Purified affinin showed a most noticeable inhibiting affect in the accumulation of ergosterol for this organism; from the low concentration where the reduction was approximately 65 % it slowed almost totally to the concentration of 15 µg/mL until it disappears totally at concentrations of 25 µg/mL (Figure 4b). It should be noticed that the two species of fungi had a different content of ergosterol, the value of the control being higher in S. rolfsii (353 µg) than in S. cepivorum (117 µg) in the initial inoculum. In both cases the ergosterol content in the presence of 25 µg/mL of purified affinin or in the crude extract is within the limit of the technical detection used. The reduction of the ergosterol content cannot be considered a specific inhibition as it proceeds in parallel with the diminishing of the dry weight of the mycelium; therefore it can be taken as an index of the growth of the fungus. The inhibitory action on the ergosterol synthesis is a phenomenon already documented for some systemic fungicides among which are the group of the triazols (Ragsdale and Sisler, 1990). The presence of ergosterol provides the basis for the selection of two types of antifungal agents, those which interact with the membrane, and those which interfere with its biosynthesis. The importance of the antifungal agents stimulates the research of the biosynthesis of ergosterol (Gow and Geoffrey, 1995). This work is just an initial research on the effect the affinin presents in the ergosterol content in these fungi. More detailed studies are required on the possible inhibitory mechanism of this antifungal agent to show in which part of the biosynthesis ergosterol takes effect. The action mechanism by which affinin affects the acid synthesis in fungi is still unknown. If the synthesis of fatty unsaturated acids in fungi is similar to the anaerobic mechanism used by Escherichia coli, it could be that affinin inhibits the activity of the hydroxydecanoil-dehydratase enzyme (HDDase). This enzyme initiates the fatty acids desaturation pathway and is inhibited specifically by 3-decynoil-N-acetyl cysteamine (Kass, 1968). The structure of the inhibitor has an aliphatic chain, of 10 carbons unsaturated, in its active allene form, in position two and an amide which reminds us of the affinin structure (Figure 1). It would be expected that the toxicity mechanism implies the inhibition of the fatty acid synthesis, the acetyl-coenzyme A, common precursor to both pathways, would favor the accumulation of ergosterol. The effect on the sterol biosynthetic pathway requires a more detailed study.
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Figura 3. Efecto de las concentraciones del extracto crudo ( ) de Heliopsis longipes y afinina purificada ( ) sobre el contenido de ácido linoleico (C 18:2) en Sclerotium rolfsii (a) y S. cepivorum (b). Las barras horizontales indican la desviación estándar de tres repeticiones. Figure 3. Effect of the concentrations of the crude extract ( ) of Heliopsis longipes and purified affinin ( ) on the linoleic acid content (C18:2) in Sclerotium rolfsii (a) and S. ceviporum (b). The horizontal bars indicate the standard deviation of three replications.
Figura 4. Efecto de las concentraciones del extracto crudo ( ) de Heliopsis longipes y afinina purificada ( ) sobre el contenido de ergosterol en Sclerotium rolfsii (a) y S. cepivorum (b). Las barras horizontales indican la desviación estándar de 3 repeticiones. Figure 4. Effect of the concentrations of the crude extract ( ) of Heliopsis longipes and purified affinin ( ) on the ergosterol content in Sclerotium rolfsii (a) and S. ceviporum (b). The horizontal bars indicate the standard deviation of three replications.
como otras alcamidas presentes en el extracto crudo (Molina Torres et al., 1995, 1996) sobre la síntesis de estos ácidos disminuyendo así su contenido. En cuanto al contenido de los ácidos grasos C16:0, C18:0, C18:1, C18:2 y C18:3 presentes en S. cepivorum, se observó un patrón similar para cada uno de éstos, los cuales disminuyeron de 70 a 90 % desde concentraciones tan bajas como 10 µg/mL tanto de afinina purificada como del extracto crudo (Figura 3b). Cabe destacar que las diferencias en la cantidad de ácido linoleico observadas en las Figuras 3a y 3b es característica de cada especie (Wassef, 1977). Por otra parte, la acumulación de ergosterol en los cultivos de S. rolfsii (Figura 4a) fue menor cuando el medio contenía extracto crudo aún a la concentración mínima de 5 µg/mL, manteniéndose sin cambio notorio a 10 y 15 µg/mL; sin embargo, con 25 µg/mL ya no se detectó la presencia de ergosterol. La afinina purificada, a las concentraciones de 5 a 15 µg/mL, tuvo un efecto mayor que el extracto crudo ya que inhibió entre 50 y 70 % la acumulación del ergosterol, respectivamente,
CONCLUSIONS Affinin and crude extract found in Heliopsis longipes showed maximum antifungal activity for Sclerotium rolfsii and S. cepivorum, measured on the basis of the growth of the total mycelium, at concentrations of 25 µg/mL. The responsible compound of the antifungal activity is affinin but it is possible that other bioactive compounds present in the crude extract participate, since there were some differences between the action of purified affinin and the crude extract. It is also possible that other compounds present in the crude extract, different from affinin, affect the reduction of the accumulation of the fatty acids C16:0, C18:0, C18:1 y C18:2 in the S. rolfsii mycelium. The crude extract and affinin reduce the content of such fatty acids, and also of C18:0, in the S. cepivorum mycelium. The affinin and the extract reduce the accumulation of the ergosterol content in the culture, from the minimum concentration evaluated (5 µg/mL) in the S. rolfsii as well as in the S. cepivorum. The medium lethal dose estimated was similar for the purified
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AGROCIENCIA VOLUMEN 34, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL 2000
en relación con el testigo, mientras que en concentraciones de 25 µg/mL ya no se detectó la presencia del esterol (Figura 4a). El efecto sobre S. cepivorum por la presencia del extracto crudo en el medio presentó una gran variabilidad en concentraciones de 5 a 15 µg/mL, sin embargo, a la concentración de 25 µg/mL la inhibición fue total. Para este organismo la afinina purificada mostró un efecto de inhibición más notable en la acumulación de ergosterol, desde la menor concentración donde se observa una reducción de aproximadamente 65 %, decayendo después casi totalmente a la concentración de 15 µg/mL hasta desaparecer en su totalidad a la concentración de 25 µg/mL (Figura 4b). Destaca que las dos especies de hongos tuvieron un diferente contenido de ergosterol siendo mayor el valor en el testigo para S. rolfsii (352 µg), que en S. cepivorum (117 µg), en el inóculo inicial. En ambos casos el contenido de ergosterol, en presencia de 25 µg/mL de afinina purificada o en el extracto crudo, está en el límite de detección de la técnica utilizada. La reducción en el contenido de ergosterol no se puede tomar como una inhibición específica puesto que es paralela a la disminución del peso seco del micelio por lo que se puede tomar como un índice de crecimiento del hongo. La acción inhibitoria sobre la síntesis de ergosterol es un fenómeno ya documentado para algunos fungicidas sistémicos sintéticos, entre ellos el grupo de los triazoles (Ragsdale y Sisler, 1990). La presencia de ergosterol provee las bases para la selectividad de dos tipos de agentes antifúngicos, aquellos que interactúan con la membrana, y los que interfieren en su biosíntesis. La importancia de los agentes antifúngicos estimula la investigación sobre la biosíntesis de ergosterol (Gow y Geoffrey, 1995) y este trabajo es solo una investigación inicial sobre el efecto que presenta la afinina en el contenido de ergosterol en estos hongos, requiriéndose de estudios más detallados sobre el posible mecanismo de inhibición de este agente antifúngico que muestre en qué parte de la biosíntesis del ergosterol se efectúa. El mecanismo de acción por el cual la afinina afecta la síntesis de los ácidos en hongos todavía se desconoce. Si la síntesis de ácidos grasos insaturados en hongos es similar al mecanismo anaeróbico que utiliza Escherichia coli, pudiera ser que afinina inhibiera la actividad de la enzima hidroxidecanoil-deshidratasa (HDDasa). Esta enzima inicia la ruta de desaturación de ácidos grasos y es inhibida específicamente por el 3-decinoilN-acetil cisteamina (Kass, 1968). La estructura del inhibidor tiene una cadena alifática de 10 carbonos, una insaturación, en su forma activa de aleno, en posición dos y una amida recordando la estructura de la afinina (Figura 1). Sería de esperarse que si el mecanismo de toxicidad implica la inhibición de la síntesis de ácidos grasos, la acetil coenzima A, precursor común a ambas rutas,
affinin and for the crude extract; between 15 and 20 µg/ mL in the case of S. rolfsii and between 5 and 10 µg/mL for S. cepivorum. However, the general effect of the crude extract and the purified affinin was practically similar in both fungi. —End of the English version—
pppvPPP favoreciera la acumulación de ergosterol. El efecto sobre la ruta de síntesis de este esterol requiere de un estudio más detallado. CONCLUSIONES La afinina y el extracto crudo presentes en Heliopsis longipes mostraron la máxima actividad antifúngica para Sclerotium rolfsii y S. cepivorum, medida con base en el crecimiento total del micelio, a concentraciones de 25 µg/mL. El compuesto responsable de la actividad antifúngica es la afinina, pero es posible que participen otros compuestos bioactivos presentes en el extracto crudo ya que hubo algunas diferencias entre la acción de la afinina purificada y la del extracto crudo. También es posible que otros compuestos presentes en el extracto crudo, diferentes a la afinina, afecten la reducción de la acumulación de los ácidos grasos C16:0, C18:0, C18:1 y C18:2 en el micelio de S. rolfsii. El extracto crudo y la afinina disminuyen el contenido de tales ácidos grasos, además de C18:3, en el micelio de S. cepivorum. La afinina y el extracto reducen la acumulación del contenido de ergosterol en el cultivo, desde la concentración mínima evaluada (5 µg/mL), tanto para S. rolfsii como para S. cepivorum. La dosis letal media estimada fue similar para la afinina purificada y para el extracto crudo: entre 15 y 20 µg/mL en el caso de S. rolfsii y entre 5 y 10 µg/mL para S. cepivorum. Sin embargo, el efecto general del extracto crudo y de la afinina purificada prácticamente fue similar en ambos hongos. AGRADECIMIENTOS Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México por el apoyo otorgado a los siguientes proyectos: CONACYT 26398 y SHIGO 97-810.
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El prestigio nacional e internacional de AGROCIENCIA le ha merecido estar incluida en el: INDICE DE REVISTAS MEXICANAS DE INVESTIGACION CIENTIFICA Y TECNOLOGICA del CONACYT. Además, está indizada en: v THE USDA-IBIDS ABSTRACTS v THE ESSENTIAL ELECTRONIC AGRICULTURAL LIBRARY (TEEAL) v ABSTRACTS ON TROPICAL AGRICULTURE v ABSTRACTS ON RURAL DEVELOPMENT IN THE TROPICS v AGRICULTURAL BIOLOGY v CAB ABSTRACTS v ZOOLOGICAL RECORD v PERIODICA puede consultarse a través de: v AGRIS (FAO) v AGRICOLA (EUA) v BIOSIS (HOLANDA)
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