Bol. Soc. Chil. Quím. v.47 n.1 Concepción mar. 2002 http://dx.doi.org/10.4067/S0366-16442002000100005
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE FLAVONOIDES AISLADOS DEL EXUDADO RESINOSO DE HELIOTROPIUM SINUATUM: EFECTO DEL TIPO DE ESTRUCTURA. BRENDA MODAK1, ABEL ARRIETA2, RENE TORRES 1+ Y ALEJANDRO URZUA1. 1
Facultad de Química y Biología, Departamento de Ciencias Químicas, Universidad de Santiago de Chile, Casilla 44, Correo 33, Santiago, Chile. 2
Facultad de Química y Biología, Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Santiago de Chile, Casilla 44, Correo 33, Santiago, Chile.
(Recibido: Enero 25, 2001 - Aceptado: Noviembre 19, 2001) ABSTRACT From the resinous exudates of Heliotropium sinuatum have been isolated and characterized eight flavonoids. In this paper we show the bacteride activity of resin and previously isolated flavonoids. Kinetics of bacterial growth gave the generation time of bacterial population. This method let it knew a quantitative approach of the antibacterial capacity of resins and flavonoids. A discussion of the effect of flavonoids class and type of substituents is developed. KEYWORD : Heliotropium sinuatum, resinous exudate, flavonoids, antibacterial activity. RESUMEN De la resina de Heliotropium sinuatum se han aislado y caracterizado ocho flavonoides. En este trabajo se presenta la actividad antibacteriana que poseen la resina y los flavonoides previamente descritos. Utilizando el método de la determinación del tiempo generacional de la población bacteriana de una cepa de Escherichia coli K-12 por cinéticas de crecimiento, se logró cuantificar la actividad antibacteriana de los compuestos aislados de la resina. Se discute el efecto de sustituyentes y tipo de flavonoide sobre la actividad antibacteriana. PALABRAS CLAVES: Heliotropium sinuatum, exudado resinoso, flavonoides, actividad antibacteriana INTRODUCCION En la búsqueda del papel que desempeñarían los exudados resinosos producidos por plantas, se ha propuesto que ellos serían la primera barrera protectora frente al ataque de insectos fitófagos, presentando por una parte una protección puramente mecánica a través de sus propiedades pegajosas atrapando a los predadores 1) y por otra dando una protección química por la presencia de los metabolitos secundarios que la componen, que le otorgarían a la resina propiedades antimicrobianas, antioxidantes y citotóxicas entre tantas otras 2). Varias familias de plantas que incluyen especies que producen exudados resinosos están representadas en el norte y centro-norte de Chile 3-5) . Entre ellas se encuentran las especies de la sección Cochranea del géneroHeliotropium (Boraginaceae) que tienen como característica común la produción de resinas en la superficie de hojas y tallos 5). Los estudios químicos-estructurales realizados en estas especies han llevado al aislamiento y determinación estructural de flavonoides y derivados geranilados aromáticos 6-10) . Recientemente, un examen químico realizado con la resina de Heliotropium sinuatum permitió el aislamiento de ocho flavonoides 11).
Dado que varios tipos de flavonoides son conocidos por conferir resistencia frente al ataque de microorganismos12-16), hemos iniciado un estudio de la actividad antibacteriana de los flavonoides de la resina de Heliotropium sinuatum utilizando como microorganismo de prueba Escherichia coli K-12 y buscando encontrar una correlación entre el tipo de flavonoide y la actividad que presenta. RESULTADOS Y DISCUSION Se estudió la actividad biológica del exudado resinoso producido por Heliotropium sinuatum y los flavonoides que lo componen: 5,7,4’ -trihidroxiflavanona (naringenina) 1, 5,3’ ,4’ trihidroxi-7-metoxiflavanona (7-O-metileriodictio 2, 3-acetoxi-5,7-dihidroxiflavanona (3acetato de pinobanksina) 3,5,7-dihidroxiflavanon (pinocembrina) 4, 5,7,3’ -trihidroxi-4’ metoxiflavanona (hesperetina) 5, 5,7-dihidroxi-3-metoxiflavona (3-O-metilgalangina) 6, 5,7,4’ -trihidroxi-3,3’ -dimetoxiflavona (3-O-metilisorhamnetina) 7 y 5,4’ -dihidroxi3,7,3’ -trimetoxiflavona (pachipodol) 8, sobre E.coli K-12. Para determinar el posible efecto sobre el metabolismo bacteriano se determinó el tiempo generacional de la población bacteriana mediante cinéticas de crecimiento durante 30 minutos en presencia y ausencia de la resina y los flavonoides. El efecto fue determinado cuantitativamente usando medidas de densidad óptica 16,17). Para obtener el valor del tiempo generacional se utilizó la ecuación 1: ln X- ln Xo = 0,693 [ D t / tg] donde : X = concentración final de microorganismo. Xo = concentración inicial de microorganismo. D t = tiempo del experimento. tg = tiempo generacional.
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R1=R4=OH R2=R3=H R1=OCH3 R2=H R3=R4=OH R1=OH R2=OAc R3=R4=H R1=OH R2=R3=R4=H R1=R3=OH R2=H R4=OCH3 R1=OH R2=OCH3 R3=R4=H R1=R4=OH R2=R3=OCH3 R1=R2=R3=OCH3 R4=OH
La curva de desarrollo normal de Escherichia coli y el efecto provocado por la resina de Heliotropium sinuatum y el fenol usado como patrón, se muestran en la figura 1. En este gráfico se puede observar deflexiones negativas con respecto a la conducta normal (ver
curva control) de las medidas de densidad óptica realizadas a 650 nm después de 30 minutos, tanto para la resina como para fenol. Se puede observar que a las concentraciones experimentales la resina de Heliotropium sinuatum resultó tener una actividad antibacteriana superior al fenol.
Fig. 1. Efecto de la resina de H.sinuatum en el desarrollo de E.coli K-12 control resina %fenol La figura 2 muestra los valores promedios de los tiempos generacionales alcanzados por la bacteria en presencia y ausencia de la resina, los flavonoides y el fenol. Dado que el dimetilsulfóxido (DMSO) bajo nuestras condiciones experimentales provocó un tiempo generacional de 0,85 horas, se consideró como activo al compuesto en el cual dicho parámetro resultó superior a 0,9 horas, tomando en cuenta el efecto que pudiera provocar el solvente utilizado. De acuerdo a esto, se puede observar que la resina de Heliotropium sinuatum y todos los flavonoides probados con excepción de 8, presentan un efecto inhibitorio a la concentración estudiada.
Fig.2. Tiempo de generación de E. Coli con los compuestos de prueba. La mayor inhibición en el desarrollo bacteriano la presentaron las flavanonas, estructuras que no poseen un doble enlace entre C-2 y C-3 y que aparecen, con la excepción del compuesto 3, sin sustituyente en la posición 3. Asimismo, aquellas flavanonas con mayor número de grupos hidroxilos (1, 2 y 5) provocaron mayor inhibición en la duplicación bacteriana, especialmente las que poseen además la presencia de un grupo metoxilo, que aumenta la lipofilia del compuesto, como en 1 y 5. Al cambiar el tipo de esqueleto de flavonoide, por formarse un doble enlace entre C-2 y C-3, se produce una disminución en la capacidad de inhibición, posiblemente asociada al aumento de la conjugación en la molécula y la mayor rigidez que ella adquiere. Todas son estructuras de flavonoles metilados (6, 7 y 8) Los requerimientos estructurales para la actividad antibacteriana aún no han sido bien definidos, sin embargo, hay un acuerdo de que a lo menos debe estar presente un grupo OH y cierto grado de lipofilicidad 15). En nuestro análisis, esto es claro y se agrega el aumento de la conjugación como un factor a considerar. Estos mismos requerimientos se encuentran en los fungicidas comerciales, los cuales ejercen su toxicidad a través de la acidez del grupo hidroxilo por desacoplamiento de la fosforilación oxidativa. Los protones son conducidos a través de la membrana mitocondrial destruyendo el diferencial de protones producidos en el transporte electrónico requerido para la formación de ATP. Para compuestos fenólicos con una dada lipofilicidad, mientras mayor sea su número de grupos hidroxilos, resultarán más eficientes desacopladores, ya que, podrían transferir más protones por molécula 18. Dado que las bacterias no poseen mitocondrias, este mismo mecanismo es el que podría estar operando en la actividad antibacteriana ejercida por los flavonoides, pero a nivel de membrana citoplasmática.
DESARROLLO EXPERIMENTAL La cepa de Escherichia coli K-12 fue obtenida del Laboratorio de Microbiología de la Universidad de Santiago, mantenida en agar nutritivo a 5ºC y fue reactivada, previo a los ensayos en caldo tripticasa de soya (Merck). La suspensión fue incubada por 20 horas a 36ºC. Una solución de fenol (1mg/mL) en dimetilsulfóxido fue preparada y utilizada como compuesto antibacteriano patrón. Las soluciones de prueba de los flavonoides y la resina fueron preparadas disolviendo 1 mg de ellas en 1 mL de dimetilsulfóxido. De esta solución se tomaron 0,1 mL y se agregaron sobre 0,9 mL de suspensión de microorganismo en medio de cultivo obteniéndose una concentración final de trabajo de 0,1 mg/mL. Los flavonoides fueron obtenidos del exudado resinoso de Heliotropium sinuatum por cromatografía preparativa en columna y fueron identificados por espectroscopía de RMN de 1H, U.V y espectrometría de masas 11) . Las medidas de densidad óptica fueron obtenidas siguiendo cinéticas de crecimiento durante 30 minutos a 36ºC a 650 nm. en un espectrofotómetro Shimadzu U.V 160 con celdas termorreguladas. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen el financiamiento de los proyectos FONDECYT 2950053 y 1961241 y DICYT(USACH, rtg) por el apoyo económico. REFERENCIAS 1) Goffreda,J; Mutschler,A y Tingey,W; Entomol.Exp.Appl.; 48; 101 (1988).
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