Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 53993: isla genómica y resistencia a metales pesados. Tesis grado Bioquímico.

Pontificia Universidad Católica de Valparaíso Facultad de Ciencias Instituto de Química Sección Bioquímica

“Estudio de la expresión diferencial a nivel transcripcional de genes exclusivos de Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 53993 posiblemente involucrados en la resistencia a metales”

TESIS PARA OPTAR AL TÍTULO DE BIOQUÍMICO

CRISTÓBAL LUIS CÓRDOVA SÁNCHEZ Agosto 2014 Director de Tesis

Comisión Evaluadora

Dr. Carlos A. Jerez G. Laboratorio de Microbiología Molecular y Biotecnología Facultad de Ciencias Universidad de Chile

Dra. Leda Guzmán Sección Bioquímica Facultad de Ciencias Pontificia Universidad Católica de Valparaíso Dr. James Robeson Sección Biología Facultad de Ciencias Pontificia Universidad Católica de Valparaíso

Una conversación de dos amigos sentados en el metro. Uno se levanta y se empieza a despedir. Existe la duda en su entre ceja. Y aquél que está de pie, con la duda, despidiéndose, estrechando la mano de su amigo dice: “Debo confesarte que yo no lo veo como descontextualizarse, o sea, en el sentido de la propia experiencia, sí, obvio, de eso se trata... ¡Bah! ¡Qué tontería! No he dicho nada”. Las puertas empiezan a cerrar y el sonido del vagón borra la escena. Y no sé muy bien por qué llegué a pensar esto, pero resultó que se me reveló el sentimiento de sentirte como mi hermano, de verdad mi hermano, pues comprendí y valoré que tu amistad y tu amor hacia mí son incondicionales.

Para mi familia, para quienes me ayudaron, y para mí.

ii

AGRADECIMIENTOS Todo lo que uno hace en la vida se lo debe a alguien. Nadie puede jactarse de haberlo hecho solo y sin ayuda. Y dentro de este largo proceso de tesis de pre-grado hubo muchas personas que estuvieron junto a mí acompañándome y ayudándome en el desarrollo de una investigación científica que me permitiera madurar como hombre de ciencia. Tal oportunidad la encontré en el Laboratorio de Microbiología Molecular y Biotecnología de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Chile liderado por el Dr. Carlos A. Jerez G. Es a él y a su hombre de confianza y mano derecha, Dr. Claudio Navarro, a quienes entrego mi agradecimiento más profundo. Al Dr. Carlos Jerez le agradezco enormemente por recibirme en su laboratorio y por permitirme desarrollar un trabajo de investigación para finalizar mi formación de pre-grado como Bioquímico a pesar del tiempo y los recursos requeridos, y al Dr. Claudio Navarro por ser el principal artífice de que este trabajo de investigación haya llegado a buen término gracias al constante apoyo científico que me brindó, y aún más, gracias al apoyo extra-científico que me otorgó sin pedir nada a cambio, salvo una merecida chorrillana del puerto de Valparaíso. Importantes fueron también Luis Orellana y Simón Beard, ambos compañeros de laboratorio, pues en sus investigaciones previas fundé las bases para el desarrollo de esta tesis. En definitiva, siempre hubo y aún hay un gran grupo en este laboratorio que facilita el trabajo científico gracias a su insuperable calidad humana, promoviendo un ambiente de trabajo envidiable por muchos. Debo destacar la presencia de los técnicos Don Juan Araos, Ricardo Reyes y Alejandro Araneda; las compañeras Cecilia Mauriaca, Josefina Cornejo y Daniela Soto; los compañeros Rodrigo Almárcegui, Andrés Villa, Álvaro Orell, Matías Rivero, Juan Pablo Weber, Sebastián Aguilar, Sebastián Gallardo, Rodrigo Castillo, Cristóbal Martínez y Diego von Bernath; y también destacar la camaradería con los integrantes del laboratorio amigo: Valentina Abarca, Macarena Varas, Javiera Ortiz, Camilo Valdivieso, Matías Castro, Pablo Álviz, Andrés Marcoleta, Mauricio Díaz y Francisco Chávez. Por supuesto, debo entregar los agradecimientos respectivos a Alejandra Aránguiz del Laboratorio Dr. Mario Galindo, Facultad de Medicina, ICBM, Universidad de Chile y a Leonardo Pavez y Verónica Cambiazo del Laboratorio de Bioinformática y Expresión Génica, INTA, por haberme facilitado material genético imprescindible y las dependencias del laboratorio para poder realizar parte de mis investigaciones.

iii

Finalmente los agradecimientos recaen sobre mi familia. Mamá (Anita), papá (Miguel), hermano (Miguel Ángel) y hermana (Mª Alejandra): sé que siempre han deseado lo mejor para mí, obvio que yo también para ustedes. Espero que con la finalización de este proceso sientan que la misión fue cumplida y mis deudas saldadas y se sientan orgullosos de mí, así como yo me siento orgulloso de cada uno de ustedes como personas, como profesionales y más aún como el grupo familiar que conformamos. Los amo. Esta tesis de pre-grado se llevó a cabo gracias al financiamiento del Instituto de Dinámica Celular y Biotecnología (ICDB) con fondos ICM-FIC Proyecto P05-001-F y principalmente gracias al Proyecto FONDECYT 1070986 y Proyecto FONDECYT 1110214 del Dr. Carlos A. Jerez G.

iv

ÍNDICE DE CONTENIDO ÍNDICE DE FIGURAS.................................................................................................................vii ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................. viii GLOSARIO DE ABREVIATURAS ...............................................................................................ix I.

RESUMEN .......................................................................................................................... 1

II.

PRESENTACIÓN DEL PROBLEMA ............................................................................. 2

III.

INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 3

IV.

HIPÓTESIS....................................................................................................................... 11

V.

OBJETIVOS ..................................................................................................................... 12 i.

Objetivo General. ............................................................................................................... 12

ii.

Objetivos Específicos. ........................................................................................................ 12

VI.

DISEÑO EXPERIMENTAL ........................................................................................... 13

VII.

MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................ 14

i.

Análisis bioinformático y diseño de partidores. ................................................................. 14

ii.

Crecimiento de A. ferrooxidans en condición control........................................................ 16

iii. Crecimiento de A. ferrooxidans en presencia de metales pesados. .................................... 16 iv. Obtención del material genético. ........................................................................................ 17 1.

DNA de A. ferrooxidans. ............................................................................................. 17 a)

Colección, Lavado y Lisis Celular. .......................................................................... 17

b)

Electroforesis de DNA en geles de Agarosa. ........................................................... 18

c)

Cuantificación de DNA. ........................................................................................... 18

2.

RNA de A. ferrooxidans. ............................................................................................. 18 a)

Colección, Lavado y Lisis Celular. .......................................................................... 18

b)

Extracción de RNA total. ......................................................................................... 19

c)

Tratamiento con DNasa. ........................................................................................... 19

d)

Electroforesis de RNA en geles de Agarosa. ........................................................... 19

e)

Cuantificación de RNA. ........................................................................................... 19

3.

mRNA de exp-1. .......................................................................................................... 20 a)

Extracción DNA plasmidial. .................................................................................... 20

b)

Digestión enzimática. ............................................................................................... 20 v

v.

c)

Purificación de fragmentos de DNA. ....................................................................... 21

d)

Transcripción In vitro del gen exp-1. ....................................................................... 21

Macro-arreglos de DNA. .................................................................................................... 21 1.

Productos de PCR. ....................................................................................................... 21

2.

Sembrado de las membranas de nylon. ........................................................................ 22

3.

Marcaje de las sondas de cDNA. ................................................................................. 22

4.

Hibridización, lavado y exposición de las membranas. ............................................... 23

5.

Normalización y tratamiento de los datos. ................................................................... 23

vi. Ensayo de co-transcripción................................................................................................. 23 vii. Ensayo funcional. ............................................................................................................... 24 1.

Clonamiento. ................................................................................................................ 24

2.

Transformación de TOP10. .......................................................................................... 24

3.

Transformación de BL21. ............................................................................................ 25

4.

Halos de Inhibición. ..................................................................................................... 25

VIII. RESULTADOS ................................................................................................................. 26 i.

Características de la zona genómica exclusiva de A. ferrooxidans ATCC 53993. ............ 26

ii.

Crecimiento de A. ferrooxidans ATCC 53993. .................................................................. 30

iii. Obtención del material genético. ........................................................................................ 31 1.

Productos de PCR. ....................................................................................................... 31

2.

RNA de A. ferrooxidans ATCC 53993. ....................................................................... 33

3.

mRNA de exp-1. .......................................................................................................... 34

iv. Macro-arreglos de DNA. .................................................................................................... 35 v.

Ensayo de co-transcripción................................................................................................. 37

vi. Ensayo funcional. ............................................................................................................... 40 IX.

DISCUSIÓN ...................................................................................................................... 41

X.

CONCLUSIONES ............................................................................................................ 44

XI.

BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................. 45

XII.

MATERIAL SUPLEMENTARIO .................................................................................. 48

vi

ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Esquema de los mecanismos de resistencia a metales en microorganismos acidófilos...4 Figura 2. Interacción bacteria-mineral durante el ataque de A. ferrooxidans sobre la pirita……...5 Figura 3. Modelo propuesto para la resistencia al cobre en A. ferrooxidans ATCC 23270………6 Figura 4. Alineamiento entre los genomas de A. ferrooxidans………………………...…………7 Figura 5. Comparación esquemática entre ambas cepas de A. ferrooxidans……………………...8 Figura 6. Esquema resumen del análisis bioinformático donde se indican las propiedades básicas de la IG de A. ferrooxidans ATCC 53993………………………………………………………..27 Figura 7. Detalle de la Isla Genómica…………………………………………………………...28 Figura 8. Curva de crecimiento de A. ferrooxidans ATCC 53993 en presencia o ausencia de metales……………………………………………………………………………………………29 Figura 9. Productos de PCR……………………………………………………………………..30 Figura 10. RNA de A. ferrooxidans……………………………………………………………...32 Figura 11. mRNA de exp-1……………………………………………………………………...33 Figura 12. Diagrama de la disposición de los productos de PCR sembrados en una membrana de nylon……………………………………………………………………………………………...34 Figura 13. Imagen representativa del resultado de la hibridización de dos membranas de nylon…………………………………………………………………………………………...…34 Figura 14. Veces de expresión relativa…………………………………………………………..35 Figura 15. Esquema ensayo de co-transcripción……………………………………….…..……36 Figura 16. Ensayo de co-transcripción………………………………………………………..…38 Figura 17. Ensayo funcional…………………………………………………………………..…39 .

vii

ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Familias de proteínas importantes para el transporte de metales pesados…………….....4 Tabla 2. Concentración de metales pesados a la que existe actividad metabólica en distintos microorganismos y con especial énfasis en bacterias y arqueas acidófilas…………………..……5 Tabla 3. Secuencias de los partidores utilizados…………………………………………………13 Tabla 4. Partidores específicos utilizados en experimentos de co-transcripción……………..….15 Tabla 5. Diseño de partidores específicos utilizados en experimentos de funcionalidad……..…15

viii

GLOSARIO DE ABREVIATURAS  ATCC: American Type Culture Collection - Colección Americana de Cultivos Tipo.  BLAST: Basic Local Alignment Search Tool - Herramienta de Búsqueda por Alineamientos Básicos Locales.  cDNA: DNA de copia o DNA complementario.  dCTP: desoxicitosina trifosfato.  DEPC: dietilpirocarbonato.  DMSO: dimetilsulfóxido.  DNA: ácido desoxirribonucleico.  dNTPs: desoxirribonucleótidos trifosfato.  EDTA: ácido etilendiaminotetraacético.  ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay - Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas.  HEPES: ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etano-sulfónico.  IG: Isla Genómica.  kb: kilo bases.  LB: medio de crecimiento Luria-Bertani.  NCBI: National Center for Biotechnology Information - Centro Nacional de Información en Biotecnología.  OD: densidad óptica.  ORF: Open Reading Frame - Marco Abierto de Lectura.  pb: pares de bases.  PCR: Polymerase Chain Reaction - Reacción en Cadena de la Polimerasa.  PoliP: polifosfatos inorgánicos.  RNA: ácido ribonucleico.  RT: Transcripción Reversa.  RT-PCR: Transcripción Reversa acoplada a la Reacción en Cadena de la Polimerasa.  SDS: Sodium Dodecyl Sulfate – Dodecil Sulfato de Sodio.  SSC: Saline-Sodium Citrate – Citrato de Sodio Salino.  SSPE: Saline-Sodium Phosphate-EDTA – Fosfato de Sodio Salino-EDTA.  TAE: Tris-Acetato-EDTA. ix

 THG: Transferencia Horizontal de Genes.  Tris:

o

THAM,

tris(hidroximetil)aminometano

o

2-amino-2-hidroximetil-1,3-

propanodiol.  UV: ultra violeta.

x

I.

RESUMEN Es sabido que los microorganismos que participan en los procesos de biolixiviación

(lixiviación = solubilización de metales) poseen altos niveles de resistencia a distintos metales pesados. Entre estos microorganismos destaca Acidithiobacillus ferrooxidans, una γproteobacteria Gram-negativa quimiolitoautotrófica capaz de oxidar el ion ferroso, azufre elemental o compuestos reducidos del azufre (u oxidados parcialmente) como sustratos energéticos. Actualmente se encuentran disponibles para uso público las secuencias de los genomas de dos cepas de esta bacteria: A. ferrooxidans ATCC 23270 y A. ferrooxidans ATCC 53993. Experimentalmente se observa que la cepa ATCC 53993 es más resistente al crecimiento en presencia de metales que la cepa ATCC 23270. Entonces, se quiso responder a la interrogante del qué permite que ATCC 53993 presente esta mayor resistencia a metales. Para ello se adaptó esta cepa al crecimiento en distintos metales, cuales fueron cobre, cadmio, níquel y zinc, y se procedió a realizar ensayos de macro-arreglos con la utilización de cDNA marcado con fósforo 32 para cada condición de crecimiento. Con esto se analizó la expresión diferencial de genes exclusivos de esta cepa (genes que la cepa ATCC 23270 carece) entre cada condición de crecimiento versus el control. De estos genes, Lferr_0211 presentó una notable sobre-expresión de 5,2 veces en respuesta a cadmio. Lferr_0211 resultó ser parte de un operón que contempla a Lferr_0209, una ATPasa tipo P translocadora de metales pesados, por lo que se realizó su complementación heteróloga en E. coli y se midió su efecto fisiológico mediante halos de inhibición utilizando sensi-discos con cadmio. Se observó, entonces, una inhibición del crecimiento de E. coli no complementada alrededor del sensi-disco equivalente a 12,79 cm2 versus los 5,23 cm2 de inhibición del crecimiento de E.coli complementada con Lferr_0209. Por lo tanto, el operón que contempla a Lferr_0209 y Lferr_0211 le confiere a A. ferrooxidans ATCC 53993 mayor capacidad de resistencia al cadmio. Así, entonces, encontramos cepas de una misma especie con distintas capacidades adaptativas gracias a la adquisición de grupos de genes especializados en la respuesta a metales, los cuales permiten la supervivencia de ésta en ambientes altamente hostiles. Y más aún, la sola adquisición de un gen que permita el ordenamiento correcto para formar un operón le confiere a la cepa el poder evolutivo necesario para su supervivencia.

1

II.

PRESENTACIÓN DEL PROBLEMA Acidithiobacillus ferrooxidans es una bacteria Gram negativa, quimiolitoautotrófica,

capaz de utilizar el ion ferroso y una variedad de compuestos reducidos de azufre como fuentes de energía. Este microorganismo además puede crecer en concentraciones elevadas de metales pesados. En la cepa de A. ferrooxidans ATCC 23270 ya se han identificado varios marcos abiertos de lectura (ORFs) relacionados con la resistencia al Cu. Algunos corresponden a componentes ortólogos del sistema Cus de resistencia al Cu de E. coli, dos componentes del sistema de resistencia al Cu de P. syringae y 3 ATPasas de Cu. Mediante un análisis preliminar del genoma de A. ferrooxidans ATCC 53993 se han identificado el mismo número y tipo de determinantes de resistencia al Cu encontrados en A. ferrooxidans ATCC 23270. Adicionalmente, existe una región de alrededor 200 kb que sólo está presente en A. ferrooxidans ATCC 53993. En esta región se encuentra un número extra de ORFs que posiblemente están relacionados con los determinantes de resistencia al Cu ya identificados en A. ferrooxidans ATCC 23270 y posibles determinantes de resistencia a otros metales. La presente tesis de pregrado tiene como objetivo caracterizar los patrones de expresión de ORFs potencialmente relacionados con la resistencia a metales pesados presentes en una zona genómica exclusiva de A. ferrooxidans ATCC 53993.

2

III.

INTRODUCCIÓN Un pre-requisito mínimo para la vida es la existencia de un gradiente químico redox para

convertir energía. Esto permite el flujo de energía y su uso en las reacciones bioquímicas de la célula. La mayoría de las células usan compuestos orgánicos como azúcares a modo de combustibles (donadores de electrones). Su oxidación en la presencia de oxígeno o respiración provee carbón a la célula, generando CO2 y H2O como productos finales y energía en la forma de electrones. Esta energía es almacenada principalmente en forma de ATP para ser usado en el metabolismo celular. Un grupo especial de microorganismos (Bacterias y Arqueas) conocidos como quimiolitoautotróficos son capaces de utilizar minerales como combustibles. Su oxidación genera electrones para obtener ATP y el carbón es obtenido mediante la fijación de CO2. Durante esta oxidación mineral aeróbica los metales son solubilizados. La respiración anaeróbica también puede solubilizar metales. En este caso, el mineral actúa como aceptor de electrones y el metal es solubilizado bajo condiciones reductoras. Varios microorganismos son capaces de reducir metales pesados y acoplar su reducción con la oxidación de fuentes de energía tales como compuestos orgánicos. Estas reacciones son parte del proceso biogeoquímico normal en la naturaleza, realizadas bajo condiciones principalmente ácidas (pH 1-3) por la mayoría de este tipo de microorganismos (Jerez, 2009) por lo que son caracterizados como acidófilos. Los microorganismos acidófilos están dispersos en distintos ambientes naturales y artificiales, los que son extremadamente ácidos y con una alta concentración de metales pesados. En soluciones de la Montaña de Hierro en California, USA, alcanzan a medirse concentraciones de Fe correspondientes a 1.99 M (111 g/l) y las concentraciones de cobre, cadmio, arsénico y zinc cubren el rango de las decenas de gramos a unos cuantos gramos por litro. Otro claro ejemplo de este tipo de ambientes es el que se da en los procesos mineros de lixiviación bacteriana, en los que además de existir bajos valores de pH, también hay altas concentraciones de metales pesados (revisado en Dopson y cols., 2003). Este proceso se desarrolla por comunidades de microorganismos que participan en el depósito y solubilización de metales pesados, lo que permite la recuperación industrial de metales como el cobre, cobalto, níquel, zinc y uranio, entre otros, extrayéndolos en forma de sulfatos de metal a partir de súlfuros insolubles u óxidos (Rohwerder y cols., 2003). 3

Los metales pesados abarcan todos aquellos metales con una densidad sobre los 5 g/cm3, exceptuando Escandio (Sc), Titanio (Ti) e Itrio (Y). De los 90 elementos que se dan en la naturaleza, 21 son no-metales, 16 son metales livianos y los 53 restantes son metales pesados. La mayoría son metales de transición, los cuales se presentan como cationes capaces de formar compuestos complejos con capacidad redox, siendo importantes entonces en algunas reacciones bioquímicas. De los 53 metales pesados solo 22 tienen cierto interés biológico debido a su concentración, considerando el agua de mar como un ambiente promedio. Se distinguen, entonces, 4 grupos de metales pesados como posibles elementos traza: elementos frecuentes cuyas concentraciones van de 100 nM a 1 µM (Fe, Zn, Mo); elementos que van de 10 nM a 100 nM (Ni, Cu, As, V, Mn, Sn, U); elementos raros (Co, Ce, Ag, Sb) y elementos justo bajo 1 nM (Cd, Cr, W, Ga, Zr, Th, Hg, Pb). De todos éstos, 17 son los elementos traza de importancia biológica en función de su solubilidad bajo condiciones fisiológicas y su toxicidad. Los más importantes y menos tóxicos son Fe, Mo y Mn; elementos tóxicos con importancia alta a moderada son Zn, Ni, Cu, V, Co, W y Cr; por último, los más tóxicos y que no poseen beneficio para la célula son As, Ag, Sb, Cd, Hg, Pb y U (revisado en Nies, 1999). A pesar que los microorganismos requieren la presencia de una cierta cantidad de metales que cumplen un rol bioquímico esencial en el metabolismo, éstos se pueden acumular por encima de las concentraciones fisiológicas normales debido a la acción inespecífica de los sistemas de transporte expresados constitutivamente, volviéndose tóxicos. En el medio intracelular el efecto tóxico de los metales puede reflejarse en la formación de enlaces coordinados con aniones bloqueando los grupos funcionales de las enzimas, inhibiendo sistemas de transporte, desplazando metales esenciales de su sitio de unión natural y perturbando la integridad de la membrana celular.

4

Existen 5 mecanismos básicos (Figura 1) que permiten generar la resistencia celular a metales: (1) eflujo del metal tóxico hacia el exterior de la célula; (2) secuestro intra/extracelular; (3) exclusión mediante barrera de permeabilidad; (4) reducción de la sensibilidad de blancos celulares y (5) conversión enzimática (revisado en Dopson y cols., 2003).

Figura 1. Esquema de los mecanismos de resistencia a metales en microorganismos acidófilos. Éstos son, (desde arriba y en el sentido de las agujas del reloj): eflujo del metal tóxico fuera de la célula; unión del metal intra/extracelular reduciendo su toxicidad; exclusión del metal mediante una barrera de permeabilidad; alteración de componentes celulares disminuyendo su sensibilidad al metal tóxico; y conversión enzimática del metal a una forma menos tóxica (Tomada de Dopson y cols., 2003).

El transporte de los metales pesados a través de la célula se logra mediante una variedad de proteínas caracterizadas en diversas familias (revisado en Nies, 1999) (Tabla 1). Tabla 1. Familias de proteínas importantes para el transporte de metales pesados. Familia ABC

Dirección del transporte Energía Iones metálicos Captura ATP Mn2+, Zn2+, Ni2+, Fe2+ Eflujo ATP --Tipo-P Ambas ATP Mg2+, Mn2+, Ca2+, K+, Cu2+, Zn2+, Cd2+, Pb2+, Ag+ Tipo-A Eflujo ATP Arsenito RND Eflujo Gradiente de protones Co2+, Zn2+, Cd2+, Ni2+, Cu2+, Ag+ HoxN Captura Quimiosmótico Co2+, Ni2+ MIT Captura Quimiosmótico Mayoría de los cationes CDF Eflujo Quimiosmótico Zn2+, Cd2+, Co2+, Fe2+ ABC: ATP-binding cassette; RND: resistance, nodulation, cell division; MIT: metal inorganic transport; CDF: cation-diffusion facilitators (Modificada de Nies, 1999).

Es sabido que los microorganismos que participan en los procesos de biolixiviación poseen altos niveles de resistencia a distintos metales pesados (Johnson y Hallberg, 2003), entre los

que

destaca

Acidithiobacillus

ferrooxidans,

una

γ-proteobacteria

Gram-negativa

quimiolitoautotrófica capaz de oxidar el ion ferroso, azufre elemental o compuestos reducidos del azufre (u oxidados parcialmente) como sustratos energéticos (Valenzuela y cols., 2006; Jerez, 2009, 2011 y 2013). En el caso de la pirita (FeS2), la bacteria, al oxidar el ion ferroso (Fe2+) presente en la solución genera el ion férrico (Fe3+), fuerte oxidante que permite la oxidación química de los enlaces metal sulfuro de la pirita, liberando así Fe2+, que será re-oxidado a Fe3+ 5

por acción de A. ferrooxidans, y tiosulfato (S2O32-) que puede ser mayormente oxidado a ácido sulfúrico, la fuente ácida del ambiente (Figura 2) (Jerez, 2009; Dopson y cols., 2003).

Figura 2. Representación de la interacción bacteria-mineral durante el ataque de A. ferrooxidans sobre la pirita generando ion férrico y tiosulfato, el cual es finalmente oxidado a ácido sulfúrico (Tomada de Jerez, 2009 y reproducido de Rohwerder, 2003).

Este microorganismo además puede ser adaptado al crecimiento en altas concentraciones de distintos metales pesados (Das y Modak, 1998; Navarro y cols., 2009). Es así como se reportó una adaptación al crecimiento de hasta 800 mM de Cu en su medio de desarrollo, de hasta 1 M de Zn, hasta 1 M de Ni, hasta 500 mM de Cd y hasta 84 mM de As (revisado en Dopson y cols., 2003) (Tabla 2). Es por este motivo que A. ferrooxidans resulta ser un modelo de estudio muy interesante en cuanto a su capacidad de resistencia a metales pesados. Tabla 2. Concentración de metales pesados a la que existe actividad metabólica en distintos microorganismos y con especial énfasis en bacterias y arqueas acidófilas. Microorganismo

Concentración de metal a la que hay actividad metabólica (mM) As (III)

Cu(II)

Zn(II)

Cd(II)

Ni(II)

4

1

1

0,5

1

Bacteria Neutrófila Escherichia coli Bacteria Acidófila Acidiphilium cryptum

ND

15

125

700

20

Acidiphilium multivorum

30

10

40

20

350

"Acidiphilium symbioticum" KM2

ND

20

150

700

20

"Acidiphilium symbioticum" H8

ND

15

150

700

30

Acidiphilium angustum

ND

5

8

0,51, donde Qsr = [IC/(IC+IFX)] (Wang y cols., 2001), la INR de las diferentes réplicas biológicas (x3) de RNA y técnicas (x2) de hibridación para cada mancha y en cada condición se promediaron. Así se obtuvo la intensidad neta relativa promedio (INRX). vi. Ensayo de co-transcripción. A partir de la síntesis de cDNA descrita en el punto 3 de la sección anterior, pero sin la incorporación de [α-32P] a dCTP, en general, se usó el siguiente formato para las reacciones de PCR, usando los componentes de la enzima GoTaq: 4 µL de cDNA 1/20; 200 µM de dNTPs; 5% 23

v/v DMSO; 0,2 µM de cada partidor; 2,5 mM de MgCl2; Buffer GoTaq 1X; 1,25 U de GoTaq DNA Polimerasa en un volumen final de 25 µL. Se utilizó un protocolo de PCR tipo “Hot-Start” consistente en una desnaturalización inicial de 5 min a 95 ºC, 35 ciclos de desnaturalización a 95 ºC por 30 s, anillamiento por 30 s a “T” ºC y extensión por 1 min a 72 ºC, seguidos de una extensión final de 3 min a 72 ºC. Se revisaron todos los amplicones por electroforesis en gel de agarosa al 1% en 0,5X TAE. vii. Ensayo funcional. Para el gen de interés se sintetizó un partidor “forward” especial, con una cabeza ShineDalgarno en el extremo 5`, como lo indica la Tabla 5. Se purificó su producto de PCR, se clonó en el vector pGEMTeasy y se transformó en E. coli TOP10 con el fin de seleccionar los clones correctamente orientados. Estos últimos se transformaron finalmente en células BL21 para llevar a cabo los ensayos de funcionalidad. 1. Clonamiento. Una vez obtenido el fragmento de DNA correspondiente al gen de interés, se clonó en el vector pGEMTeasy. Para esto se tomaron 0,5 μL del vector (5 ng de DNA plasmidial); 1 μL del producto de PCR purificado (10-20 ng de DNA aproximadamente); Buffer 1X; 1 μL de ligasa y agua nano pura hasta completar los 6 μL. La reacción se dejó incubar por 1 hr a 16 ºC. 2. Transformación de TOP10. El producto de la reacción de clonamiento entre el vector pGEMTeasy y el gen de interés se utilizó para la transformación por “shock” térmico de la cepa “One Shot TOP10” (Invitrogen) de E. coli. Para esto se incubaron 50 μL de células y 3 μL del producto de ligación en hielo por 30 min. Luego, esta mezcla se incubó a 42 ºC por 45 s y después 5 min en hielo. Posteriormente, a esta reacción se le agregó 250 μL de medio S.O.C (2% triptona, 0,5% extracto de levadura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glucosa) y se incubó por 1 h a 37 ºC con agitación suave. Finalmente, alícuotas de 30 μL de esta mezcla se esparcieron en medios sólidos de LB suplementados con ampicilina (100 mg/L), 40 µL de X-gal y 1 mM IPTG y se dejaron incubando a 37 ºC toda la noche.

24

3. Transformación de BL21. De la transformación de TOP10 se seleccionaron las colonias blancas, se procedió a la extracción y purificación del plasmidio con la utilización del kit “E.Z.N.A. plasmid kit II” según las indicaciones del fabricante y se chequeó la correcta orientación del inserto mediante el corte con enzimas de restricción. Posteriormente se realizó la transformación de la cepa de E. coli “One Shot BL21(DE3)” (Invitrogen) mediante “shock” térmico, tal cual fue descrito anteriormente. 4. Halos de Inhibición. Para el desarrollo de estos experimentos, los clones que contenían los determinantes de resistencia se crecieron por toda la noche en medio LB-ampicilina-IPTG. Este cultivo se diluyó 100 veces y se incubó con agitación a 37 ºC hasta que alcanzó una OD600 de 0,6, momento en que se diluyó 10 veces. De esta dilución se sembraron 100 µL sobre placas LB-ampicilna-IPTG, las que se dejaron secar durante 20 min a temperatura ambiente y se colocó un disco de papel filtro en el centro de la placa. Sobre este disco se aplicaron 15 µL de una solución 1 M de CdSO4 estéril. Las placas se incubaron durante 18 h a 37 ºC y se determinó al área de inhibición del crecimiento alrededor del disco que contenía cadmio (Bauer y cols., 1966).

25

VIII.

RESULTADOS

i. Características de la zona genómica exclusiva de A. ferrooxidans ATCC 53993. El análisis bioinformático realizado muestra que la zona genómica exclusiva de la cepa ATCC 53393 (Figura 6) se inserta después del ORF Lferr_0127 (AFE2898 en la cepa ATCC 23270), anotado como una enzima relacionada con el metabolismo de los t-RNA (tipo MiaB) y antes del ORF Lferr_0299 (AFE2897 en la cepa ATCC 23270), anotado como un gen relacionado con la fijación de nitrógeno (Nif-U). Tiene una elongación de 163.564 pb, representando un 5,67% del total del genoma y conteniendo un total de 169 genes desde el ORF Lferr_0128 al Lferr_0298, inclusive. Por otra parte, en esta región de DNA exclusiva de la cepa ATCC 53993 es posible encontrar diversos elementos característicos de una isla genómica (IG). Entre ellos están: estar inserta a continuación de un gen relacionado con el metabolismo de los tRNA y contiguo a un gen que codifica para una recombinasa (dominio serina resolvasa). Otro elemento característico de IG es la diferencia del porcentaje G:C puesto que la región exclusiva de la cepa ATCC 53993 tiene un porcentaje G:C de 57,2% mientras que el porcentaje G:C del genoma sin la IG es de 58,9%. Adicionalmente, es posible encontrar varios ORFs anotados como recombinasas del tipo integrasas y transposasas. Los ORFs Lferr_0180 y Lferr_0181 están anotados como transposasas, el primero asociado al elemento de inserción ISPsy14 y el segundo, a una integrasa, como también lo está el ORF Lferr_0215. Además, se encuentran una serie de ORFs anotados como transposasas de la familia IS4 (Lferr_0150, Lferr_0196 y Lferr_0201). También es posible encontrar elementos de transposición del tipo Tn-7. Los ORF Lferr_0144 y Lferr_0221 codifican para las proteínas C y B de este elemento, respectivamente, y el ORF Lferr_0145 para una recombinasa tal vez relacionada con este elemento de inserción. En total, encontramos 10 de estos elementos representativos de la movilidad genética. En esta región también se encuentran una serie de componentes relacionados con la conjugación y que pertenecen al sistema de secreción tipo cuatro (SST4), cuales son Lferr_0242, Lferr_0244, Lferr_0245, Lferr_0246, Lferr_0247, Lferr_0249, Lferr_0251, Lferr_0256, Lferr_0257, Lferr_0258, Lferr_0259, Lferr_0261, Lferr_0262, Lferr_0264, Lferr_0272, Lferr_0273, Lferr_0276, Lferr_0279, Lferr_0283 y Lferr_0293 (un gen de transcriptasa reversa), sumando un total de 20 genes relacionados al SST4. Por otra parte, es posible encontrar una serie de ORFs relacionados con la resistencia a metales como el mercurio, arsénico, cadmio, cobre y otros. Existen 10 elementos relacionados a la regulación transcripcional de los cuales dos 26

pertenecen a la familia MerR (Lferr_0159 y Lferr_0164) y tres a la familia ArsR (Lferr_0187, Lferr_0191 y Lferr_0208). Hay otros 18 genes implicados en la resistencia, como lo son Lferr_0160 y Lferr_0163 de la familia MerC. En el caso del Cu es posible encontrar un gen que codifica para una ATPasa de Cu (Lferr_0167), un sistema de eflujo tipo Cus (Lferr_0170, Lferr_0171, Lferr_0172 y Lferr_0174), una chaperona de Cu tipo CusF (Lferr_0199) y una ATPasa de eflujo de metales (Lferr_0186) (Orellana y Jerez, 2011). También es posible encontrar una ATPasa tipo P (Lferr_0209) que posiblemente está relacionada con Cd/Zn/Pb/Hg pues su sitio de traslocación CPCALVIS ha sido descrito para el transporte de Cd2+, Zn2+, Pb2+ y Hg2+. Dadas estas propiedades donde se ve claramente la sobre-representación de elementos móviles y otros relacionados a la resistencia a metales, sumado a 77 ORFs cuya función no se ha podido definir con certeza y solo alcanzan la denominación de “Proteínas Hipotéticas”

y el gran

tamaño de esta zona genómica exclusiva de A. ferrooxidans ATCC 53993 (160 kb) es posible referirse entonces a ella como una Isla Genómica propiamente tal.

27

Figura 6. Esquema resumen del análisis bioinformático donde se indican las propiedades básicas de la IG de A. ferrooxidans ATCC 53993. Entre ellas, una longitud de 163.564 pb, conteniendo 169 genes, de inicio en el ORF 128 (ORF 127 es 100% idéntico a AFE_2898 de la cepa ATCC 23270 correspondiente al gen rimo) y de término en el ORF 298 (ORF 299 es 100% idéntico a AFE_2897 de la cepa ATCC 23270 correspondiente al gen nifU). Se indican, también, los genes de resistencia a cobre descritos para A. ferrooxidans ATCC 23270 que se encuentran en el genoma (Navarro y cols., 2009) y en la IG de ATCC 53993 (Orellana y Jerez, 2011). Pequeñas flechas verdes corresponden a elementos de transposición a lo largo de todo el genoma.

28

Figura 7. Detalle de la Isla Genómica. Flechas en azul indican los ORFs que flanquean la IG. Flechas blancas indican los 32 ORFs seleccionados para estudiar resistencia a metales.

29

ii. Crecimiento de A. ferrooxidans ATCC 53993. Según da cuenta la Figura 8, el crecimiento de la bacteria en estudio y bajo las condiciones descritas previamente en Materiales y Métodos llegó a un nivel máximo del orden de 108 cél/mL a partir del orden de 106 cél/mL con una tasa media de crecimiento generacional de 10,17 hrs.

Figura 8. Curva de crecimiento de A. ferrooxidans ATCC 53993 en presencia o ausencia de metales.

Queda claro el efecto del cadmio sobre el crecimiento bacteriano, puesto que su máximo apenas llegó a 1,05*108 cél/mL a pesar de haber sido adaptada a la concentración de 100 mM durante sucesivos sub-cultivos y su tasa media de crecimiento generacional fue de 20,71 hrs. No obstante, se logró obtener cultivos con la suficiente cantidad de bacterias y en un mismo lapso de tiempo para poder realizar las extracciones de RNA necesarias. Contrario a lo observado en presencia de cadmio, todos los otros metales ensayados y doblemente concentrados tuvieron un efecto positivo sobre el crecimiento bacteriano. Todos los recuentos celulares fueron mayores que la condición control desde un principio y se mantuvieron así hasta el final. Mientras el máximo alcanzado para la condición control fue de 2,35*108 30

cél/mL, para níquel fue de 4,05*108 cél/mL, para zinc fue de 3,05*108 cél/mL y para cobre fue de 3,28*108 cél/mL. La tasa promedio de crecimiento generacional para las células control fue de 8,73 hrs mientras que para las células en presencia de níquel fue de 8,04 hrs. Tanto la condición en zinc como en cobre presentan tasas de crecimiento menores, correspondientes a 13,47 hrs y 11,83 hrs, respectivamente. iii. Obtención del material genético. 1. Productos de PCR. Tras definir los parámetros de selección para escoger los genes a estudiar se procedió a su amplificación, separación por electroforesis, visualización y purificación desde el gel de agarosa a partir de un cultivo control de A. ferrooxidans ATCC 53993. La Figura 9 muestra los 41 productos de PCR analizados en este trabajo.

A

B Figura 9. Productos de PCR. A. Imagen de un gel de agarosa al 1% que muestra 38 productos de PCR purificados. Los carriles corresponden, del 1 al 32, a los siguientes ORFs: 1, ORF_225 (611 pb); 2, ORF_224 (201 pb); 3, ORF_223 (257 pb); 4, ORF_220 (295 pb); 5, ORF_219 (294 pb); 6, ORF_218 (214 pb); 7, ORF_217 (271 pb); 8, ORF_215 (610 pb); 9, ORF_214 (283 pb); 10, ORF_211 (220 pb); 11, ORF_204 (254 pb); 12, ORF_198 (276 pb); 13, ORF_197 (201 pb); 14, ORF_194 (349 pb); 15, ORF_193 (469 pb); 16, ORF_192 (217 pb); 17, ORF_190 (563 pb); 18, ORF_184 (604 pb); 19, ORF_182 (206 pb); 20, ORF_179 (200 pb); 21, ORF_158 (241 pb); 22, ORF_155 (580 pb); 23, ORF_153 (608 pb); 24, ORF_152 (592 pb); 25, ORF_151 (529 pb); 26, ORF_148 (232 pb); 27, ORF_147 (598 pb); 28, ORF_146 (300 pb); 29, ORF_142 (606 pb); 30, ORF_141 (596 pb); 31, ORF_129 (237 pb); 32, ORF_128 (605 pb). Entre los carriles 33 y 38 están los productos de PCR correspondientes a los siguientes

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genes: 33, Spike (600 pb); 34, Rus (561 pb); 35, GroEL (656 pb); 36, DnaK (655 pb); 37, RibS (484 pb); 38, RunX2 (289 pb). B. Gel de agarosa al 1% que muestra los productos de PCR correspondientes a CopA (300 pb), CusC (400 pb) y CusF (200 pb).

Del total de los 41 genes, 39 correspondían a A. ferrooxidans ATCC 53993. El gen runx2 cumplió la función de gen exógeno usado como control negativo de hibridación y el gen exp-1 cumplió con la función de gen normalizador en los ensayos de macro-arreglos. Otros 7 genes se amplificaron y purificaron con el fin de ser utilizados a modo referencial en estos ensayos. En esta categoría se encuentran Rus, GroEL, DnaK, RibS, CopA, CusC y CusF. De ahí que sean exclusivamente 32 los genes de la isla genómica seleccionados para medir su expresión relativa. Para su selección, se procedió a la comparación gen por gen entre ambas cepas de A. ferrooxidans, de modo tal que los genes seleccionados sólo correspondieran a ATCC 53993 y que además cada gen no tuviera repeticiones fuera de la IG. Es así como el criterio que marcó la diferencia fue que el grado de identidad entre los genes de ambas cepas no superara el 60%, considerando además un “E value” > e-10 y un “score” < 1000. De los genes seleccionados, 21 correspondieron a proteínas hipotéticas o de función desconocida según la anotación de la base de datos del Doe Joint Genome Institute (Lferr_0129, Lferr_0141, Lferr_0142, Lferr_0146, Lferr_0148, Lferr_0151, Lferr_0158, Lferr_0179, Lferr_0184, Lferr_0192, Lferr_0194, Lferr_0197, Lferr_0198, Lferr_0211, Lferr_0217, Lferr_0218, Lferr_0219, Lferr_0220, Lferr_0223, Lferr_0224, Lferr_0225). El primer ORF de la IG, Lferr_0128, también respondió a la categoría de proteína hipotética, pero fue anotado como una proteína con dominio serina resolvasa. Lferr_0147 fue caracterizado como un regulador transcripcional de la familia TetR, mientras que Lferr_0152 como una amino-oxidasa; Lferr_0153 fue anotada como una epimerasa/dehidratasa dependiente de NAD mientras que Lferr_0155 como una proteína de la familia MgtC. Lferr_0182 resultó ser otro regulador transcripcional, pero de la familia XRE, descrito como una proteína pequeña conservada no caracterizada. Lferr_0190 fue anotada como una proteína tipo Glutarredoxina 2, con implicancia en modificaciones post-traduccionales. De las 3 metiltrasnferasas presentes en la IG sólo una, Lferr_0193, cumplió con los criterios para ser tomada en cuenta en este estudio. Se anotó a Lferr_0204 como una proteína con función desconocida relacionada a la familia de las permeasas tipo FtsX, las cuales transportan lípidos hacia la membrana externa a través de la membrana interna. La anotación correspondiente a Lferr_0214 se relacionó con una posible actividad oxidasa de piridoxina mientras que Lferr_0215 fue anotada como un péptido con región catalítica integrasa con características de transposasa. 32

2. RNA de A. ferrooxidans ATCC 53993. En la Figura 10 se muestra un claro ejemplo del estándar de RNA extraído y tratado en cada una de las muestras biológicas que fueron necesarias para la realización de esta tesis. Por lo general, la concentración de RNA alcanzada en cada extracción post-DNasa no superó los 500 ng/µL a partir de 150 mL de cultivo y la relación Abs260/Abs280 siempre fue mayor a 1,6. 1 23S 16S

2

3

4

[RNA] (ng/µL) Abs 260 nm Abs 280 nm Abs260/Abs280

1 285,9 0,357 0,164 2,18

2 289,5 0,362 0,169 2,146

3 504,1 0,63 0,291 2,168

4 381,7 0,477 0,22 2,165

1

2

3

4

5S

A

B

Figura 10. RNA de A. ferrooxidans. A. Electroforesis en gel de agarosa 1% de 4 muestras de RNA post-tratamiento con DNasa. B. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de PCRs a las 4 muestras de RNA post-tratamiento con DNasa.

Entonces, mientras la Figura 10.A indica la integridad del RNA dada la nítida separación de sus sub-unidades, la Figura 10.B indica la calidad de las muestras de RNA utilizadas en los estudios de transcripción. Esto último, ya que en la Figura 10.B se evidencia la ausencia de DNA contaminando el RNA post-DNasa.

33

3. mRNA de exp-1. Se obtuvo el mRNA de exp-1 a partir del plasmidio pGEM-Teasy/exp-1 y del proceso de transcripción in vitro según se indicó en Materiales y Métodos. Del procedimiento de extracción y purificación del plasmidio se logró obtener una concentración de 103 ng/µL, la cual se redujo a 20,0 ng/µL luego de linealizarlo con la enzima de restricción SalI (Figura 11.A). Utilizando 600 ng de este templado, se procedió a la transcripción in vitro obteniendo como resultado 20 µL de mRNA a una concentración de 48,0 ng/µL (Figura 11.B) que posteriormente fue alicuotado en tubos Eppendorff a 6 ng/µL para su posterior utilización.

A

B

Figura 11. mRNA de exp-1. A. Separación electroforética en gel de agarosa al 0,7% del fragmento que contiene clonado el gen exp-1 en el plasmidio pGEM-T easy tanto en su forma digerida con la enzima de restricción SalI como en su forma no digerida. B. Separación electroforética del transcrito del gen exp-1 obtenido in-vitro.

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iv. Macro-arreglos de DNA. La Figura 12 muestra la disposición utilizada para la siembra de los 41 productos de PCR amplificados más la siembra de DMSO, mientras la Figura 13 muestra un par de membranas, Control y Níquel, post-exposición y revelado, siguiendo la disposición descrita.

Figura 12. Diagrama de la disposición de los productos de PCR sembrados en una membrana de nylon. Entre las filas 1 y 8 y entre las filas 9 y 16 se hibridó, como duplicado técnico, las mismas muestras biológicas.

Figura 13. Imagen representativa del resultado de la hibridización de dos membranas de nylon. A la izquierda se ve el resultado de una muestra Control y a la derecha, de una muestra en presencia de Níquel.

Las imágenes de la Figura 13 se sometieron a cuantificación utilizando el programa VersArray (Bio-Rad) en las instalaciones del INTA. Luego del tratamiento de datos descrito en Materiales y Métodos se logró obtener la gráfica de la Figura 14, donde se plasma la cantidad de veces de expresión de cada gen seleccionado en cada condición de crecimiento ensayada, relativa 35

a la condición de crecimiento control y normalizada para la expresión del gen exógeno exp-1 (Sp).

Figura 14. Veces de expresión relativa. Gráfico representativo del resultado de la expresión relativa de cada gen en cada condición de estudio versus la condición control obtenida a partir de los ensayos de macro-arreglos.

Como era de esperarse, ni RX7 ni DMSO presentan algún tipo de expresión, validando la técnica propiamente tal. Así también, es interesante notar que Rus es el gen que presenta mayor expresión de sus niveles relativos en presencia de cobre (73 veces) haciendo que la escala se distorsione y más aún, que sea el único gen que presente niveles de expresión importantes frente a la presencia de todos los metales aquí ensayados. Salvo CopA que sí fue detectado en cada una de las condiciones ensayadas, tanto CusC como CusF no se detectaron en la condición control así como cada uno de los spots que no presentan barras de magnitud de veces de expresión relativa, haciendo imposible cuantificar la variación de su expresión. Por otra parte, tanto RibS, GroEL y DnaK presentan sobre-expresión en presencia de cobre alrededor de 10 veces, mientras que solo estos dos últimos también se sobre-expresan en presencia de zinc (26,6 y 12,3 veces, respectivamente) y de níquel (5 y 1,1 36

veces, respectivamente). En cadmio GroEL también se ve favorecido, esta vez en 1,8 veces, siendo entonces junto a Rus los únicos genes que responden a los 4 metales estudiados. De los genes seleccionados de la isla genómica, solo 5 presentan algún tipo de sobreexpresión, ya sea frente a la acción de uno o dos metales, preferentemente cobre y zinc. Así es el caso de los genes correspondientes a Lferr_0192, Lferr_0194, Lferr_0198 y Lferr_0219, donde se dan niveles relativos de expresión entre 2 y 10 veces para uno u otro metal, mientras que el gen correspondiente a Lferr_0211 sólo se ve sobre-expresado frente al cadmio en 5,2 veces y con un nivel de expresión relativo cercano a 0,3 veces frente a níquel, pero sin poder ser detectado tanto en cobre como en zinc. Cabe destacar que estos 5 genes han sido anotados como “Proteínas Hipotéticas” en la base de datos aquí utilizada. v. Ensayo de co-transcripción. Para complementar los resultados de los macro-arreglos resultó interesante estudiar un poco más detalladamente el comportamiento concreto de Lferr_0211, puesto que presentó la respuesta más específica en su nivel de expresión al verse ésta aumentada sólo en presencia de cadmio y al percatarnos de su pertenencia a un contexto genómico interesante, tal como lo muestra la Figura 15.A.

A B

Figura 15. Esquema ensayo de co-transcripción. A. Esquema que grafica los ORFs 208 a 211, su disposición y los partidores específicos diseñados para los ensayos de co-transcripción. B. Separación electroforética en gel de agarosa al 1% de los productos de PCR empleando los 4 pares de partidores a 3 temperaturas de anillamiento diferentes: 59 ºC, 63 ºC y 65 ºC.

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En detalle, el contexto genómico en cuestión comprende desde Lferr_0208 a Lferr_0211, pudiendo corresponder a una única unidad transcripcional. Lferr_0208 fue anotado como una proteína de unión a DNA con un dominio tipo HTH (del inglés helix-turn-helix) ArsR presente en los reguladores transcripcionales de la familia arsR/smtB. Los represores de operones de resistencia a metales que actúan sobre ArsR/smtB se unen específicamente al promotor y en presencia del ión metálico se disociarían del DNA, permitiendo la transcripción de las proteínas involucradas en el eflujo del metal y/o su destoxificación. Se sabe además que este tipo de proteínas pueden contener uno o dos sitios de unión a metales; uno de ellos permitiría la unión a cadmio, plomo y bismuto, mientras el otro interaccionaría preferentemente con metales más esenciales como níquel, zinc y cobalto. Lferr_0209 correspondería a una ATPasa tipo P translocadora de metales pesados como Cd/Co/Zn/Pb/Hg, mientras que Lferr_0210 se anotó como una proteína conservada pero de función desconocida al igual que Lferr_0211, pero posiblemente de membrana. Entonces, establecido el contexto y visualizada la expresión de Lferr_0211, se procedió a la realización de ensayos de co-transcripción para determinar si Lferr_0208-Lferr_0211 correspondía a un posible operón. Se sintetizaron partidores específicos tal como muestra la Tabla 4 y se verificaron sus productos de PCR como se muestra en la Figura 15.B, ensayando 3 temperaturas de anillamiento diferentes, obteniendo resultados positivos para cada una de ellas. Posteriormente se realizó la síntesis de cDNA a partir del RNA extraído de cada una de las condiciones de crecimiento y se verificó la presencia y calidad del cDNA mediante PCR utilizando el par de partidores pertenecientes a Lferr_0209, obteniendo resultados positivos para cada una de las muestras ensayadas (Figura 16.A). Luego se llevó a cabo la reacción de PCR al cDNA utilizando el par de partidores Lferr_0211_RV/Lferr_0210_FW y el par de partidores Lferr_0211_RV/Lferr_0208_FW obteniendo resultados dispares (Figuras 16.B y 16.C). El producto de PCR 211/210 de 661 pb dio positivo tanto en la condición control como en la condición con cadmio, sugiriendo que sí hay cotranscripción de estos dos genes contiguos, pero la pareja formada por 211/208 de 2994 pb dio como resultado un bandeo inespecífico de amplificación, inclusive en la reacción correspondiente al control positivo (DNA +), lo cual da cuenta de la dificultad para generar un amplicón de tan largas dimensiones bajo las condiciones experimentales utilizadas.

38

A

B

C

Figura 16. Ensayo de co-transcripción. A. Electroforesis en gel de agarosa al 1% que muestra la separación de los productos de PCR realizado a muestras de cDNA sintetizadas para evaluar su integridad e idoneidad para los ensayos de co-transcripción. Se utiliza DNA de la condición control a modo de control positivo y RNA no retro transcrito a modo de control negativo. Cada PCR se realizó para muestras conteniendo cDNA (+) de cada condición como para muestras que no contuvieran cDNA (-) utilizando el par de partidores correspondientes a Lferr_0209 y Tm de 63 ºC. B. Electroforesis en gel de agarosa al 0,9% que muestra el resultado de un PCR de co-transcripción realizado a la condición control (C) y cadmio (Cd) utilizando los partidores Lferr_0211Rv y Lferr_0210Fw con DNA como control positivo y RNA no retro transcrito como control negativo. Se realizaron 35 ciclos, se utilizó DMSO, 1 mM Mg, Tm de 65 ºC y 40 s de extensión. C. Gel agarosa 0,7% que muestra el resultado de un PCR de co-transcripción utilizando los partidores Lferr_0211Rv y Lferr_0208Fw. Se realizaron 35 ciclos, se utilizó DMSO, 2,5 mM Mg, Tm 60 ºC y 3 min de extensión.

39

vi. Ensayo funcional. Ya que Lferr_0209 representaba la mayor fuerza de este operón putativo, se decidió medir su funcionalidad predicha mediante su complementación heteróloga en cepas de E. coli quimiocompetentes y mediante la utilización de sensi-discos que permitieron realizar ensayos de halos de inhibición en placas de crecimiento. El resultado esperado se correspondió con el resultado obtenido (Figura 17), puesto que el área de inhibición de crecimiento en la cepa Control una vez sometida a los 15 µL de una solución de cadmio 1 M tuvo un valor de 12,79 ± 0,97 cm2 mientras que la inhibición del crecimiento de la cepa complementada con Lferr_0209 alrededor del sensi-disco solo alcanzó un valor de 5,23 ± 0,25 cm2, demostrando que la complementación fue exitosa así como también que el gen complementado le otorgó a E. coli la capacidad de resistir una elevada concentración de cadmio en su medio de crecimiento.

Figura 17. Ensayo funcional. Gráfico del Halo de Inhibición sobre E. coli producido por el efecto del cadmio en una cepa Control versus una cepa clonada con Lferr_0209.

40

IX.

DISCUSIÓN La presente tesis de pregrado tuvo como objetivo principal caracterizar los patrones de

expresión de ORFs encontrados en una región genómica exclusiva de A. ferrooxidans ATCC 53993 y potencialmente relacionados con la resistencia a metales pesados. Específicamente se trabajó con cobre, níquel, zinc y cadmio puesto que resultaba interesante medir sus efectos sobre el crecimiento bacteriano dado que algunos de estos son elementos considerados de importancia biológica y otros como el cadmio son altamente tóxicos y contaminan el ambiente. En las pilas, botaderos y tanques de tratamiento biomineros se alcanzan concentraciones entre 2-19 g/L Cu, entre 2-25 g/L Ni, hasta 65 g/L Zn, hasta 14 g/L As y entre 20-40 g/L Fe (Watkin y cols., 2009). En A. ferrooxidans ATCC 53993 fue posible evidenciar que la zona genómica exclusiva de esta cepa corresponde a una Isla Genómica propiamente tal pues posee las características necesarias para ser así definida. Entre ellas, un tamaño de 160 Kb, una recombinasa al inicio y contigua a un gen relacionado con el metabolismo de los tRNA, un menor porcentaje G:C respecto al genoma completo, la presencia de múltiples elementos de inserción (secuencias de inserción, transposones y elementos externos), componentes de un sistema de secreción tipo 4, la existencia de una serie de genes relacionados con la resistencia a metales pesados y la presencia de 77 genes codificantes de proteínas con función desconocida (Langille y cols., 2010), pudiendo entonces englobarla dentro de la definición de IG de Resistencia. Se estableció un filtro de selección de genes (< 60% ID) para este estudio que resultó ser inclusive más estricto que lo reportado en otros estudios (< 75% ID, Liu y cols., 2003) y que se basó principalmente en la presencia única de los genes dentro de la IG de A. ferrooxidans ATCC 53993, de tal manera de poder atribuirles a ellos un alto nivel de importancia en la resistencia frente a metales pesados y gracias a esto poder diferenciarse cuantitativamente de la cepa ATCC 23270. Interesante resultó el inesperado comportamiento del crecimiento bacteriano de A. ferrooxidans ATCC 53993 expuesto a elevadas concentraciones de metal. Por una parte se aprecia el crecimiento primero pausado y después potenciado de la condición control libre de metales pesados, un crecimiento típico bacteriano, un crecimiento esperado, mientras que por otro lado apreciamos el efecto negativo del cadmio sobre el cultivo bacteriano. A pesar de que la condición con 100 mM de cadmio fue inoculada con una mayor cantidad de células en comparación a la condición control, en su fase exponencial tardía el número de células alcanzado 41

llegó por debajo de la condición control, esto es: 1,05*108 cél/mL versus 2,35*108 cél/mL, respectivamente. Se refuerza esta afirmación mediante la comparación de la tasa media de crecimiento generacional, siendo este valor, para cadmio, 2,37 veces superior a la tasa media de crecimiento generacional de las células control. Dicho de otra forma, a las células en cadmio le cuesta 2,37 veces más realizar un aumento de su duplicación bacteriana respecto al control. Contrariamente a la situación del cadmio, el níquel se aprecia que provoca en las células un potenciamiento del crecimiento. Níquel 200 mM y Control se inocularon en el orden 1*106 cél/mL. Mientras Níquel llegó a un nivel máximo de 4,05*108 cél/mL, las células control, como ya se mencionó, llegaron a 2,35*108 cél/mL e inclusive si comparamos su tasa promedio de crecimiento generacional de 8,73 hrs que es mayor a la de níquel (8,04 hrs) podemos dar respuesta al comportamiento del gráfico otorgándole al níquel una propiedad importante para el crecimiento de esta bacteria. Con propiedad se puede afirmar que el níquel, entonces, sirve como un elemento traza a considerar para optimizar el crecimiento celular de A. ferrooxidans ATCC 53993. Por último, señalar que las células crecidas tanto en cobre como en zinc 200 mM, a pesar de alcanzar un mayor número de células que la condición control, también fueron inoculadas inicialmente a una mayor concentración y además presentan valores de crecimiento generacional mayores a la condición control. Esto, sumado al comportamiento sigmoídeo de las curvas que describen el crecimiento en estas condiciones de metales pesados, crecimiento regular similar a la curva de la condición control, se desprende que tanto cobre como zinc no estarían afectando notoriamente el crecimiento bacteriano. Si bien el resultado de los macro-arreglos no pudo entregar resultados decidores debido a la naturaleza hipotética de los genes sobre-expresados, sí nos dijo que existen genes no caracterizados que cumplen algún tipo de función en los mecanismos de resistencia (cobre, zinc y cadmio, en este caso, específicamente) y por lo tanto no es ilógico suponer que la sobrevivencia en un medio inhóspito como al que son expuestos estos microorganismos se debe a una suma de factores desde la ya conocida especificidad de proteínas por ciertos metales; la suma de repeticiones presentes en un genoma para codificar mayor cantidad de proteínas que cumplan una misma función (ATPasas y chaperonas presentes en la IG y en el genoma); el mecanismo por el cual estas proteínas destoxifiquen la célula, siendo unos más eficientes que otros y actuando en distintos tiempos y concentraciones de toxicidad; y, como se sugiere aquí, debido a la variedad de proteínas que actúen en el proceso. O sea, tanto Lferr_0192, Lferr_0194, Lferr_0198 como 42

Lferr_0219 estarían ayudando de cierta forma a que A. ferrooxidans ATCC 53993 resistiera mayores concentraciones de cobre y de zinc en comparación a otros microorganismo que carecen de estos genes, como es el caso de A. ferrooxidans ATCC 23270. Así mismo, Lferr_0211 tendría un papel importante para proteger al microorganismo del efecto dañino del cadmio. Por lo tanto, nuestros resultados permitirían que estos ORFs anotados como “Proteínas Hipotéticas” sean reanotados como “Proteínas que responden a metales”. Por otra parte, se vio que Lferr_0211 podría formar parte de un operón y a pesar de no visualizar la co-transcripción completa, pero sí parcial entre Lferr_0210/Lferr_0211 y no existiendo un promotor en Lferr_0209, ni Lferr_0210, ni Lferr_0211 y dada la disposición espacial de estos 3 elementos más la presencia de Lferr_0208 como regulador transcripcional adyacente a ellos, se sugiere fuertemente que estos 4 elementos sí estén formando una única unidad transcripcional que responde a la presencia de cadmio. Importante es señalar que en esta etapa de la experimentación se trabajó mediante la complementación heteróloga en E. coli, un microorganismo neutrófilo, con la ATPasa Lferr_0209 de A. ferrooxidans ATCC 53993, un microorganismo acidófilo. El resultado de tal complementación sustenta la funcionalidad resistente a cadmio de este gen, y por añadidura sustenta la funcionalidad del aquí fuertemente sugerido operón del cual forma parte. A pesar de las diferencias de pH de los ambientes en los que se desenvuelven estos microorganismos, siendo el microorganismo neutrófilo un organismo que habita en ambientes con valores de pH cercano a 7,5 y el acidófilo en pH 1,5, la funcionalidad de la proteína en cuestión no se ve afectada, puesto que al localizarse en la membrana interna, transversal a ella, su cara citoplasmática, intracelular, se expone a valores similares de pH en estas células, siendo 7,5 y 6,5 para neutrófilas y acidófilas, respectivamente. Como se ha reportado en estudios anteriores (Chi y cols., 2007), hay un alto porcentaje de proteínas básicas en el periplasma de las bacterias acidófilas: un 16,8% de las proteínas con un punto isoeléctrico (pI) mayor a 10, entre ellas, proteínas ATPasas de cobre; en el global, un 75% con pI > 7 y un 25% con pI < 7. Por tanto, a pesar de registrar en el periplasma valores de pH alrededor de 2,5 a 3, dada esta alta población de proteínas con punto isoeléctrico alcalino, el flujo de protones a través del periplasma puede verse dificultado y más aún, detalladamente regulado junto con la maquinaria de homeostasis involucrando la fuerza protón motriz, notablemente exacerbada en los microorganismos acidófilos (Krulwich y cols., 2011).

43

X.

CONCLUSIONES

 Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 53993 presenta una Isla Genómica de Resistencia de 160 Kb entre los ORFs 128 y 298, inclusive.  Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 53993 posee genes no caracterizados como resistentes a metales pesados en la Isla Genómica de Resistencia (ORFs 192, 194, 198, 211, 219).  Este microorganismo es capaz de crecer a concentraciones elevadas de metal de hasta 200 mM de cobre, níquel o zinc, o 100 mM de cadmio.  Rusticianina es una proteína con especificidad por cobre, que lo une para su función biológica, pero muestra cambios notables de su expresión transcripcional en células crecidas en cadmio, níquel y zinc, sugiriendo que su expresión se regula por la presencia de varios metales en A. ferrooxidans.  Lferr_209 (operón 208-211) le confiere a E. coli mayor capacidad de resistencia al cadmio y, por consiguiente, también a A. ferrooxidans ATCC 53993.

44

XI.

BIBLIOGRAFÍA

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45

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47

XII.

MATERIAL SUPLEMENTARIO Tabla S1. Detalle de la Isla Genómica de A. ferrooxidans ATCC 53993. Proteína Repetida c

ORF

BP

Anotada como:

Aác.

Identidad con ATCC 23270

ATCC 23270

ATCC 53993

R

127

MiaB-like tRNA modifying enzyme YliG 1329 - Ribosomal protein S12 methylthiotransferase rimO

442

100%

AFE_2898

>>INICIO>>FIN 85%; E value < e-10; Score > 1000; misma proteína. c: 85% > ID > 60%; E value < e-10; misma proteína. *: No cumplen con uno de los criterios, pero tienen la misma caracterización. **: No cumplen con ninguno de los 2 criterios, pero tienen la misma caracterización. 1: A reverse transcriptase gene is usually indicative of a mobile element such as a retrotransposon or retrovirus. Reverse transcriptases occur in a variety of mobile elements, including retrotransposons, retroviruses, group II introns, bacterial msDNAs, hepadnaviruses, and caulimoviruses. 2: Type IV secretion systems are found in Gram-negative pathogens. They export proteins, DNA, or complexes in different systems and are related to plasmid conjugation systems.

56

Tabla S2. Detalle de los partidores utilizados. Nombre de la

Secuencia 5' a 3'

Tm (ºC)

Largo (pb)

225 RV

CGGATCTGGCTGCATACG

62.2

18

225 FW

GGCCGGACGGTAACATTG

62.2

18

224 RV

AGAATCCGGCCAAAGCAG

59.9

18

224 FW

GGCGTTACTTGCCAATCG

59.9

18

223 RV

TCAACCCAGAAGGCGTAG

59.9

18

223 FW

GATCACAGGCCATTGGAG

59.9

18

220 RV

TACTTGTGCGGGAAGTGC

59.9

18

220 FW

TGGCGATCACCGTCAATC

59.9

18

219 RV

CCCGCGAATCAGAAACAG

59.9

18

219 FW

AGCATGGGTGCATCACAG

59.9

18

218 RV

TATGGATGGGGCGGATAG

59.9

18

218 FW

CAGTCCTGAGCGGTTGTG

62.2

18

217 RV

GCTTCGGCAGTGGATTTG

59.9

18

217 FW

GTGCCTGGAATACGGAAG

59.9

18

215 RV

ATGCTGGATCGCATTCTC

57.6

18

215 FW

CTCGACCCGTCAAATTCC

59.9

18

214 RV

CATAACGCAGGGCGAGAG

62.2

18

214 FW

GACAAGTGTGGCCGATGC

62.2

18

211 RV

TTCAAGTCGTCGCGTTTC

57.6

18

211 FW

AATACGGAATGGGTTGGG

57.6

18

204 RV

GACATAACGCATGGCCTC

59.9

18

204 FW

TGGAGTCGGGCTTGTACG

62.2

18

198 RV

ATGATCCAACCCGTGCGA

59.9

18

198 FW

ACCCAATGCAGAAAGGGC

59.9

18

197 RV

GCGCGAATACTTTGGTTTG

58.0

19

197 FW

GAAACTACTCGACGTTGTAGCG

62.7

22

194 RV

TCTCTACGATTCCCGCAC

59.9

18

194 FW

ATGGCGATGATGCAGAAG

57.6

18

193 RV

AGTTCGACCACGCGATCC

62.2

18

193 FW

GGGCCTTGGGTGTCAAGC

64.5

18

192 RV

TGGTATTCTTCGCGGGTG

59.9

18

192 FW

GGATAAATAGCGGGTGGG

59.9

18

secuencia

Tm Opt

pb prod

(ºC)

PCR

59

611

57

201

55

257

55

295

57

294

55

214

55

271

55

610

57

283

55

220

58

254

57

276

57

201

57

349

57

469

55

217

57

Nombre de la

Secuencia 5' a 3'

Tm (ºC)

Largo (pb)

190 RV

TACGCATTCAACTCCGGC

59.9

18

190 FW

CGATTGGCATTGGGATAC

57.6

18

184 RV

TTGCAGATAGACCCAGGC

59.9

18

184 FW

GCTTCTGGTATTGCGTGC

59.9

18

182 RV

GCATCCAAGCCGAACAAG

59.9

18

182 FW

CCGTTTGACAGCGTATGG

59.9

18

179 RV

CGCTTCAGGTTTCCTGGG

62.2

18

179 FW

TGAATAAGCTCCTCGTCGC

60.2

19

158 RV

GAATCAATGTGTTGCGCC

57.6

18

158 FW

ACTGTCCAAGCCTCGCTG

62.2

18

155 RV

TGCATTTCCGTTTCGCTC

57.6

18

155 FW

AGGTGCCCAACCTCATTC

59.9

18

153 RV

TCTGGCAATCTGCGTGTG

59.9

18

153 FW

ACGCTTTCTGCCGCTATG

59.9

18

152 RV

CTTCATGGGCCGGTACAC

62.2

18

152 FW

CCGCTATTTCGCCAGTTC

59.9

18

151 RV

AGCGAAGGCAGTGAGGAG

62.2

18

151 FW

GCGTCCATAAGGCCCAAC

62.2

18

148 RV

ATGGCCCTGCTTATGGAC

59.9

18

148 FW

GGTATCTGACCGTTTCGC

59.9

18

147 RV

TGCATTGCCGTAGAAAGC

57.6

18

147 FW

CAGCACCCGATAAGCAAG

59.9

18

146 RV

TGCCAACATGCGATAGAC

57.6

18

146 FW

CTGGATTTGGGATTGAGC

57.6

18

142 RV

TCGGATTCGCTCTGTTTG

57.6

18

142 FW

AATGTGGCTTCATCACCC

57.6

18

141 RV

AGTGGTTGGCTTGCAGAC

59.9

18

141 FW

CGCTTGATGAGCACACAG

59.9

18

129 RV

AGTGCGGTGCAATAGGTG

59.9

18

129 FW

GAGAGCCGACATCAAACG

59.9

18

128 RV

TGCCACAATAGCCACACC

59.9

18

128 FW

CATCAACGCCGGGATTAC

59.9

18

Sp RV

ACAGCATTGCTGGTCACAG

58.0

19

Sp FW

GAGGTGCTTGTGGATATGGAA

52.0

21

secuencia

Tm Opt

pb prod

(ºC)

PCR

55

563

57

604

55

206

57

200

57

241

57

580

57

608

57

592

59

529

57

232

57

598

57

300

57

606

57

596

57

237

57

605

55

600

58

Nombre de la

Secuencia 5' a 3'

Tm (ºC)

Largo (pb)

RunX2 RV

CGCTCCGGCCCACAAATCTC

60.0

20

RunX2 FW

CCGCACGACAACCGCACCAT

60.0

20

DnaK RV

GCACTTCAAACTGGTGTT

52.0

18

DnaK FW

ATGGCTAAAGTGATCGGA

52.0

18

GroEL RV

TAGGGATTCTCCAGTTCG

54.0

18

GroEL FW

ATGCCAGCCAAACAAGTA

52.0

18

Rus RV

CTTGACAACGATCTTACCGAACATA

50.0

25

Rus FW

ATGTATACACAGAACACGATGAAAA

50.0

25

RibS RV

CCCAGCGTTCCAGATAGC

62.2

18

RibS FW

CTCGCAGATGTCGGGTTG

62.2

18

CopA RV

TCTCCGCCTTTTGTCCAGGG

64.5

20

CopA FW

TCAGCATGAGCGGATCGCG

66.6

19

CusC RV

CGCTGACCGTGACTTCCG

64.5

18

CusC FW

CGCAAATCGCGCAGATCC

62.2

18

CusF RV

GCGTGACCCTGGTGATGAC

64.5

19

CusF FW

TGGACAATATGGGCACCGT

60.2

19

secuencia

Tm Opt

pb prod

(ºC)

PCR

60

289

55

655

52

656

52

561

60

484

62

300

62

400

62

200

Tabla S3. Detalle de los partidores de co-transcripción. PARTIDORES CO-TRANSCRIPCIÓN

Lferr_0211_FW Lferr_0211_RV Lferr_0210_FW Lferr_0210_RV Lferr_0209_FW Lferr_0209_RV Lferr_0208_FW Lferr_0208_RV

211_CoTr 210_CoTr 209_CoTr 208_CoTr

Tm ºC

pb

TGGGTTGGGGATGGGGGTGG

64.9

20

ACGCTTCAAGTCGTCGCGTT

59.9

20

GGCAAGGCGGTCGCGTCTAC

63.5

20

GCCGAACCTCACTGGCCAACC

63.4

21

TCGGCAAACGCTACAGCCCG

63.0

20

AAAACTCCCGTCCGCCCACC

62.8

20

TCAGGCCCTTGCCGATCCGA

63.7

20

GCCAGTTCGGGCGTCTGGATG

63.1

21

Tm Opt

pb prod

63

215

Prod CoTr

Prod CoTr

661 pb 63

340 1571 pb

63

2994 pb

495 1597 pb

63

351

Prod CoTr

Prod CoTr

59

SOLUCIONES Medio 9K modificado/Hierro: Compuesto Concentración (g/L) (NH4)2SO4 0,1 MgSO4*7H2O 0,4 K2HPO4*3H2O 0,04 FeSO4*7H2O 33,33 Ajustar pH con H2SO4 (C) a 1,45 -

Autoclavar.

Agarosa: Al 1 % - 1 g. en 100 mL de Buffer TAE (Tris-Acetato-EDTA) 0,5X. Buffer de Sonicación: - Tris-HCl 50 mM - pH 7,35 - 2 mM EDTA PARA RNA/DNA Agua Ácida: - Agua destilada. - Ácido Sulfúrico concentrado hasta pH = 1,45. - Autoclavar. Citrato de Sodio: Para 200 mL necesito - Citrato de sodio (294,1 g/mol) 10 mM  0,5882 g. - Ácido acético glacial hasta pH = 7 (una gota) - Agua bidestilada hasta 200 mL. - Filtrar bajo mechero. Buffer Lisis: Para 200 mL necesito - Acetato de Sodio (82,03 g/mol) 0,02 M  0,3281 g. - EDTA (372,24 g/mol) 1 mM  0,0744 g. - pH 5,5 (ajustar con ácido acético glacial antes de agregar el SDS). - SDS 0,5 %  1 g. - Agua bidestilada hasta 200 mL. Agua DEPC: - Agua bidestilada. - DEPC al 0,1 % v/v. - Agitación toda la noche bajo campana. - Autoclavar al día siguiente. 60

Acetato de sodio: - Agua libre de RNasa. - 3M - pH 5,2 Transcripción Reversa - 0,2 M NaOH (Degradación RNA). Prepararla 0,4 M en 10 mL  0,16 g. - 0,25 M de buffer HEPES (238,3 g/mol) (Neutralización). Prepararla 0,5 M en 5 mL  0,5958 g. RADIACTIVIDAD Nucleótidos de Citosina con fósforo radiactivo ([α32P]dCTP): - 3000 Ci/mmol  10 mCi/mL  necesito 50 µCi  5 µL. o 10 mCi/mL  1 mCi  100 µL o 10 mCi/mL  500 µCi  50 µL o 10 mCi/mL  250 µCi  25 µL o 10 mCi/mL  100 µCi  10 µL PARA MEMBRANAS DE MACROARREGLO Siembra Solución Desnaturación: Para 1 Lt. necesito - NaOH (40 g/mol) 0,5 M  20 g. - NaCl (58,44 g/mol) 1,5 M  87,66 g. Solución Neutralización: Para 2 Lt. necesito - Tris (121,14 g/mol) 0,5 M  121,14 g. - HCl pH 8,0. - NaCl (58,44 g/mol) 1,5 M  175,32 g. - EDTA (372,24 g/mol) 1 mM  0,74448 g. Hibridación SSPE Stock: Solución 10X SSPE (300 mL) - 1,8 M NaCl  31,5576 g. - 100 mM Na2HPO4 (141,96 g/mol) pH 7,7  4,2588 g. - 10 mM EDTA  1,1672 g. Solución Humectación Membranas: 200 mL para las 18 mb - 2X SSPE  40 mL de 10X SSPE.

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Solución Fresca Hibridación (y Pre-Hibridación): Prepararla al momento que se use - 5X SSPE. - 2 % p/v SDS. - 1X solución de Denhardt. - 100 µg/mL de DNA de esperma de salmón. - Conservar a -20 °C. SSC Stock: Solución 20X SSC - 3,0 M NaCl. - 0,3 M citrato trisódico pH 7,0. Solución de Lavado: 200 mL para las 18 mb - 0,5X SSC  5 mL de 20X SSC. - 0,2 % p/v SDS  0,4 g. Solución de Remojo: 100 mL - 0,5X SSC  2,5 mL de 20X SSC.

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PROTOCOLOS EXTRACCIÓN RNA con FENOL ÁCIDO CALIENTE Centrifugación a 6000 rpm durante 15 min. Calentar fenol saturado ácido a 60-65 ºC. A partir de aprox. 10 mg de peso húmedo del pellet (pellet de 100 mL de cultivo). 1. LAVADO DEL PELLET a. Resuspender en 1 mL de agua ácida (H2SO4 pH 1.45). b. Centrifugar durante 3 min a 9000 rpm ó 1 min a 10000xg. c. Repetir pasos a. y b. d. Lavar con 1 mL de NaCit 10 mM pH 7. e. Centrifugar durante 3 min a 9000 rpm ó 1 min a 10000xg. f. Repetir pasos d. y e. 2. LISIS Y OBTENCIÓN RNA (método fenol ácido caliente Guiliani 1997) Usar puntas con filtro y tubos Epp libres de RNasa a. Resuspender en 400 µL buffer lisis con up/down suave y calentar a 70 ºC por 10 mins. b. Añadir 600 µL de fenol ácido previamente calentado a 60 ºC. c. Incubar 7 min a 60 ºC agitando vigorosamente cada 45 s. d. Centrifugar 10 min a 13000 rpm a 4 ºC. e. Recuperar fase acuosa superior (aprox. 400 µL). f. Repetir pasos b., c., d. y e. g. Añadir 600 µL de fenol ácido/cloroformo y agitar. h. Centrifugar 5 min a 13000 rpm a 4 ºC. i. Recuperar fase acuosa superior (aprox. 300 µL). j. Añadir 600 µL de cloroformo y agitar. k. Centrifugar 5 min a 13000 rpm a 4 ºC. l. Recuperar fase acuosa superior (aprox. 200 µL). m. Mezclar muestras compatibles. n. Repetir pasos j., k. y l. o. Añadir 1/10 volumen de acetato de sodio 3M pH 5.2 y con 2-3 volúmenes de etanol al 100%. p. Mezclar vigorosamente y dejar precipitar el RNA a -20 ºC toda la noche o a -80 ºC por 2 h. q. Centrifugar 30 min a 13000 rpm a 4 ºC. r. Lavar 2 veces con 1 mL de etanol al 70% cada vez, centrifugando 10 min a 13000 rpm a 4 ºC. s. Resuspender en 15-20 µL de agua DEPC (libre de nucleasas).

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EXTRACCIÓN RNA con TRIZOL Centrifugación a 6000 rpm durante 15 min. Tubos Epp. de 2 mL (que no tengan tapas rotas). Pellets de, a lo más, 200 mL de cultivo. 1º. 2º. 3º. 4º. 5º. 6º. 7º. 8º.

2 lavados con 1 mL de agua ácida, centrifugando durante 3 min a 9000 rpm ó 1 min a 10000xg. 2 lavados con 1 mL de citrato de sodio 10 mM pH 7, centrifugando durante 3 min a 9000 rpm ó 1 min a 10000xg. Resuspender en 400 µL Buffer Lisis. Dejar 5 min a 65 ºC. Añadir 1 mL Trizol y mezclar pipeteando. Dejar 5 min a 65 ºC. Dejar a Tº ambiente para enfriar. Añadir 200 µL Cloroformo y agitar con la mano 15 seg. Dejar 2 min a Tº ambiente. Centrifugar a 12000xg durante 15 min a 4 ºC.

 Se verán 3 fases: superior acuosa incolora (RNA); interfase capa blanca (proteínas); inferior líquida rosada (fenol-cloroformo).

9º. 10º. 11º. 12º.

Recuperar fase acuosa superior (aprox. 60% del Trizol añadido ~ 750 µL). Añadir 400 µL de Fenol saturado ácido y mezclar por inversión. Centrifugar a 13000 rpm durante 10 min a 4 ºC. Recuperar fase acuosa superior (~ 500 µL).  Opcional: Añadir 400 µL de Fenol-Cloroformo ácido y mezclar por inversión. Luego centrifugar y recuperar la fase acuosa superior.

13º.

Añadir 200 µL de Cloroformo y mezclar por inversión.  Si se hizo una extracción con Fenol-Cloroformo, realizar 2 extracciones con Cloroformo.

14º. 15º. 16º. 17º. 18º. 19º. 20º.

Centrifugar a 13000 rpm durante 10 min a 4 ºC. Recuperar fase acuosa superior (~ 250 µL). Añadir 1/10 volumen de acetato de sodio 3M pH 5.2 y 2-3 volúmenes de etanol al 100%. Mezclar vigorosamente y dejar precipitar el RNA a -20 ºC toda la noche o a -80 ºC por 2 h. Centrifugar durante 30 min a 13000 rpm a 4 ºC. Lavar 2 veces con 1 mL de etanol al 70% cada vez, centrifugando 10 min a 13000 rpm a 4 ºC. Resuspender en 15-30 µL de agua DEPC (libre de nucleasas).

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EXTRACCIÓN DNA GENÓMICO 100 mL de cultivo. Centrifugación a 6000 rpm durante 15 min. 1º. 2º. 3º. 4º. 5º.

2 lavados con 1 mL de agua ácida, centrifugando durante 3 min a 9000 rpm ó 1 min a 10000xg. 2 lavados con 1 mL de citrato de sodio 10 mM pH 7, centrifugando durante 3 min a 9000 rpm ó 1 min a 10000xg. Resuspensión en 400 µL buffer lisis (o ver punto 6 del protocolo Wizard Genomic DNA Purification Kit Cat # A1120, Promega) 10 min a 70 ºC (bloque) y luego enfriar a Tº ambiente. Protocolo extracción DNA de Promega desde punto 8: a. Añadir 3 µL de Solución RNasa al lisado celular. Invertir el tubo 2-5 veces para mezclar. b. Incubar a 37 ºC durante 15-60 min. Enfriar la muestra a Tº ambiente. c. Añadir 200 µL de Solución Precipitación Proteínas al lisado celular tratado con RNasa. Vortex vigoroso a alta velocidad durante 20 seg para mezclar la Solución Precipitación Proteínas con el lisado celular. d. Incubar la muestra en hielo durante 5 mins. e. Centrifugar a 13000-16000xg durante 3 mins. f. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y repetir pasos c., d. y e. g. Transferir el sobrenadante que contiene el DNA a un tubo limpio de 1,5 mL conteniendo 600 µL de isopropanol (2-propanol) a Tº ambiente.  Dejar cierta cantidad de líquido residual en el tubo original que contiene el pellet de proteínas para evitar la contaminación de la solución de DNA con las proteínas precipitadas.

h.

6º. 7º.

Mezclar suavemente por inversión hasta que las hebras de DNA tipo hilo formen una masa visible. i. Centrifugar a 13000-16000xg durante 5 mins. j. Escurrir cuidadosamente el sobrenadante y secar el tubo sobre un papel absorbente limpio. Añadir 600 µL de etanol 70% e invertir suavemente el tubo varias veces para lavar el pellet de DNA. k. Centrifugar a 13000-16000xg durante 5 mins. Aspirar el etanol cuidadosamente. l. Secar el tubo sobre un papel absorbente limpio, dejándolo al aire durante 10-15 mins. m. Añadir 100 µL de Solución Rehidratación DNA al tubo y rehidratar el DNA incubándolo a 65 ºC por 1 hr. Mezclar la solución periódicamente golpeando el tubo suavemente. Como alternativa, se puede rehidratar el DNA incubando la solución durante toda la noche a Tº ambiente o a 4 ºC. n. Guardar el DNA a 2-8 ºC. Calentar tubos eppendorff durante 10 min. Cuantificación.

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ETRACCIÓN DNA PLASMIDIAL (MINIPREP)  Células E.Coli DH5α son endA (-) (gen endA de endonucleasa I está mutado). Endonucleasa I es una proteína periplásmica de 120 kDa que degrada DNA doble hebra. Con células DH5α se mejora la calidad del DNA plasmidial.  Para miniprep lo ideal es tener el cultivo en LB en un recipiente a ¼ de su capacidad como máximo, para permitir una buena aireación, y detener el cultivo a una DO600 entre 2,0 y 3,0 (12-16 hrs a 37 ºC con ~ 30 rpm). o 5-15 mL cultivo  40-75 µg DNA  En 400 µL finales  100-187,5 ng/µL  100 µL de células en 20 mL de LB.  A las 2-3 horas añadir Amp. (1µL/mL).  De las bacterias crecidas, guardar 2 stocks al 50% en glicerol estéril al 100% en tubos Epp estériles en el -80. DIGESTIÓN CON SalI FERMENTAS  Hacer el mix de reacción con Buffer O 10X, DNA plasmidial y la enzima de restricción.  Incubar a 37 ºC por 2 horas para digestión.  Incubar a 65 ºC por 20 min para inactivación de SalI.  Correr los 20 µL de reacción en gel agarosa con el pGEM-T Easy/exp-1 super enrollado (sc).  Cortar banda de interés y hacer extracción del plasmidio lineal con kit de extracción.  Cuantificación. TRANSCRIPCIÓN IN VITRO  Usando las siguientes condiciones se pueden obtener 5-10 µg RNA/µg DNA plasmidial.  A Tº ambiente, en un volumen final de 100 µL en agua libre de nucleasas, añadir 1X Buffer de Transcripción; 10 mM DTT; 100 U Inhibidor de Ribonucleasa Recombinante RNasin; 0,5 mM rATP, rGTP, rCTP y rUTP; 2-5 µg templado de DNA plasmidial lineal; 40 U T7 RNA Polimerasa.  Incubar 1-2 hrs a 37-40 ºC.  Remoción del templado de DNA y precipitación del transcrito:  Añadir DNasa RQ1 libre de RNasa (1 U/µL) a la concentración de 1 U/µg de templado DNA.  Incubar por 15 min a 37 ºC.  Extraer con 1 volumen de fenol saturado ácido (pH 4,7):cloroformo:alcohol isoamílico (125:24:1). Vórtex por 1 min y centrifugar a 12000 xg a 4 ºC durante 2 min.  Transferir la fase acuosa superior a un tubo fresco y añadir 1 volumen de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). Vórtex por 1 min y centrifugar a 12000 xg a 4 ºC durante 2 min.  Transferir la fase acuosa superior a un tubo fresco y añadir 0,5 volúmenes de acetato de amonio 7,5 M y 2,5 volúmenes de etanol 100%. Mezclar y dejar a -20 ºC durante toda la noche ó a -80 ºC durante 2 hrs.  Centrifugar a 12000 xg durante 20 min a 4 ºC.  Remover sobrenadante y lavar pellet con 1 mL de etanol 70%. Secar el pellet con el tubo boca abajo sobre papel absorbente y cubierto.  Remoción de nucleótidos no incorporados:  Resuspender la muestra en 15-20 µL de agua DEPC. 66

 Aplicar la muestra a una columna cromatográfica MicroSpin S-200 HR de General Electric Healthcare.  Recuperar eluato y realizar la precipitación del RNA con acetato y etanol.  Resuspender en 20 µL de agua DEPC.  Cuantificar RNA. TRANSCRIPCIÓN REVERSA Marcaje sondas cDNA radiactivas  Previo a la reacción de transcripción reversa, la mezcla de RNA total y de exp-1 se hibridará con los oligonucleótidos reversos específicos durante 5 min a 70 ºC.  Proceder a la transcripción reversa por 2 h a 42 ºC.  Inactivar la enzima a 65 ºC por 15 min.  Degradar RNA mediante tratamiento con 0,2 M NaOH a 37 ºC por 15 min.  Neutralizar con 0,25 M de buffer HEPES.  Purificar las sondas de cDNA radiactivas usando las columnas S-200 HR (Amersham) según las instrucciones del fabricante.  Cuantificar la radiactividad incorporada en un contador de centelleo. SEMBRADO DE LAS MEMBRANAS DE NYLON  Colocar en una placa para cultivos celulares de 96 pocillos las diluciones de los fragmentos de DNA (5 ng/µL), diluciones de un fragmento del gen heterólogo de expansina-1 (exp-1) de Prunus pérsica (5 ng/µL en un 40% v/v de DMSO) y DMSO al 40% v/v.  Sembrar manualmente en membranas de nylon Inmobilon-Ny+ desde la placa ELISA utilizando el Multi-blot Replicator (V&P Scientific). o Cada dilución se sembrará 3 veces (0,1 µL de cada amplicón ~ 1,5 ng de DNA total) y en cuadruplicado.  Secar las membranas al aire y tratarlas son Solución de Desnaturación (0,5 M NaOH; 1,5 M NaCl) por 7 min sin agitación  Incubar las membranas 2 veces por 3 min en Solución de Neutralización (0,5 M Tris-HCl pH 8,0; 1,5 M NaCl; 1 mM EDTA) con agitación secándolas al aire.  Entrecruzar el DNA a la membrana por irradiación con luz UV (254 nm) a 0,12 J/cm2 durante 2,5 min en un Hibrilinker HL-200 (UVP Laboratory Products).  Las membranas pueden guardarse en papel aluminio a 4 ºC al menos por 5 meses. Hibridación, lavado y exposición de las membranas Se hibridarán dos membranas por cada sonda obtenida (o una membrana con la réplica técnica impresa en ella misma por cada sonda obtenida)  Humedecer las membranas en 2X SSPE durante 5 min a temperatura ambiente.  Pre-hibridar las membranas en 7,5 mL de Solución de Hibridación a 65 ºC por 2 a 4 h.  Desnaturar la sonda de cDNA en agua hirviendo durante 5 min.  Hibridar las membranas durante toda la noche a 65 ºC en 5 mL de solución fresca de hibridación con la sonda de cDNA obtenida.  Lavar las membranas con 25 mL de Solución de Lavado 2 veces a temperatura ambiente durante 5 min.  Lavar las membranas 2 veces a 65 ºC durante 15 min.  Remojar las membranas 2 veces en 0,5X SSC para remover el SDS. 67

 Envolver las membranas en película plástica para exponerlas en una pantalla K-Screen (Kodak) por 1 a 2 días.  Escanearlas en un PhosphorImager (Molecular Imager FX system, Bio-Rad) utilizando el programa Quantity One v.1.0 (Bio-Rad).  Cuantificar y analizar las manchas obtenidas con el programa VersArray (Bio-Rad) y Excel (Microsoft Office).

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