9 a edición del curso de Biotecnología Aplicada a la Salud Humana

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Avances de la terapia génica en el tratamiento de enfermedades monogénicas Juan A. Bueren División de Hematopoyesis y Terapia Génica CIEMAT y CIBER de Enfermedades Raras

Introducción Los avances en el campo de la genética molecular están teniendo una importante repercusión en nuestra capacidad para comprender, diagnosticar y tratar variedad de enfermedades congénitas y adquiridas. Así, la posibilidad de introducir genes en células eucariotas ha permitido comenzar nuevos protocolos de marcado y de terapia génica (TG) humana que no resultaban abordables hace unos pocos años. Tal como se muestra en la figura 1, la TG puede realizarse por medio de dos aproximaciones diferentes. La primera, denominada «terapia génica de adición», se basa en la inserción del gen

terapéutico bajo el control de secuencias promotoras y potenciadoras de la expresión génica; todos los protocolos de TG que actualmente se realizan en la clínica utilizan esta aproximación. La segunda, conocida cómo «terapia de sustitución», tiene por objeto la sustitución del gen afectado por la versión correcta del mismo gen. En ella, el gen introducido se encontraría en su entorno natural y, por tanto, bajo el control de los sistemas fisiológicos que regulan su expresión. Debido la baja eficacia de recombinación homóloga actualmente conseguida en células eucariotas, esta aproximación todavía no se encuentra en fase de aplicación clínica. Desde el punto de vista práctico, la TG puede realizarse tanto in vivo (inoculando el vector de

Terapia de adicción Inserción génica • Alta eficacia de inserción • Inserción génica homo o heteróloga • Limitaciones de regulación Aplicable en terapia humana

Figura 1. Modalidades básicas de terapia génica.

84

9a edición del curso de Biotecnología Aplicada a la Salud Humana

Terapia de sustitución Recombinación homóloga • Baja eficacia de recombinación • Precisa reparación génica • Óptima regulación de expresión No implantado en terapia humana

transferencia en el paciente) como in vitro. En este caso, la transferencia génica se realiza sobre células extraídas del paciente, las cuales, una vez modificadas genéticamente, son reinfundidas en él. En general, los vectores de transferencia génica presentan una eficacia de transducción notablemente superior cuando se utilizan in vitro sobre las células diana a transducir frente a cuando se inoculan in vivo. En una serie de ensayos clínicos, no obstante, se utilizan protocolos de TG in vivo, en los cuales los vectores de transferencia génica se introducen por vía sistémica o en los tejidos del paciente afectados por la enfermedad (fig. 2). La revista Journal of Gene Medicine (http://www. abedia.com/wiley/index.html) ha reportado que hasta junio de 2010 se habían puesto en marcha un total de 1.644 ensayos clínicos de TG. Aunque la mayor parte de estos protocolos han tenido

Terapia génica ex vivo

como objeto el tratamiento del cáncer (64,5%), los resultados más significativos han estado relacionados con el tratamiento de enfermedades monogénicas. Tal como puede observarse en la figura 3, de todos los vectores utilizados, los retrovirales (gammarretrovirales) y los adenovirales son los de uso más frecuente en estos ensayos. No obstante, ya se observa la puesta en marcha de un total de 27 ensayos (1,7% del total) con vectores lentivirales, propuestos como una nueva familia de vectores de mayor seguridad y eficacia respecto a los retrovirales. El fundamento para la utilización de vectores virales es el de aprovechar su gran capacidad infectiva y, en algunos casos, de integrar su genoma en la célula huésped, eliminando su potencial replicativo en la célula infectada (transducida). El virus modificado (vector) sólo será capaz de llevar a cabo un único ciclo de

Terapia génica in vivo

Medidas modificadas genéticamente

Vectores de transferencia génica

Tipos de medicamentos génicos

Figura 2. Modalidades básicas de terapia génica.

Avances de la terapia génica en el tratamiento de enfermedades monogénicas

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Indications addressed by Gene Therapy Clinical Trials

Vectors used in Gene Therapy Clinical Trials Adenovirus 23,8% (n = 400) Retrovirus 20,5% (n = 344) Naked/Plasmid DNA 17,7% (n = 304) Vaccinia virus 7,9% (n = 133) Lipofection 6,5% (n = 109) Poxvirus 5,5% (n = 93) Adeno-associated virus 4,5% (n = 75) Herpes simplex virus 3,3% (n = 56) Lentivirus 1,7% (n = 29) Other categories 4,9% (n = 82) Unknown 3,3% (n = 55)

Cancer diseases 64,5% (n = 1.060) Cardiovascular diseases 8,7% (n = 143) Monogenic diseases 8,2% (n = 134) Infectious diseases 8% (n = 131) Neurological diseases 1,8% (n = 30) Ocular diseases 1,1% (n = 18) Other diseases 2,4% (n = 40) Gene marking 3% (n = 50) Healthy volunteers 2,3% (n = 38)

Figura 3. Distribución de los ensayos clínicos de Terapia Génica por indicaciones y vectores.

Criterios para definir el vector de transferencia a utilizar

infección, lo que le permitirá actuar como vehículo seguro del gen terapéutico. Todos los elementos necesarios para que el vector terapéutico pueda empaquetarse e infectar las células diana son aportados con las denominadas líneas celulares empaquetadoras. En la figura 4 se muestra un ejemplo de cómo modificar un gammarretrovirus para producir un vector gammarretroviral.

El éxito terapéutico de la TG depende fundamentalmente de 3 cuestiones. En primer lugar, resulta necesario insertar eficazmente el trans-

env (SU) LTR

env (TM)

Gag

Pol

Env

LTR

gag (matriz) gag (cápsida) RNA pol

LTR

Ciclo de infección del retrovirus MoMuLV

Generación de células empaquetadoras de vectores terapéuticos Célula productora de vectores retrovirales

Ensamblaje Fusión de membranas ARN ARN ADN

Integración

Citoplasma PROT

LTR

Gen terapéutico

mRNA ARN

Integración

Núcleo

ADNbc

Núcleo ARNm ARNm ARNm

Vector retroviral terapéutico

Figura 4. La Manipulación Genética de los Retrovirus: De virus patogénico a medicamento génico.. 86

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gén terapéutico en las células diana deseadas; por otra parte, también es necesario que el gen se exprese en cantidad suficiente y durante el tiempo suficiente para que se obtenga beneficio clínico, y, por último, como en todo medicamento, la eficacia terapéutica de la TG viene limitada por la relación entre el beneficio clínico que produce y los riesgos que conlleva. En el caso de enfermedades asociadas a defectos monogénicos resulta evidente que la curación de la enfermedad sólo se obtendrá cuando las células de los tejidos afectados tengan acceso permanente a niveles umbrales de la proteína deficitaria. Una de las aproximaciones más directas para lograr este objetivo se fundamenta en la transducción de la población celular afectada, o de sus células progenitoras, con vectores que permitan la integración estable del transgén en el genoma celular. En los protocolos clínicos diseñados al efecto se han utilizado fundamentalmente vectores gammarretrovirales, en particular los derivados del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV). Como ya se ha indicado, los vectores lentivirales constituyen una herramienta de reciente aplicación en el campo de la TG, ya que permiten la integración del transgén en células quiescentes y ofrecen una mayor seguridad en comparación a los vectores gammarretrovirales.

Estudios y ensayos clínicos representativos sobre los beneficios y limitaciones de la terapia génica actual Hasta que los laboratorios de genética molecular ofrezcan alternativas eficaces para el tratamiento de mutaciones dominantes, el tratamiento genético de las enfermedades monogénicas se está centrando en las que están asociadas a mutaciones monogénicas recesivas, en las cuales la expresión de una copia funcional del corres-

pondiente transgén pueda ser suficiente para la curación de la enfermedad. En las patologías en las que no es posible o no es del todo eficaz la administración exógena de la proteína deficitaria, se han planteado alternativas de terapia celular o génica sobre estos pacientes. En la actualidad existen unas 30 enfermedades monogénicas que habitualmente se tratan mediante trasplante de progenitores hematopoyéticos procedentes de donantes histocompatibles sanos. Puesto que en promedio sólo 1 de cada 3 pacientes posee un donante familiar HLA idéntico, y debido a los riesgos asociados al trasplante alogénico a partir de donantes alternativos, se considera una larga serie de enfermedades monogénicas candidatas a ser tratadas mediante TG. A continuación se muestra el fundamento de algunos de los protocolos de TG de enfermedades monogénicas que han sido más relevantes, bien por su eficacia terapéutica, bien por las dudas levantadas respecto a los riesgos que entraña esta nueva alternativa terapéutica.

Inmunodeficiencia ADA Entre las enfermedades que primero se consideraron para su tratamiento génico destacan las inmunodeficiencias severas combinadas asociadas a mutaciones en los genes adenosina deaminasa (ADA-SCID) y gamma-c, asociado a la inmunodeficiencia X1-SCID. La ausencia de ADA implica una acumulación celular del sustrato desoxiadenosina trifosfato, lo cual resulta particularmente tóxico en los linfocitos T (fig. 5).

Adenosina Deoxidante ↑ dATP

Iosina ADA

Deoxiinosa

Figura 5. Esquema del fundamento bioquímico de la inmunodeficiencia severa combinada ADA.

Avances de la terapia génica en el tratamiento de enfermedades monogénicas

87

Ésta fue una de las primeras patologías en ser tratadas mediante TG con vectores retrovirales, primero en el National Institutes of Health (NIH) de Estados Unidos [1, 2], y luego en el Hospital S. Raffaelle de Milán [3-5]. Las alternativas que se consideraron para el tratamiento genético de esta enfermedad tenían por objeto la transferencia del gen ADA en los linfocitos T de los pacientes o en las células madre hematopoyéticas (CMHs). En todos los casos se comprobó la presencia de células corregidas genéticamente en la sangre de los pacientes, aunque tan sólo se obtuvieron modestas evidencias de beneficio clínico. Los mejores resultados se han obtenido recientemente por los grupos de Milán (A. Aiuti) y de Londres (B. Gaspar y A. Thrasher): utilizando un protocolo en donde se retiró la administración de la proteína ADA, los

Acondicionamiento submieloablativo

pacientes se acondicionaron con un tratamiento submieloablativo previo a la perfusión de las células CD34+ transducidas con vectores gammarretrovirales portadores del gen ADA [5, 6]. El esquema básico seguido en estos ensayos clínicos es el que se muestra en la figura 6: se extrajeron células de la médula ósea de los pacientes, se purificaron las células CD34+ y se transdujeron con los vectores terapéuticos; finalmente, la población conteniendo las células corregidas genéticamente fueron perfundidas en los pacientes tras su acondicionamiento con dosis submieloablativas de busulfán (fig. 6). La gran mayoría de estos pacientes mostraron beneficios clínicos incuestionables, sin que en ninguno de ellos se produjeran efectos adversos graves. Este protocolo constituye uno de los ejemplos más significativos de la eficacia y la

Recolección de células de médula ósea

Infusióndel inóculo corregido genéticamente

Selección de células CD34+

Transducción con vectores terapéuticos

Figura 6. Esquema básico del protocolo utilizado para la terapia génica de la inmunodeficiencia ADA-SCID. 88

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IL-7R

IL-4R a

a

γc

JACK3

IL-2R b

γc

J3

γc

J3

a

J3

py-stat

NÚCLEO

Activación génica

Figura 7. Señalización defectiva por receptores de citoquinas en inmunodeficiencia X1-SCID.

Inmunodeficiencia X1-SCID Ésta inmunodeficiencia representa aproximadamente la mitad de todas las inmunodeficiencias graves combinadas y está asociada a un defecto en la cadena γc, una proteína que forma parte de numerosos receptores de interleucinas (fig. 7). La TG de estos pacientes también se ha realizado mediante la transferencia del vector terapéutico a células CD34+, en este caso sobre pacientes que no recibieron acondicionamiento alguno. En el 90% de los pacientes se observó reconstitución del sistema inmunitario con células que contenían el gen terapéutico y una evidente mejoría clínica, que, como en el caso anterior, permitió que los pacientes abandonaran las unidades de aislamiento a las pocas semanas del tratamiento [7]. Se considera que

este protocolo, desarrollado en Francia por A. Fischer y M. Cavazzana-Calvo, es el primer protocolo de TG de una enfermedad monogénica que ha demostrado eficacia terapéutica incuestionable (fig. 8). El equipo de Adrian Thrasher, en Londres, ha obtenido resultados similares en cuanto a la eficacia terapéutica del proceso [8]

9.000

P5

8.000 7.000 Linfocitos T/mcl

seguridad que la TG puede ofrecer a pacientes con enfermedades monogénicas.

6.000 P8

5.000

P7 P4

4.000 3.000

P1

P9

P2

2.000

P6

1.000

P10

0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Meses después de la terapia génica

Figura 8. Rescate de la inmunodeficiencia por terapia génica en inmunodeficiencia SCID-X1.

Avances de la terapia génica en el tratamiento de enfermedades monogénicas

89

¿¿??, pues todos los pacientes pediátricos tratados han mostrado clara mejoría clínica. Como veremos más adelante, 5 de los 15 pacientes X1-SCID tratados por TG desarrollaron leucemia linfocítica como consecuencia de esta intervención terapéutica, si bien 4 de ellos respondieron satisfactoriamente al tratamiento antitumoral. Las causas y consecuencias de este proceso maligno producido como consecuencia del tratamiento con vectores retrovirales se discuten, así mismo, más adelante.

Granulomatosis crónica Constituye otra inmunodeficiencia que ha recibido atención particular para su tratamiento genético. Esta enfermedad se caracteriza por una deficiente respuesta de las células fagocíticas para generar anión superóxido, lo que se manifiesta mediante un síndrome recurrente de infecciones y formación de granulomas (fig. 9). Estudios experimentales sugieren que la corrección genética de, aproximadamente, un 5% de los granulocitos circulantes, será suficiente para reportar un beneficio terapéutico [9]. Los estudios clínicos basados en el trasplante de células CD34+ transducidas con vectores retrovirales y trasplantadas en pacientes no acondicionados, no mostraron beneficio terapéutico. No obstante, un ensayo clínico realizado por Manuel Grez, en Frankfurt, en pacientes que recibieron acondicionamiento mieloablativo, ha mostrado evidente mejora clínica en los 2 pacientes tratados [10]; sin embargo, en este ensayo clínico también se han descrito efectos adversos graves similares a los descritos en pacientes X1-SCID [11].

Hemofilia La hemofilia es una enfermedad ligada al cromosoma X originada por mutaciones en el gen que codifica el factor VIII (hemofilia A) o el factor IX (hemofília B) de la coagulación. A pesar de los avances producidos en la administración intravenosa de estos factores, su corta vida media 90

y elevado coste han incentivado la investigación en el campo de la TG de esta enfermedad. En el tratamiento de la hemofilia A y B se han seguido múltiples enfoques, que incluyen la transducción de fibroblastos con plásmidos portadores del gen del factor VIII truncado, perfusión intravenosa de vectores retro o adenovirales con el gen del factor VIII, o la transducción de músculo esquelético o hígado con vectores AAV portadores del gen del factor VIII y el minigen del factor IX, respectivamente. Ninguno de los protocolos puestos en marcha hasta el momento ha conseguido expresar a largo plazo el factor de coagulación correspondiente a niveles terapéuticos. Trabajos más recientes han conseguido alcanzar niveles del factor de coagulación del orden del 5-25% en perros hemofílicos o primates no humanos, mediante 3 aproximaciones diferentes. En un caso se administró por vía sistémica vectores retrovirales en perros neonatales, en donde los hepatocitos se encontraban con alta tasa proliferativa, y se han utilizado también vectores AAV para transducir músculo esquelético por vía intravascular, o el hígado por vía de la arteria hepática o portal. La administración de vectores AAV al hígado se contempla actualmente como uno de los procedimientos más prometedores para el tratamiento de la hemofília, pues ya se han alcanzado valores de alrededor del 10-12% de los valores normales, aunque la expresión se mantuvo durante semanas, en lugar de años, como fue el caso de perros hemofílicos [12]. La presencia de células CD8+ de memoria contra antígenos de la cápsida viral parece ser la causante de la corta duración en la que se expresó el factor. La inmunosupresión del paciente hasta que la cápsida viral se aclare de sus tejidos, o la utilización de serotipos diferentes de AAV (AAV-8 en lugar de AAV-2), se contemplan como alternativas de interés para mejorar la eficacia clínica del procedimiento.

Hemoglobinopatías De entre ellas, destacan las talasemias y la anemia de células falciformes. Algunos genes de hemoglobinopatías (alpha-thal, beta-thal y HbS)

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causan enfermedad (talasemia alfa, talasemia beta y anemia drepanocítica, respectivamente), pero otros (HbE y HbC) sólo causan manifestaciones clínicas graves cuando se combinan con alguno de los genes del primer grupo. Los niños con talasemia suelen nacer sin manifestaciones clínicas, pero la anemia surge entre los 6 meses y los 2

años de vida. La sustitución de la globina-ß defectiva o ausente en pacientes con talasemia ß, puede ser curativa. Resultados preclínicos recientes del grupo de G. Ferrari muestran la corrección de células humanas de pacientes con talasemia major. La caracterización de células derivadas de la médula ósea de estos pacientes antes después

Figura 9. Fundamentos moleculares de la granulomatosis crónica. Avances de la terapia génica en el tratamiento de enfermedades monogénicas

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de la transferencia del gen terapéutico mostró una elevada eficacia de transducción, restauración de la síntesis de la hemoglobina, rescate de la apoptosis y la corrección de los defectos en eritropoyesis. En general, estos resultados proporcionan un fundamento sólido para una futura traducción clínica de este protocolo de TG [13].

Anemia de Fanconi La anemia de Fanconi (AF) es una enfermedad autosómica recesiva, poco frecuente entre la población pero de muy mal pronóstico. Los pacientes suelen desarrollar anomalías congénitas múltiples (en el 65% de los casos), fallo de médula ósea y predisposición a cáncer. En promedio, la manifestación de la aplasia se observa alrededor de los 8 años de edad, si bien prácticamente todos los pacientes que alcanzan los 40 años muestran fallo de médula ósea. Una de las características de esta enfermedad, que la hace particularmente apropiada para su tratamiento por TG, radica en la ventaja selectiva de las células corregidas genéticamente respecto a las células defectivas en los genes de Fanconi [14]. La AF es consecuencia de mutaciones o deleciones en cualquiera de los 13 genes de AF relacionados con la estabilidad genómica de estas células. Los resultados publicados sobre los ensayos realizados en fase I no manifestaron beneficios terapéuticos evidentes (Liu et al., 1999) [15]. Nuestro equipo de investigación ha publicado recientemente resultados preclínicos que abren nuevas expectativas al tratamiento por TG de esta enfermedad mediante nuevos procedimientos de manipulación celular y nuevos vectores lentivirales, más eficaces y seguros respecto a los utilizados anteriormente [16].

Fibrosis quística El gen de la fibrosis quística (FQ) está localizado en el cromosoma 7 y posee un tamaño de 6,7 kB. En el 75% de los pacientes enfermos de FQ, la enfermedad se produce por un defecto en la posición 508. Como consecuencia de las 92

deficiencias de este gen se produce una alteración física y química de las secreciones de las vías respiratorias y de las enzimas pancreáticas. Debido al defecto en el transporte del cloro entre las células, las mucosidades se hacen muy densas, dificultando la expulsión del moco bronquial y facilitando su infección con patógenos difíciles de eliminar. La TG prioritaria de esta enfermedad radica en la inserción del gen de la FQ en las células respiratorias. Se han desarrollado diversos ensayos clínicos en fase I utilizando fundamentalmente vectores adenovirales y, más recientemente, vectores no virales. Los protocolos con vectores adenovirales han mostrado ventajas respecto a su eficacia de transducción de las células diana; sin embargo, también han puesto de manifiesto su inmunogenicidad, al haberse generado anticuerpos que neutralizaron la eficacia de los vectores. Las formulaciones no virales facilitarán la administración repetida de fármaco genético. En todo caso, estos ensayos clínicos están mostrando mayores complicaciones de la inicialmente previstas.

La seguridad en terapia génica Problemas en el tratamiento de la deficiencia de la ornitín transcarbamilasa Esta es una enfermedad en la que los pacientes carecen de una enzima clave del metabolismo de aminoácidos, la ornitín transcarbamilasa (OTC), lo que da lugar a una acumulación potencialmente fatal de amoniaco en la sangre. Puesto que la actividad OTC está normalmente presente en el hígado, se considera que éste es el tejido diana de vectores que expresen la versión correcta del gen OTC. En virtud de la eficacia de los adenovirus para infectar células hepáticas, se propuso utilizar tales vectores para transducir las células hepáticas de estos pacientes con el gen OTC. Estudios in vitro, y también

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en animales de experimentación, mostraron la eficacia del protocolo propuesto. El tratamiento de 17 pacientes con dosis progresivamente crecientes del vector no manifestó efectos tóxicos graves. No obstante, en 1 de los pacientes tratados con la dosis más alta se manifestó un proceso febril seguido de inflamación hepática y aumento descontrolado de los niveles de amonio, dando lugar a la entrada en coma del paciente. Lamentablemente, el paciente falleció poco después, y está todavía en investigación la causa primaria de su muerte. Este hecho, como consecuencia de la inoculación del vector viral, disparó las alarmas de los organismos reguladores, principalmente en lo que se refiere a la inoculación in vivo de vectores de la familia de los adenovirus. En la actualidad se han generado nuevos vectores adenovirales desprovistos de la mayor parte del esqueleto viral implicado en su inmunogenicidad, por lo que se confía que su empleo prevenga de la generación de respuestas inmunogénicas no previstas.

Incidencia de leucemias en pacientes X1-SCID tratados mediante terapia génica De los 20 pacientes X1-SCID que fueron tratados en París y Londres mediante TG, 5 desarrollaron leucemia linfocítica asociada a la inserción del gen terapéutico en la proximidad de diferentes oncogenes [17]. De manera paralela a la observación de las primeras leucemias en los pacientes SCID-X1, C. Baum observó por primera vez en animales de experimentación un fenómeno similar. En sus experimentos trasplantó células madre hematopopyéticas que habían sido transducidas con vectores gamarretrovirales a animales receptores [18] ¿¿??. Al cabo del tiempo observó en algunos animales la aparición de una leucemia clonal, que investigó en su nivel molecular. En su estudio, Baum observó que el vector retroviral se había insertado junto al oncogén evi1, al cual había activado mediante las secuencias promotoras presentes en el vector. De manera análoga, en los ensayos clínicos con pacientes

X1-SCID se observó que una gran proporción de las inserciones del vector terapéutico tuvo lugar en regiones próximas a (o dentro de) genes de las células diana. De hecho, se observó que la inserción del vector terapéutico ocurría con frecuencia junto al oncogén LMO2, implicado en leucemias linfocíticas [19] (fig. 10). ¿¿?? Estudios posteriores han evidenciado que los vectores gamarretrovirales se insertan preferentemente en la proximidad o dentro de genes que se están transcribiendo activamente en el momento de la transducción [20]. En estudios complementarios se observó que estos vectores se insertan preferentemente en regiones próximas al inicio de la transcripción, facilitando con ello la transactivación de los genes próximos. Con objeto de minimizar el riesgo de transactivar oncogenes por la inserción de vectores terapéuticos, se han desarrollado vectores de mayor seguridad. Así, a diferencia de lo que ocurre con los vectores gamarretrovirales, los vectores lentivirales no muestran una preferencia por integrarse junto al inicio de la transcripción del gen [21]. Por otra parte, la introducción de promotores menos potentes que los promotores virales anteriormente utilizados constituye una alternativa complementaria que está mejorando significativamente la seguridad de la TG [22]. En todo caso, los riesgos asociados a la TG han de ser correctamente ponderados, por una parte para minimizar en lo posible el riesgo asociado a su utilización, pero también para no impedir su aplicación a pacientes que no tienen alternativas terapéuticas de beneficio comparable.

Puesta en marcha de nuevos ensayos clínicos con vectores terapéuticos de nueva generación Como consecuencia de los estudios de seguridad realizados desde que se pusieron de

Avances de la terapia génica en el tratamiento de enfermedades monogénicas

93

La reprogramación celular, una nueva estrategia para la terapia génica de enfermedades monogénicas

manifiesto los primeros efectos adversos asociados a la terapia con vectores retrovirales, comenzó el desarrollo de vectores lentivirales para su aplicación clínica. El primer ensayo de tratamiento de una enfermedad monogénica con vectores lentivirales se realizó recientemente en París en pacientes con X-adrenoleucodistrofia (ALD) [23]. Esta enfermedad cursa con una desmielinización severa en cerebro, por deficiencia en la proteína ALD. La progresión de la enfermedad puede ser detenida mediante trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos. En el ensayo clínico realizado por N. Cartier et al., se transdujeron células CD34+ de la médula ósea de los pacientes con vectores lentivirales portadores del gen de la ALD y se reinfundieron tras un acondicionamiento mieloablativo de los pacientes (fig. 11). Los resultados reportados en este trabajo demuestran por primera vez la detención del proceso de desmielinización en pacientes tratados por TG, abriendo una nueva expectativa para la terapia de esta grave patología.

Ante el limitado número de células madre hematopoyéticas presentes en la médula ósea de los pacientes con aplasias congénitas, como la anemia de Fanconi (AF), por ejemplo, surgió la necesidad de investigar la posibilidad de generar progenitores hematopoyéticos a partir de fuentes alternativas a la médula ósea. Para ello resultó esencial el descubrimiento del investigador japonés Yamanaka en el año 2006, que demostraba por primera vez que la transferencia de tan sólo 4 genes podía reprogramar fibroblastos de piel [24] y así generar células pluripotentes inducidas (iPS) similares a las células madre embrionarias. Nuestro equipo, en colaboración con el de Raya e Izpisúa-Belmonte, en el Centro

41.253

P4 6 13 17 24 31 34 -C 37 M

MFG γc

44.218 1

46.229 MFG γc

54.614 2

P5 Hacein-Bey et al., Science 302, 416;2003.

3’LTR

8

IS

10 ngWT

% de inmigración

7

198 pbs

5 4 3 2 1

50 c. IS 10 ngWT

0 CD3

T γδ PBL

PBL

-10 a -9 -9 a -8 -8 a -7 -7 a -6 -6 a -6 -5 a -1 -4 a -3 -3 a -2 -2 a -1 -1 a 0 0a1 1a2 2a3 3a4 4a6 6a6 6a7 7a8 8a9 9 a 10

500 c. IS

6

Distancia al origen de transcripción TSS (kb) 600 integraciones independientes: 63% a < 10 kb de genes

Figura 10. Oncogénesis insercional en dos pacientes X1-SCID tratados por terapia génica. 94

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de Medicina Regenerativa de Barcelona, y el de Surrallés, de la Universidad Autónoma de Barcelona/Ciber de Enfermedades Raras, demostramos recientemente la posibilidad de corregir

el defecto genético de fibroblastos de piel de pacientes AF y, también, de reprogramar estas células para generar progenitores hematopoyéticos con fenotipo sano [25] (fig. 12). Desde

20 months

ALD patient (lipid storage disorder)

Lipid storage relief

Gene-corrected HSCs

HIV-based vector with therapeutic ABCD1 gene

Progeny of gene-corrected HSCs distribute throughout the body

HSCs

Figura 11. Terapia génica con vectores lentivirales en pacientes con X-adrenoleucodistrofia (tomado de L Naldini. Science 326, 805-6, 2009). Avances de la terapia génica en el tratamiento de enfermedades monogénicas

95

+ Oct 3/4 + Sox2

Células de la piel +

FANCA

+ c-Myc + Klf4

Célula iPS CMH

CMH

Figura 12. Esquema seguido para la generación de progenitores hematopoyéticos a partir de fibroblastos de piel de pacientes con anemia de Fanconi (Raya et al. Nature 460: 53-9, 2009).

esta primera demostración, la reprogramación celular se contempla como un nuevo campo de gran expectación en el cual la TG de adición y también por recombinación homóloga tendrá una oportunidad de traslación clínica.

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9a edición del curso de Biotecnología Aplicada a la Salud Humana

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Avances de la terapia génica en el tratamiento de enfermedades monogénicas

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