VARIABILIDAD MORFOMÉTRICA Y MOLECULAR (RAPD) EN UNA PLANTACIÓN DE Pinus patula EN VERACRUZ, MÉXICO MORPHOMETRIC AND MOLECULAR (RAPD) VARIABILITY IN A PLANTATION OF Pinus patula IN VERACRUZ, MÉXICO

VARIABILIDAD MORFOMÉTRICA Y MOLECULAR (RAPD) EN UNA PLANTACIÓN DE Pinus patula EN VERACRUZ, MÉXICO MORPHOMETRIC AND MOLECULAR (RAPD) VARIABILITY IN A PLANTATION OF Pinus patula IN VERACRUZ, MÉXICO Mauricio Luna-Rodríguez1, Javier López-Upton2 y Lourdes G. Iglesias-Andreu3 1

Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa. Universidad Veracruzana. Médicos Núm. 5. 91010. Unidad del Bosque, Xalapa, Veracruz. ([email protected]). 2Forestal. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo, Estado de México. ([email protected]). 3Instituto de Genética Forestal. Universidad Veracruzana. Parque Ecológico “El Haya”. 91070. Antigua Carretera CoatepecBriones. Xalapa, Veracruz. ([email protected])

RESUMEN

ABSTRACT

Con el objeto de encontrar la asociación fenotípica de marcadores de ADN con el crecimiento de algunos árboles, se realizó un estudio para evaluar el grado de variación morfométrica y molecular en una plantación de Pinus patula Schiede, en Veracruz, México. Se midió el crecimiento de 19 árboles de 2.5 años de edad en dos años consecutivos, y en el tejido foliar se midió la variación en el ADN mediante la técnica de Polimorfismo de ADN Amplificado al Azar (RAPD). El estudio morfométrico permitió separar los individuos en tres grupos con diferentes tasas de crecimiento. El análisis de la variación molecular permitió identificar 38 bandas RAPD al emplear cinco iniciadores. Los iniciadores OPK-12 y OPK-16 produjeron un mayor porcentaje de bandas polimórficas. Se detectó asociación fenotípica entre la banda OPK-12-9 con el grupo de morfometría B (árboles de crecimiento promedio), así como entre las bandas OPK-16-8 y OPK-16-10 y el grupo de morfometría A (de mayor crecimiento). Estudios genéticos futuros deberán evaluar la utilidad de estos marcadores en la selección de árboles de P. patula con incrementos superiores para las variables analizadas.

In order to find a phenotypic relationship between DNA markers and growth rate of some trees, a study of morphometric and molecular variation was performed in a plantation of Pinus patula Schiede, in Veracruz, México. Growth of nineteen trees 2.5 years of age was measured during two consecutive growing seasons and DNA variation was evaluated in leaf tissue, using the RAPD technique (Random Amplified Polymorphism of DNA). The morphometric study allowed separation of individuals in three groups with different growth rates. The analysis of molecular variation revealed the presence of 38 RAPD’s bands by using five primers. Primers OPK-12 and OPK16 produced a greater percentage of polymorphic bands. A phenotypic association was observed between the OPK-12-9 band and the morphometric group B (trees of average growth), as well as between OPK-16-8 and OPK-16-10 bands and the morphometric group A (fastest growing trees). Further genetic studies should evaluate the potential use of these markers in the selection of P. patula trees with higher increases for the analyzed variables.

Palabras clave: Coníferas, crecimiento, marcador molecular, RAPD, variación.

Key words: Conifers, growth, molecular marker, Pinus patula, RAPD, variation.

INTRODUCCIÓN

INTRODUCTION

l estudio del genoma de las especies arbóreas puede ser útil para elaborar estrategias para el establecimiento de plantaciones con materiales superiores. La información insuficiente sobre la variabilidad genética de especies de pinaceas mexicanas, evidencia la necesidad de realizar investigaciones que aporten bases genéticas para establecer plantaciones comerciales (Neale et al., 1992). Pinus patula Schiede es una especie endémica de México. Es considerada como una de las especies

he study of the genome in forest species may be useful for elaborating strategies for the establishment of plantations with superior materials. The insufficient information on the genetic variability of species of Mexican pinaceas, evidences the need to carry out investigations which provide the genetic bases for the establishment of commercial plantations (Neale et al., 1992). Pinus patula Schiede is an endemic species in México. It is considered to be one of the most widely used subtropical pine species in the world for the establishment of commercial forest plantations for the production of cellulose and solid wood (Dvorak et al., 2000).

E

T

Recibido: Junio, 2004. Aprobado: Enero, 2005. Publicado como NOTA en Agrociencia 39: 231-235. 2005. 231

AGROCIENCIA, MARZO-ABRIL 2005

subtropicales de pino más utilizadas en el mundo para el establecimiento de plantaciones forestales comerciales con propósitos de producción de material celulósico y madera en rollo (Dvorak et al., 2000). El empleo de diferentes tipos de marcadores puede ser útil en la selección de individuos de rápido crecimiento con miras a establecer plantaciones comerciales de P. patula. El presente trabajo tuvo la finalidad de evaluar la variación morfométrica y molecular de una plantación en árboles jóvenes de P. patula y detectar posibles asociaciones fenotípicas entre estas características.

MATERIALES Y MÉTODOS Características y recolección del material en estudio Se estudió una plantación de 2.5 años de edad de P. patula establecida a partir de semilla recolectada masalmente en 1996 en Carbonero Jacales, Huayacocotla, Estado de Veracruz, México. La plantación se estableció en 1997 en el municipio de Las Vigas de Ramírez, Ver. La plantación incluye 750 árboles a un espaciamiento de 2×2 m. Se muestrearon 19 árboles sanos, seleccionados aleatoriamente y espaciados aproximadamente a 20 m de distancia. El número de árboles se encuentra dentro de las cifras recomendadas por Callaham (1964) cuando no se conoce la variación fenotípica. Evaluación morfométrica La medición se efectuó en noviembre de 1999 y diciembre de 2000. Se consideraron las variables altura total (cm) tomada desde la base del árbol hasta la yema principal; altura a la base inferior de la primera rama (cm); diámetro de la base del árbol (mm); número de ramas desarrolladas; ángulo de inserción de la primera rama en el fuste; y la calidad del fuste aplicando una escala de 1 a 3 (Camacho y Murillo, 1992), donde 1 correspondió a fuste recto y cilíndrico; 2, a fuste semirrecto; y 3, a fuste con curvatura acentuada, torcido o bifurcado. Las variables que mayor variación tuvieron fueron altura total, diámetro de la base del árbol y número de ramas (Luna, 2002). Con base en éstas, se calculó el índice ponderado de sus incrementos (Sánchez Velásquez, comunicación personal4), con la ecuación:

I=

h1 n

+

φ1 n

+

R1 n

The use of different types of markers can be useful in the selection of individuals of rapid growth contemplated for the establishment of commercial plantations of P. patula. The objective of the present study was to evaluate the morphometric and molecular variation of a plantation in young trees of P. patula and to detect possible phenotypic associations among these characteristics.

MATERIALS AND METHODS Characteristics and collection of the material under study A study was carried out in a 2.5 year old plantation of P. patula established from seed collected in 1996 in Carbonero Jacales, Huayacocotla, State of Veracruz, México. The plantation was established in 1997 in the municipality of Las Vigas de Ramírez, Ver. The plantation includes 750 trees spaced at a distance of 2×2 m. A sampling was made of 19 healthy trees, selected randomly and spaced at a distance of approximately 20 m. The number of trees is found within the figures recommended by Callaham (1964) when the phenotypic variation is unknown. Morphometric evaluation The measurement was carried out in November 1999 and December 2000. The variables considered were total height (cm) taken from the base of the tree to the main shoot; height at the lower base of the first branch (cm); diameter at the base of the tree (mm); number of developed branches; insertion angle of the first branch in the stem, and quality of the stem applying a scale of 1 to 3 (Camacho and Murillo, 1992), where 1 corresponds to a straight and cylindrical stem; 2, to a semi-straight stem; and 3, to a stem which is curved, twisted or forked. The variables which presented the greatest variation were total height, diameter at the base of the tree and number of branches (Luna, 2002). Based on the above, the weighted index of their was calculated (Sánchez Velázquez, personal communication4), with the equation:

I=

h1 n

+

φ1 n

+

R1 n

∑ hi

∑ φi

∑ Ri

∑ hi

∑ φi

∑ Ri

i=1

i=1

i=1

i=1

i=1

i=1

donde I = índice ponderado; h = altura (cm); φ = diámetro (mm); R = número de ramas; y n = número de individuos.

where I = weighted index; h = height (cm); φ = diameter (mm); R = number of branches; and n = number of individuals.

Se empleó el análisis de conglomerados para clasificar los árboles según el índice ponderado de incrementos, considerando al

The analysis of conglomerates was used for the classification of the trees according to the weighted index of increases, considering the

4 Lázaro Sánchez-Velásquez. Investigador, Instituto de Genética Forestal, U. V. Parque Ecológico “El Haya”. 91070. Antigua Carretera CoatepecBriones. Xalapa, Veracruz.

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vecino más lejano como la condición de agrupamiento, y la distancia euclidiana como métrica de disimilitud (Sneath y Sokal, 1973).

farthest neighbor as the condition of grouping and the euclidian distance as dissimilarity metric (Sneath and Sokul, 1973).

Evaluación molecular

Molecular evaluation

La extracción del ADN genómico se llevó a cabo a partir de tejido foliar empleando el método de Doyle y Doyle (Stewart y Via, 1993). Las amplificaciones del ADN se realizaron en un termociclador Mastercycler Eppendorf empleando ADN (50 ng), iniciador (25 pM), dNTP (200 µM) (GIBCO BRL), MgCl2 (2 mM), Taq ADN polimerasa (1.5 U) (GIBCO BRL; solución amortiguadora de almacenaje “A”) y tampón Taq (1X) en 25 µL de volumen final. El programa térmico aplicado fue 94 °C/2 min; 45 ciclos de 94 °C/1 min, 40 °C/1 min, 72 °C/2 min; y 72 °C/3 min de extensión final. Se emplearon los iniciadores 10 (5’GTGCAACGTG-3’), 11 (5’-AATGCCCCAG-3’), 12 (5’-TGG CCC TCA C-3’), 13 (5’-GGT TGTACCC-3’), 15 (5’-CTCCTGCCAA3’), y 16 (5’-GAGCGTCGAA-3’) del Kit K (Operon Technology Inc.) resuspendidos en solución amortiguadora TE, pH 7 (10 mM Tris-HCl; 0.1 mM EDTA). Los productos amplificados se separaron en geles de agarosa 1.5% y amortiguador TBE 0.5X (Rickwood y Hames, 1990), aplicando 100 V durante 2 h con una fuente de voltaje Consort E714. Los geles se incubaron durante 40 min en 100 mL de solución amortiguadora TBE 1X, pH 8.3, adicionado con 5 µL de bromuro de etidio (10 mg mL−1) (Rickwood y Hames, 1990). Se empleó el sistema de documentación de geles Kodak Digital Science EDAS 120. Las variantes RAPD detectadas se codificaron mediante valores 0 y 1, correspondiente a la ausencia o presencia de cada banda. Para el análisis integral de la variación existente en la relación de caracteres morfométricos vs. RAPD se aplicó el análisis factorial de correspondencia múltiple (Fellenberg et al., 2001) a los grupos de árboles resultantes de la clasificación según el índice de sus incrementos y las bandas RAPD presentes en 50 a 90% de los árboles en estudio.

The extraction of the genomic DNA was carried out from foliar tissue using the method of Doyle and Doyle (Stewart and Via, 1993). The DNA amplifications were made on a Mastercycler Eppendorf thermocycler using DNA (50 ng), primer (25 pM), dNTPs (200 µM)(GIBCO BRL), MgCl2 (2mM), Taq DNA polymerase (1.5 U) (GIBCO BRL; “A” storage buffer solution) and Taq tampon (1X) in 25 µL final volume. The thermic program applied was 94 °C/2 min; 45 cycles of 94 °C/1 min, 40 °C /1 min, 72 °C/2 min; and 72 °C/3 min of final extension. The primers used were 10 (5’-GTGCAACGTG3’), 11 (5’ -AATGCCCCAG-3’), 12 (5’-TGG CCC TCA C-3’), 13 (5’GGT TGTACCC-3’), 15 (5’-CTCCTGCCAA-3’), and 16 (5’GAGCGTCGAA-3’) of the K Kit (Operon Technology Inc.) resuspended in a buffer solution TE, pH 7 (10 mM Tris-HC1; 0.1 mM EDTA). The amplified products were separated in agarose gels 1.5% and buffer TBE 0.5X (Rickwood and Hames, 1990), applying 100 V during 2 h with a voltage source of Consort E714. The gels were incubated for 40 min in 100 mL of buffer solution TBE 1X, pH 8.3, adding 5 µL of ethidium bromide (10 mg mL−1) (Rickwood and Hames, 1990). The gel documentation system employed was Kodak Digital Science EDAS 120. The RAPD’s variants detected were codified through values 0 and 1, corresponding to the absence or presence of each band. For the integral analysis of the variation existing in the ratio of morphometric characters vs. RAPD’s, the multiple correspondence factorial analysis was applied (Fellenberg et al., 2001) to the groups of trees resulting from the classification according to the index of their increases and the RAPD’s bands present in 50 to 90% of the trees under study.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Analysis of the morphometric variability

Análisis de la variabilidad morfométrica

The cluster analysis using the index of increases showed three groups of trees. Group A included trees with the highest rates of increase (with indices between 0.21 and 0.29); group B was formed by trees with average increase rates (indices between 0.12 and 0.20); and group C by individuals with the least growth (indices between 0.03 and 0.11) (Figure 1).

El análisis de conglomerados usando el índice de incrementos mostró tres grupos de árboles. El grupo A incluyó árboles con las tasas más altas de incremento (con índices entre 0.21 y 0.29); el grupo B estuvo formado por árboles con tasas de incremento promedio (índices entre 0.12 y 0.20); y el grupo C por los individuos con menor crecimiento (índices entre 0.03 y 0.11) (Figura 1). Análisis de la variabilidad molecular Se detectaron 38 productos de amplificación a partir de cinco iniciadores. El iniciador OPK-13 no produjo amplificados, en tanto que OPK-10 generó seis bandas;

RESULTS AND DISCUSSION

Analysis of the molecular variability Thirty-eight amplification products were detected from five primers. The primer OPK-13 did not produce amplifiers, whereas OPK-10 generated six bands; OPK11, five bands; OPK-1, five bands; OPK-12, nine bands; OPK-15, seven bands; and OPK-16, eleven bands (Figure 2). Thirteen bands were present in 50 to 90% of the trees

LUNA-RODRÍGUEZ et al.

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0.16 0.14

Disimilaridad

0.12 0.10 0.08 0.06

C

B

A

0.04

under study: the bands 3 (84%), 5 (63%), 6 (57%), and 9 (63%) of the primer OPK-12; the bands 4 (68%), 5 (73%), and 6 (68%) of the primer OPK-15; and the bands 2 (63%), 4 (84%), 7 (52%), 8 (57%), 9 (89%) and 10 (63%) of the primer OPK-16. In general, 35 polymorphic bands were detected, an average of seven bands per primer. Hutchison et al. (1994) reported that 90% of the primers used in Larix decidua produced an average of five polymorphic bands per primer.

0.02

Integral analysis

0.00 8 7 16 6 10 11 9 19 15 18 17 3 2 13 5 14 4 12 1 Número de árbol

Figura 1. Agrupamiento de los árboles con base en el índice de incremento. Figure 1. Grouping of the trees based on the increase index.

OPK-11, cinco bandas; OPK-12, nueve bandas; OPK15, siete bandas; y OPK-16, once bandas (Figura 2). Trece bandas estuvieron presentes en 50 a 90% de los árboles en estudio: las bandas 3 (84%), 5 (63%), 6 (57%) y 9 (63%) del iniciador OPK-12; las bandas 4 (68%), 5 (73%), y 6 (68%) del iniciador OPK-15; y las bandas 2 (63%), 4 (84%), 7 (52%), 8 (57%), 9 (89%) y 10 (63%) del iniciador OPK-16. En general, se detectaron 35 bandas polimórficas, siete bandas en promedio por iniciador. Hutchison et al. (1994) reportaron que 90% de los iniciadores utilizados en Larix decidua produjeron en promedio cinco bandas polimórficas por iniciador. Análisis integral Los resultados del análisis de correspondencia múltiple efectuado a la matriz de datos conformada por los tres grupos de morfometría y las bandas RAPD con frecuencias de 50 a 90%, mostraron una asociación entre la banda OPK-12-9 (frecuencia 63%) con el grupo de morfometría B y entre las bandas OPK-16-8 (frecuencia 57%) y OPK-16-10 (frecuencia 63%) con el grupo de morfometría A (Figura 3). Se destaca esta última asociación, ya que el grupo A estuvo constituido por árboles con las tasas más altas de incremento para las variables morfométricas en cuestión. De igual forma, se observó asociación entre las bandas OPK-12-5 (frecuencia 63%) y OPK-15-5 (frecuencia 73%) con el grupo de morfometría C, conformado por árboles de menor crecimiento (Figura 3). En resumen, los resultados obtenidos revelaron la existencia de variación morfométrica y molecular en la plantación examinada, lo cual concuerda con lo planteado por Ledig (1998), de que los pinos son organismos genéticamente muy variables.

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The results of the multiple correspondence analysis carried out on the matrix of data conformed by the three groups of morphometry and the RAPD’s bands with frequencies from 50 to 90%, showed an association between the band OPK-12-9 (frequency 63%) with the group of B morphometry and between the bands OPK16-8 (frequency 57%) and OPK-16-10 (frequency 63%) with the group of A morphometry (Figure 3). This last association is outstanding, given that group A was comprised of trees with the highest increase rates for the morphometric variables in question. Similarly, association was observed between bands OPK-12-5 (frequency 63%) and OPK-15-5 (frequency 73%) with the C morphometry group, comprised of trees with inferior growth (Figure 3). In summary, the results obtained revealed the existence of morphometric and molecular variation in the plantation examined, which coincides with what was stated by Ledig (1998), that pines are organisms with great genetic variability.

CONCLUSIONS The results obtained allowed the classification of the trees under study in three groups with different growth values according to the weighted index used. The analysis of the molecular variation (RAPD) revealed the presence

Figura 2. Perfiles de bandas RAPD en P. patula usando el iniciador OPK-16. Figure 2. Profiles of RAPD’s bands in P. patula using the primer OPK-16.

VARIABILIDAD MORFOMÉTRICA Y MOLECULAR (RAPD) EN UNA PLANTACIÓN DE Pinus patula EN VERACRUZ, MÉXICO

of a considerable number of polymorphic bands (35) employing five primers of the K kit of Operon Technology Inc. It stands out the amplification of a greater number of polymorphic bands with the primers OPK-12 and OPK16. A phenotypic association was detected between band OPK-12-9 and the group of trees with average growth. Similarly, phenotypic associations were observed between bands OPK-16-8 and OPK-16-10, with the group of trees with the highest increase rates according to the cluster analysis. The phenotypic association detected should be evaluated at the progeny level to determine the usefulness of these markers in the selection of trees of P. patula with superior increases for the variables analyzed. —End of the English version— Figura 3. Representación gráfica de la distribución de las variantes RAPD y los grupos de morfometría según el ∆ A: análisis factorial de correspondencias múltiples (∆ Grupo morfometría A; ∆ B: Grupo morfometría B; ∆ C: Grupo morfometría C; R_12_5: Banda RAPD No. 5 del primer OPK 12; R_15_5: Banda RAPD No. 5 del primer OPK 15; R_16_8: Banda RAPD No. 8 del primer OPK 16; R_16_10: Banda RAPD No. 10 del primer OPK 16). Figure 3. Graphic representation of the distribution of the RAPD’s variants and the groups of morphometry according to ∆ A: the multiple correspondence factorial analysis (∆ Morphometry group A; ∆B: Morphometry group B; ∆C: Morphometry group C; R_12_5: RAPD band No. 5 of the primer OPK 12; R_15_5: RAPD band No. 5 of the first OPK 15; R_16_8: RAPD band No. 8 of the primer OPK 16; R_16_10: RAPD band No. 10 of the primer OPK 16).

CONCLUSIONES Los resultados obtenidos permitieron clasificar los árboles en estudio en tres grupos con diferentes valores de crecimiento de acuerdo con el índice ponderado utilizado. El análisis de la variación molecular (RAPD) reveló la presencia de un número considerable de bandas polimórficas (35) al emplear cinco iniciadores del kit K de Operon Technology Inc. Destaca la amplificación de un número mayor de bandas polimórficas al utilizar los iniciadores OPK-12 y OPK-16. Se detectó una asociación fenotípica entre la banda OPK-12-9 con el grupo de árboles con crecimiento promedio. De igual forma, se observaron asociaciones fenotípicas entre las bandas OPK-16-8 y OPK-16-10, con el grupo de árboles con las tasas de incremento más altas según el análisis de conglomerados. La asociación fenotípica detectada deberá ser evaluada a nivel de progenie para determinar la utilidad de estos marcadores en la selección de árboles de P. patula con incrementos superiores para las variables analizadas.




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