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Med Clin (Barc). 2009;132(10):371–376
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Original
Patrones de hipermetilacio´n ge´nica en tumores ginecolo´gicos ˜ oz, Oscar Tapia Escalona, Pamela Leal Rojas, Leonardo Anabalo´n Rodrı´guez, Patricia Garcı´a Mun Pablo Guzma´n Gonza´lez, Juan Carlos Araya Orostica, Miguel Villaseca Herna´ndez y Juan Carlos Roa Strauch ´gica, Laboratorio de Patologı´a Molecular, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile Departamento de Anatomı´a Patolo
´ N D E L A R T ´I C U L O INFORMACIO
R E S U M E N
Historia del artı´culo: Recibido el 17 de diciembre de 2007 Aceptado el 15 de mayo de 2008 On-line el 9 de marzo de 2009
Fundamento y objetivo: El silenciamiento ge´nico mediado por la metilacio´n aberrante de la regio´n promotora del a´cido desoxirribonucleico esta´ implicado en la inactivacio´n de genes involucrados en diversas vı´as metabo´licas y se ha constituido en un marcador molecular u´til en el diagno´stico, tratamiento y seguimiento de sujetos oncolo´gicos. El objetivo de este trabajo es analizar los patrones de hipermetilacio´n ge´nica en mujeres con tumores ginecolo´gicos. Sujetos y me´todo: Se seleccionaron 115 mujeres con ca´nceres ginecolo´gicos: 22 mujeres con ca´ncer de ovario (CO), 13 mujeres con ca´ncer de endometrio (CE), 11 mujeres con ca´ncer de cuello uterino y 69 mujeres con ca´ncer de mama. Mediante prueba de metilacio´n especı´fica por reaccio´n en cadena de la polimerasa, se estudio´ el estado de metilacio´n de los genes CDNK2A (p16), APC1A, FHIT, CDH1 y hMLH1. Resultados: Las frecuencias de metilacio´n ge´nica para los genes CDNK2A (p16), APC1A, FHIT, CDH1 y hMLH1 fueron del 29,2; 34; 60,4; 10,9, y 79,8%, respectivamente. El 70% de los casos presento´ al menos 2 genes metilados, es decir, un ı´ndice de metilacio´n superior a 0,4. La frecuencia de metilacio´n ma´s baja se observo´ en el CO, mientras que la frecuencia de metilacio´n ma´s alta se presento´ en el CE. Conclusiones: Los resultados indican que la metilacio´n aberrante de la regio´n promotora es un acontecimiento importante en la carcinoge´nesis de los tumores ginecolo´gicos y que el patro´n de metilacio´n ge´nica se asocia a la naturaleza tumoral. Estas caracterı´sticas particulares pueden entregar informacio´n relevante acerca de las principales vı´as metabo´licas alteradas en cada tipo tumoral, informacio´n que sumada a estudios complementarios de pe´rdida de expresio´n o de funcio´n representa una herramienta clı´nica para el tratamiento adecuado de la enfermedad. ˜ a, S.L. Todos los derechos reservados. & 2007 Elsevier Espan
Palabras clave: Metilacio´n del a´cido desoxirribonucleico Tumores ginecolo´gicos Regio´n promotora
Promoter Hypermethylation gene patterns in gynecological tumors A B S T R A C T
Keywords: DNA Methylation Gynecological tumor Promoter region
Background and objective: Gene silencing mediated by the aberrant methylation of the promoter region of DNA is involved in the inactivation of genes implicated in various metabolic pathways. Such a gene hypermethylation has become a useful molecular marker for the diagnosis, treatment and follow-up of cancer patients. Our objective is to analyze the patterns of gene hypermethylation in patients with gynecological tumors. Patients and methods: We selected 115 patients with gynecological cancers: 22 ovarian; 13 endometrial, 11 cervical-uterine and 69 breast cancers. By testing methylation-specific PCR, we studied the methylation status of genes CDNK2A (p16), APC1A, FHIT, CDH1 and hMLH1. Results: The frequencies of gene methylation in genes p16, APC1A, FHIT, hMLH1 and CDH1 were 29.2%, 34%, 60.4%, 10.9% and 79.8%, respectively. 70% of cases showed at least two methylated genes, which means a rate of methylation 40.4. The lowest frequency of methylation was seen in ovarian cancer, while the highest one was observed in endometrial cancer. Conclusions: The results indicate that the aberrant methylation of the promoter region is an important event in carcinogenesis of gynecological tumors and that the pattern of gene methylation is associated with the nature of the tumor. These particular characteristics can deliver relevant information on the major metabolic pathways altered in each tumor type. In addition to complementary studies (ie, loss of expression and/or function), this represents a clinical tool for the proper management of the disease. ˜ a, S.L. All rights reserved. & 2007 Elsevier Espan
Autor para correspondencia.
´nico:
[email protected] (J.C. Roa Strauch). Correo electro ˜ a, S.L. Todos los derechos reservados. 0025-7753/$ - see front matter & 2007 Elsevier Espan doi:10.1016/j.medcli.2008.05.022
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P. Leal Rojas et al / Med Clin (Barc). 2009;132(10):371–376
Introduccio´n Dentro de los ca´nceres ginecolo´gicos, los tipos ma´s frecuentes son el ca´ncer de mama (CM), el ca´ncer de cuello uterino (CCU), el ca´ncer de endometrio (CE) y el ca´ncer de ovario (CO)1. De e´stos, el CM es la tercera causa de muerte por ca´ncer en las mujeres y la segunda causa de muerte por ca´ncer entre las mujeres mayores de ˜ os, con una tasa de mortalidad general de 13 cada 100.000 50 an mujeres2. El CCU es la cuarta causa de muerte por ca´ncer en las mujeres chilenas: presenta una tasa de mortalidad de 8,3 cada 100.000 mujeres3. Mientras que el CE es una neoplasia ma´s frecuente en paı´ses desarrollados: presenta una incidencia de 12 ˜ os y aumenta a 84 cada 100.000 cada 100.000 mujeres a los 40 an ˜ os4. En Chile no hay informacio´n sobre su mujeres a los 60 an incidencia; sin embargo, presenta una mortalidad de 1,5 cada ˜ o2. El CO es la sexta 100.000 habitantes, con 170 muertes por an causa ma´s comu´n de neoplasia y la quinta causa de muerte por ca´ncer; es de difı´cil tratamiento debido a que frecuentemente su diagno´stico se hace en etapas avanzadas de la enfermedad5. La metilacio´n aberrante de los islotes CpG en la regio´n promotora de genes se ha asociado a la inactivacio´n transcripcional de genes supresores de tumores en variados tipos de ca´ncer6. Esta alteracio´n molecular se produce por la incorporacio´n de un grupo metilo en la posicio´n 50 del anillo de la citosina en dinucleo´tidos CpG mediante una reaccio´n que catalizan las enzimas ADN-metiltransferasas7. Sin embargo, de todas las modificaciones epigene´ticas, la hipermetilacio´n, que reprime la transcripcio´n de la regio´n promotora de genes supresores de tumores y ocasiona el silenciamiento ge´nico, ha sido la ma´s estudiada. Este silenciamiento ge´nico puede afectar a genes de diversas vı´as metabo´licas, como la regulacio´n del ciclo celular (genes p16INK4a, p15INK4a, Rb y p14ARF)8, la reparacio´n del a´cido desoxirribonucleico (ADN) (genes hMLH1 y hMSH2)9,10, la supresio´n de tumores (genes p16, FHIT y APC)11, la apoptosis (genes DAPK y TMS1)12, la resistencia a fa´rmacos, la detoxificacio´n (gen GSTP1)13, la diferenciacio´n, la adherencia celular (gen E-cadherin)14, la angioge´nesis y la meta´stasis. Estos cambios epigene´ticos son acontecimientos tempranos en la carcinoge´nesis y se encuentran presentes en lesiones precursoras de una gran variedad de ca´nceres, incluidos los tumores ginecolo´gicos15. Las investigaciones recientes demuestran que distintos tipos tumorales presentan variados patrones de metilacio´n. Las principales a´reas de aplicacio´n clı´nica que se ven beneficiadas con los marcadores basados en patrones de metilacio´n aberrante son la deteccio´n, el comportamiento y el tratamiento del tumor. En este trabajo se estudia el estatus de metilacio´n de los genes FHIT (Fragile Histidine Triad), CDKN2A (p16), APC (Adenomatous Poliposis Coli), hMLH1 (Human Mut Homologue 1) y CDH1 (Ecadherin) en ca´nceres ginecolo´gicos, ası´ como la frecuencia de hipermetilacio´n y la asociacio´n a caracterı´sticas clinicopatolo´gicas. Estos genes se seleccionaron por su importancia en la carcinoge´nesis en humanos y porque se presentan frecuentemente metilados en otros tipos de tumores como parte de las principales vı´as metabo´licas asociadas a ca´ncer: proliferacio´n celular, inestabilidad microsatelital, adherencia celular y meta´stasis. Por tanto, si se determinan los patrones de hipermetilacio´n para cada forma o tipo de ca´ncer ginecolo´gico, se aporta una valiosa informacio´n clı´nica para la monitorizacio´n, el tratamiento y el seguimiento de estos sujetos.
Sujetos y me´todo Sujetos Para este estudio se seleccionaron 115 mujeres con ca´nceres ˜ os 1999 y ginecolo´gicos; las muestras se obtuvieron entre los an 2005: 22 mujeres con CO, 13 mujeres con CE, 11 mujeres con CCU
y 69 mujeres con CM. Las muestras provinieron del banco de tumores del Departamento de Anatomı´a Patolo´gica de la Universidad de La Frontera. Todas las muestras se mantuvieron en gel criopreservante (Jung, Alemania) a 70 1C. Para la obtencio´n del material se selecciono´ un a´rea tumoral mediante corte de congelacio´n y se fragmento´ en ca´mara frı´a. ´cido desoxirribonucleico ´n de a Extraccio La extraccio´n de ADN se realizo´ segu´n el procedimiento adaptado del protocolo de aislamiento de ADN geno´mico Puregene (Gentra, EE. UU.). Para esto, los fragmentos de tejido se incubaron a 65 1C en microtubos de 1,5 ml con solucio´n de lisis celular y proteinasa K (10 mg/ml) hasta observar lisis tisular total. Las proteı´nas se eliminaron a trave´s de precipitacio´n en acetato de amonio de 7,5 M. El ADN se precipito´ con isopropanol, se lavo´ con etanol al 70%, luego se resuspendio´ en solucio´n de hidratacio´n y finalmente se almaceno´ a 20 1C. ´n especı´fica mediante reaccio ´n en cadena de la Prueba de metilacio polimerasa ´n con bisulfito Modificacio El principio de la modificacio´n de ADN con la te´cnica de bisulfito de sodio se basa en su capacidad de convertir a todos los residuos de citosina no metilada en uracilos mediante deaminacio´n; sin embargo, cuando la citosina esta´ metilada es resistente a la reaccio´n y permanece como citosina. Los iniciadores de reaccio´n en cadena de la polimerasa (PCR) utilizados aprovechan estas diferencias para discriminar entre frecuencias metiladas y frecuencias no metiladas. Se utilizo´ un protocolo previamente descrito por Herman et al en 1996. Para esto, se desnaturalizaron 2 mg de ADN incubados a 75 1C durante 15 min en un volumen de 22 ml con hidro´xido de sodio (NaOH) y con una concentracio´n final de 0,27 N. Se agrego´ hidroquinona y bisulfito de sodio con pH 5,0 preparados en fresco, en concentraciones finales de 50 mmM y de 4,2 M, respectivamente; luego se realizo´ una incubacio´n a 50 1C durante 16 h. El ADN modificado se purifico´ y se concentro´ usando tubos Centricon YM 30 (Millipore). La desulfonacio´n se llevo´ a cabo agregando NaOH a una concentracio´n final de 0,3 N e incubando a 37 1C durante 15 min. Despue´s de neutralizar la solucio´n con acetato de amonio, se precipito´ durante toda la noche a 20 1C con 3 volu´menes de etanol en presencia de gluicogeno. Finalmente, se resuspendio´ en 80 ml de agua desionizada. ´cido desoxirribonucleico ´n del a Amplificacio Las secuencias de iniciadores de la PCR y las condiciones especı´ficas se realizaron de acuerdo con Roa et al (2006)16. Las PCR se realizaron con 100 ng de ADN geno´mico modificado; 0,2 mM de cada iniciador; 200 mM de cada uno de los desoxinucleo´tidos trifosfatos; 1,5 mM de cloruro de magnesio, y 0,75 U de Taq polimerasa (Promega) en un volumen final de 25 ml. Como control negativo se utilizaron 100 ng de ADN geno´mico sin modificar y un blanco de mezcla de reaccio´n sin ADN. Para el control positivo de metilacio´n se utilizo´ ADN geno´mico comercial (Promega) metilado con SssI (Biolab), mientras que como control positivo de ADN no metilado se utilizo´ el mismo ADN modificado sin metilar. Los productos de la PCR se visualizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% en tampo´n TBE y en gel de agarosa ˜ idos con bromuro de etidio. Se utilizo´ el al 2% en tampo´n TAE, ten ı´ndice de metilacio´n como un indicador de la proporcio´n de regiones promotoras metiladas respecto a la totalidad de los genes
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estudiados y se calculo´ dividiendo el nu´mero de genes metilados por el nu´mero de genes analizados. Ana´lisis estadı´stico La relacio´n entre el estado de metilacio´n ge´nica con variables catego´ricas, tales como sexo, raza y tipo histolo´gico, se establecio´ mediante la prueba de la w2 o la prueba exacta de Fisher. Para variables nume´ricas, como la edad, se utilizo´ el test de la t de Student.
Resultados Caracterı´sticas clı´nicas Las caracterı´sticas generales del grupo estudiado se observan ˜ os (con en la tabla 1. Se presento´ una edad promedio de 58 an ˜ os). La supervivencia global a los 5 an ˜ os fue extremos de 35 y 85 an del 67%, y se obtuvo un intervalo de seguimiento de 4 a 95 meses para el grupo analizado, con un promedio de 53,3 meses de supervivencia. La estadificacio´n segu´n el sistema TNM (tumor, adenopatı´a, meta´stasis) concentro´ la mayorı´a de los casos en los estadios I y II (38,6 y 35,1%, respectivamente); los estadios III y IV presentaron frecuencias del 24,8 y del 1,4%, respectivamente. En relacio´n con el grado de diferenciacio´n del tumor, se encontro´ un 33,1% para el grado 1, un 42,9% para el grado 2, y un 20,9% para el grado 3.
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entre el 10,9 (gen hMLH1) y el 79,8% (gen CDH1). Los genes p16 y APC1A presentaron frecuencias de metilacio´n similares (del 29,2 y del 34%. respectivamente), mientras que el gen FHIT se encontro´ metilado en el 60,4% de los casos. Sin embargo, al analizar cada tumor se observaron algunas diferencias en el estado de metilacio´n de los genes (tabla 4). Por ejemplo, en el CE se observo´ el porcentaje de metilacio´n ma´s alto (53,9%), mientras que en el CO se observo´ una frecuencia de metilacio´n promedio del 24,6%. En los CCU y CM se presentaron porcentajes de metilacio´n similares, cercanos al 47%. Al analizar la frecuencia de metilacio´n por gen, se observo´ que CDH1 se encontraba metilado en el 100% de los casos analizados de CCU, mientras que hMLH1 no presentaba metilacio´n (tabla 2). Para los genes p16 y APC, la mayor frecuencia de metilacio´n se presenta en el CM, con un 40,6 y un 53,6%, respectivamente, mientras que para los genes FHIT y hMLH1 el mayor porcentaje de metilacio´n se observo´ en el CE. ´Indice de metilacio ´n El ı´ndice de metilacio´n es un indicador que muestra la proporcio´n de a´reas promotoras metiladas respecto a los genes estudiados y se calcula dividiendo el nu´mero de genes metilados por el nu´mero de genes estudiados. Los resultados se observan en la tabla 3. La distribucio´n de los datos fue homoge´nea en cada categorı´a, excepto en el CM. En resumen, el 73,4% de los casos presento´ ma´s de 2 genes metilados, es decir, un ı´ndice de metilacio´n de 0,4 o superior. ´gicos y metilacio ´n Datos clinicopatolo
´n ge´nica Estado de metilacio Las frecuencias de metilacio´n de las a´reas promotoras de los 5 genes estudiados para los 115 casos de tumores ginecolo´gicos se presentan en la tabla 2. Los porcentajes de metilacio´n fluctuaron Tabla 1 Caracterı´sticas generales y morfolo´gicas del grupo de estudio (n ¼ 115) Caracterı´stica
Endometrio
Ovario
Cuello uterino
Mama
˜ os) Edad (an Promedio Extremos
63,4 49-86
59,2 31-88
50,8 30-76
58,6 29-88
Etnia Mapuche No mapuche
8% 92%
32% 68%
0% 100%
10% 90%
Seguimiento (meses) Promedio 32,4 Rango 6-84
17,8 1-108
108,8 4-158
54,4 6-29
Meta´stasis ganglionar Positivo 14% Negativo 86%
8% 92%
67% 33%
56% 44%
Grado de diferenciacio´n Bien 46% Moderado 39% Poco 15%
50% 25% 25%
18% 64% 18%
18,5% 55,7% 25,8%
TNM I II III IV
72,7% 18,2% 4,5% 4,5%
27,3% 36,4% 36,4% 0%
15,9% 55,1% 27,5% 1,4%
38,5% 30,8% 30,8% 0%
TNM: tumor, adenopatı´a, meta´stasis.
Al realizar el ana´lisis estadı´stico del estado y del ı´ndice de metilacio´n de los genes con los datos clinicopatolo´gicos de las mujeres, no se observo´ un efecto estadı´sticamente significativo en el CO, el CE ni el CCU. Sin embargo, en el CM se observo´ una mayor supervivencia cuando p16 se encontraba metilado (p ¼ 0,002), una menor diferenciacio´n tumoral cuando CDH1 presentaba metilacio´n (p ¼ 0,007) y una menor frecuencia de metilacio´n para hMLH1 en mujeres de raza mapuche (p ¼ 0,03). Finalmente, aquellos tumores con metilacio´n del gen APC presentaron un ˜ o tumoral y una menor diferenciacio´n (menos de mayor taman 0,05). Para el gen FHIT se observo´ una tendencia no significativa a Tabla 2 Frecuencia de metilacio´n de la regio´n promotora de genes asociados al ca´ncer en los tumores ginecolo´gicos estudiados Tumor (n)
p16 (%) APC1A (%) FHIT (%) hMLH1 (%) CDH1 (%) Total (%)
Endometrio (13) Ovario (22) Cuello uterino (11) Mama (69) Promedio
30,8 9,1 36,4 40,6 29,2
46,2 9,1 27,3 53,6 34,0
84,6 31,8 81,8 43,5 60,4
23,1 9,1 0,0 11,6 10,9
84,6 63,6 100,0 71,0 79,8
53,9 24,6 49,1 44,1 42,8
I´ndice de metilacio´n Endometrio Ovario n (%) n (%)
Cuello uterino Mama n (%) n (%)
Total n (%)
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
0 2 3 5 1 0
13 (8,6) 20 (18,0) 38 (37,0) 24 (23,7) 16 (12,4) 1 (0,4)
Tabla 3 I´ndice de metilacio´n por localizacio´n tumoral
0 0 7 (53,8) 3 (23,1) 3 (23,1) 0
5 8 8 1 0 0
(22,7) (36,4) (36,4) (4,5%)
(18,2) (27,3) (45,5) (9,1)
8 (11,6) 12 (17,4) 21 (30,4) 15 (21,7) 12 (17,4) 1 (1,4)
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Tabla 4 Estatus de metilacio´n de la regio´n promotora de genes asociados al ca´ncer en tumores ginecolo´gicos Caso
Edad
Material
p16
APC1A
FHIT
hMLH1
CDH1
I´ndice de metilacio´n
CE1 CE2 CE3 CE4 CE5 CE6 CE7 CE8 CE9 CE10 CE11 CE12 CE13 CO1 CO2 CO3 CO4 CO5 CO6 CO7 CO8 CO9 CO10 CO11 CO12 CO13 CO14 CO15 CO16 CO17 CO18 CO19 CO20 CO21 CO22 CU1 CU2 CU3 CU4 CU5 CU6 CU7 CU8 CU9 CU10 CU11 CM1 CM2 CM3 CM4 CM5 CM6 CM7 CM8 CM9 CM10 CM11 CM12 CM13 CM14 CM15 CM16 CM17 CM18 CM19 CM20 CM21 CM22 CM23 CM24 CM25 CM26 CM27 CM28 CM29
67 56 62 61 62 60 67 61 52 86 72 49 71 54 56 68 38 88 71 31 65 73 60 49 66 58 50 69 44 64 58 48 61 52 80 33 53 51 46 63 35 30 43 76 59 70 38 48 41 44 46 29 49 42 41 45 42 33 34 38 43 46 47 49 46 47 43 57 54 57 50 57 56 52 50
ENDOMETRIO ENDOMETRIO ENDOMETRIO ENDOMETRIO ENDOMETRIO ENDOMETRIO ENDOMETRIO ENDOMETRIO ENDOMETRIO ENDOMETRIO ENDOMETRIO ENDOMETRIO ENDOMETRIO OVARIO OVARIO OVARIO OVARIO OVARIO OVARIO OVARIO OVARIO OVARIO OVARIO OVARIO OVARIO OVARIO OVARIO OVARIO OVARIO OVARIO OVARIO OVARIO OVARIO OVARIO OVARIO ´ TERO U ´ TERO U ´ TERO U ´ TERO U ´ TERO U ´ TERO U ´ TERO U ´ TERO U ´ TERO U ´ TERO U ´ TERO U MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA
M M NM NM NM NM NM NM NM M NM NM M NM NM NM NM NM NM NM NM NM M NM NM NM NM NM NM NM M NM NM NM NM M NM NM M NM NM NM NM M M NM NM NM NM NM M NM M NM NM NM NM NM NM M NM NM M M M M M NM NM NM NM NM NM NM M
NM NM NM NM M NM M M NM NM M M M NM NM NM NM NM M NM NM NM M NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM M
M M M M NM M NM M NM M M M M NM M M M M NM NM NM M NM M NM NM NM NM NM NM NM M NM NM NM M NM M M M M M M M M NM NM NM NM M NM M NM M NM NM M NM NM NM NM M NM NM NM M M NM NM NM NM M NM NM M
NM NM NM NM NM NM M M NM NM M NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM M NM NM NM M NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM M NM NM NM NM NM NM M NM M
M NM M M M M M M NM M M NM M M M M NM M NM NM M M M M M M NM NM M NM NM M M NM M M M M M M M M M M M M NM M NM M M M M M M M M M M M M M M M M M M NM M M NM NM NM M NM
0,6 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,6 0,8 0,4 0,6 0,8 0,4 0,8 0,2 0,4 0,4 0,2 0,4 0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,4 0,4 0,2 0 0 0,4 0 0,2 0,4 0,2 0 0,2 0,6 0,2 0,4 0,8 0,4 0,6 0,6 0,4 0,6 0,6 0,2 0 0,2 0,2 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,6 0,6 0,6 0,6 1 0,8 0 0,2 0,2 0,2 0,2 0,4 0,4 0,6
M M NM NM NM NM NM NM M NM NM NM NM NM M M NM M M NM M M M M M M M NM NM NM M NM M M NM
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´n) Tabla 4 (continuacio Caso
Edad
Material
p16
APC1A
FHIT
hMLH1
CDH1
I´ndice de metilacio´n
CM30 CM31 CM32 CM33 CM34 CM35 CM36 CM37 CM38 CM39 CM40 CM41 CM42 CM43 CM44 CM45 CM46 CM47 CM48 CM49 CM50 CM51 CM52 CM53 CM54 CM55 CM56 CM57 CM58 CM59 CM60 CM61 CM62 CM63 CM64 CM65 CM66 CM67 CM68 CM69
57 59 57 54 50 53 65 60 67 69 66 68 64 60 65 62 61 64 68 68 64 60 66 67 75 79 72 75 73 70 78 79 70 71 76 70 82 81 88 87
MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA MAMA
M M M M NM M NM NM NM NM NM NM NM NM NM M NM M M M M M NM M NM NM NM NM NM NM M M M M M M NM NM M NM
M M M M M M NM NM NM M NM M NM M NM NM NM NM NM M M M M M NM NM NM M NM M NM NM M NM NM M M M M M
M M NM M M NM NM NM NM NM NM NM M M M NM M
NM NM M NM M M NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM M NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM NM M
M M M M M M NM NM NM NM M NM NM NM M M M M M M M M M M NM NM NM NM M M M M M M M M NM NM M M
0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0 0 0 0,2 0,2 0,2 0,2 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,6 0,6 0,8 0,8 0,8 0,8 0 0 0 0,4 0,4 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,8 0,2 0,2 0,6 0,6
M NM M M M M NM NM NM M M M M M NM M M M NM NM NM NM
CCU: Ca´ncer de cuello uterino; CE: Ca´ncer de endometrio; CM: Ca´ncer de mama; CO: Ca´ncer de ovario. NM, no metilado. M, metilado.
estar metilado en ausencia de receptores de estro´geno y progesterona (menos de 0,05).
Discusio´n Costello et al describieron inicialmente la existencia de patrones especı´ficos de hipermetilacio´n en islotes CpG para cada ca´ncer humano (2000)17; luego, Esteller et al la confirmaron (2001)18. En el presente estudio se evaluo´ el estado de metilacio´n de 5 genes en tumores ginecolo´gicos. Los genes escogidos participan en distintas vı´as celulares y su desregulacio´n esta´ implicada en el inicio y la progresio´n de diversos ca´nceres19. De acuerdo con el ana´lisis de los resultados, el gen CDH1 presenta una frecuencia de metilacio´n alta (superior al 60%) en los 4 tipos tumorales. Este gen codifica una proteı´na de membrana (E-cadherin), cuya principal funcio´n es la preservacio´n de la integridad epitelial a trave´s del mantenimiento de la adherencia intercelular y de la polaridad celular14. La disfuncio´n de la E-cadherin se asocia al desarrollo de tumores de alto grado, invasio´n y meta´stasis en mu´ltiples neoplasias20. La inactivacio´n del gen CDH1 puede ser consecuencia de mutaciones germinales (como se ha descrito para los carcinomas ga´stricos de tipo difuso en familias con predisposicio´n)21, o bien debido a mutaciones soma´ticas (como se ha demostrado para el carcinoma lobular de
mama y para el ca´ncer ga´strico de tipo difuso; ma´s del 50% de estos ca´nceres presenta mutaciones soma´ticas en ambos alelos del gen). Sin embargo, para la mayorı´a de los ca´nceres que presentan una disminucio´n o pe´rdida de expresio´n de E-cadherina, las mutaciones no son comunes y se ha demostrado que acontecimientos epigene´ticos, como hipermetilacio´n de promotores y cambios en la estructura de la cromatina, son un mecanismo de inactivacio´n de uno o ambos alelos del gen22. En el caso de los tumores ginecolo´gicos, los estudios que evalu´an la inactivacio´n de este gen han demostrado que la metilacio´n de su promotor es un acontecimiento frecuente en los 4 carcinomas10. En el CCU se han descrito frecuencias que varı´an del 43,3 al 80,6% en distintas series de casos12,23. Adema´s, se ha detectado metilacio´n del gen en muestras de suero de sujetos con ca´ncer de cuello uterino y se ha determinado que el estado metilado del gen se correlaciona significativamente con una peor supervivencia de las mujeres. En el CE, la hipermetilacio´n de CDH1 se ha asociado a la desdiferenciacio´n y a la capacidad invasiva del tumor24. Igualmente, en mujeres con ca´ncer ova´rico invasivo es ma´s frecuente la metilacio´n de este gen. Yuecheng et al (2006)25 describieron que el estado metilado de CDH1 se correlaciona con la pe´rdida de expresio´n inmunohistoquı´mica y que, a su vez, ambos sucesos se asocian a meta´stasis en no´dulos linfa´ticos y a grado de diferenciacio´n tumoral; de este modo, son indicadores prono´sticos u´tiles para esta neoplasia.
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P. Leal Rojas et al / Med Clin (Barc). 2009;132(10):371–376
En el caso del gen hMLH1, se observo´ una mayor frecuencia de metilacio´n en el CE y ausencia de estado metilado en los casos de CCU. En tumores ova´ricos, la frecuencia de metilacio´n de este gen no supero´ el 10%. Estos resultados concuerdan con los publicados para otras series de casos, en los que se ha observado que la metilacio´n de este gen reparador esta´ ma´s asociada a tumores endometriales que al CO y al ca´ncer de cuello uterino19,26. En este estudio, la frecuencia de metilacio´n alcanzo´ el 20% en carcinomas de endometrio. Otros estudios han encontrado entre un 13 y un 40% de metilacio´n del gen hMLH1 en esta neoplasia27,28. Uno de los principales mecanismos de inactivacio´n de este gen reparador es la hipermetilacio´n aberrante de su promotor y la pe´rdida de funcio´n contribuye al desarrollo de inestabilidad microsatelital en varios tumores. Esta caracterı´stica se ha utilizado como marcador diagno´stico y prono´stico de ca´ncer de colon29, de CO30 y de CE31. Sin embargo, en el carcinoma de ce´lulas renales espora´dico se ha mostrado que la metilacio´n del promotor del gen hMLH1 no esta´ implicada en la patoge´nesis10. Al analizar el estado de metilacio´n del gen FHIT, los resultados de este trabajo indican que la metilacio´n de su promotor es un acontecimiento frecuente en los ca´nceres asociados al u´tero (ma´s del 80%). Los ca´nceres ova´ricos tambie´n presentaron metilacio´n de este gen, aunque la frecuencia no supero´ el 32%. Asimismo, se observo´ metilacio´n de los genes CDNK2A y APC1A en los 4 tipos de ca´nceres, aunque en tumores ova´ricos se observo´ una menor frecuencia de metilacio´n en ambos genes. Los resultados de metilacio´n de estos 2 genes en el CE (30,8 y 46%, respectivamente) son similares a los publicados por Yang et al en 200619, que alcanzaron porcentajes que fluctuaron entre el 25 y el 35%. En el ca´ncer de cuello uterino, se detecto´ un mayor porcentaje de metilacio´n de p16 (36,4%) que el descrito para otras series de casos (25%). Si se consideran la implicancia de la metilacio´n aberrante en la ge´nesis y la progresio´n de diversas neoplasias, los resultados obtenidos indican que este acontecimiento participa en la carcinoge´nesis de los tumores ginecolo´gicos estudiados. Por otra parte, segu´n la naturaleza tumoral, el patro´n de metilacio´n ge´nica presenta diferencias notables en genes como hMLH1 y FHIT. Adema´s, los resultados muestran que, segu´n la localizacio´n del tumor, la evolucio´n de las curvas del ı´ndice de metilacio´n requiere diferentes perfiles de activacio´n. Estas caracterı´sticas particulares pueden entregar informacio´n relevante acerca de las principales vı´as metabo´licas alteradas en cada tipo tumoral, informacio´n que sumada a estudios complementarios de pe´rdida de expresio´n o funcio´n, representan una herramienta clı´nica para el tratamiento adecuado de la enfermedad. Bibliografı´a 1. Benedet JL. Progress in gynecologic cancer detection and treatment. International Journal of Gynaecology and Obstetrics: the Official Organ of the International Federation of Gynaecology and Obstetrics. 2000;70:135–47. 2. Medina E, Kaempffer AM. Cancer mortality in Chile: epidemiological considerations. Revista Me´dica de Chile. 2001;129:1195–202. 3. Suarez E, Prieto M. Cervical cancer: the Chilean perspective. FIGO 6th annual report on the results of treatment in gynecological cancer. International Journal of Gynaecology and Obstetrics: the official organ of the International Federation of Gynaecology and Obstetrics. 2006;95(Suppl 1):S235–8. 4. Fujita M. Biology of endometrial cancer. Nippon Rinsho. 2004;62(Suppl 10):264–8. 5. Jara L, Ampuero S, Santibanez E, Seccia L, Rodriguez J, Bustamante M, et al. BRCA1 and BRCA2 mutations in a South American population. Cancer Genetics and Cytogenetics. 2006;166:36–45.
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