Ostachuk AI - Informe final CONICET - Doctorado en Biotecnología (2009)

Agustin Ignacio Ostachuk

Expresión de una proteína de fusión ScFv-E2T en células CHO-K1 y plantas transgénicas de alfalfa para el direccionamiento selectivo a células presentadoras de antígenos

CÉLULAS DE MAMÍFEROS

Clonado de los genes en el vector pGEM-T Easy. Se amplificaron los genes de E2 y E2T (sin dominio transmembrana) del virus de la diarrea viral bovina (VDVB), cepa NADL, por PCR a partir de un fragmento de cDNA del virus. El primer río arriba del gen contiene un sitio de restricción Xma I y el codón de inicio de la traducción, mientras que el primer río abajo contiene una secuencia que codifica para una secuencia de seis histidinas (6His), el codón de terminación de la traducción, y un sitio de restricción Spe I. Los productos de PCR fueron clonados en el vector pGEM-T Easy, y 3 clones positivos por construcción fueron enviados a secuenciar. Se eligieron aquellos clones que no tenían mutaciones en su secuencia nucleotídica o que tenían mutaciones que no alteraban la secuencia aminoacídica. El análisis bioinformático de las secuencias obtenidas predijeron la presencia de un péptido señal a retículo endoplásmico en el extremo N-terminal de las proteínas, cuatro sitios putativos de N-glicosilación, y un dominio transmembrana en el caso de E2, que determinaba una topología en la cual el extremo N-terminal de la proteína quedaba ubicado hacia el lado extracelular, mientras que el extremo C-terminal quedaba ubicado intracelularmente. Las construcciones SCFV-E2 y SCFV-E2T fueron llevadas a cabo en el laboratorio del Dr. José Ángel Escribano (INIA, Madrid, España). Las mismas fueron igualmente secuenciadas y elegidos los clones adecuados de acuerdo a las condiciones antes descriptas. El análisis bioinformático se correspondió con el anterior. Las construcciones contenían péptido señal y 6His en su extremo C-terminal.

Clonado de los genes en el vector de expresión de células de mamíferos. Los genes E2T y SCFV-E2T, clonados en el pGEM-T Easy y secuenciados, fueron transferidos al vector de expresión pcDNA 3.1 (Invitrogen).

Transfección de células CHO-K1. Células CHO-K1 fueron transfectadas con los vectores de expresión empleando lípidos catiónicos (Lipofectamina 2000, Invitrogen). Se

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realizó una puesta a punto de la transfección probando distintas concentraciones de ADN y lipofectamina. En la figura siguiente se muestra la puesta punto de la transfección con distintas concentraciones de ADN. E2T

ScFv-E2T

0.5ug 0.75ug 1ug

0.5ug 0.75ug 1ug

CN CP

75KDa 50KDa

Generación de líneas estables. Una vez evidente la posibilidad de expresar satisfactoriamente E2T y SCFV-E2T en células de mamíferos, se procedió a la obtención de líneas establemente transfectadas. Para ello se transfectaron con lipofectamina, frascos T-75 con monocapas de CHO-K1 a una confluencia del 80 %. Se transfectó una monocapa de células con un vector de la misma serie de pcDNA 3.1 que contenía el gen LACZ, con el fin de utilizar esta línea para chequear más fácilmente la evolución y el desarrollo de las líneas estables. A las 24 hs. postransfección se realizó un subcultivo de las células transfectadas a 4 T-75 y se inició el proceso de selección adicionando al medio de cultivo el antibiótico geneticina (Invitrogen) a una concentración de 700 ug/ml. A los 14 días de cultivo fue evidente la presencia de focos de células resistentes al antibiótico de selección. En ese momento se realizó un nuevo subcultivo de las células y se inició una primer tanda de aislamiento de células individuales por dilución al límite en placas de 96 wells. A los 21 días de cultivo se evidenciaron nuevamente la presencia de focos y se inició una nueva tanda de dilución al límite para el aislamiento de clones individuales. El proceso de dilución al límite se repitió dos veces para cada tanda. Aquellos wells de las diluciones más altas que resultaron positivos por western blot para la expresión de las proteínas recombinantes en el primer proceso de dilución al límite, fueron utilizados en el segundo proceso. Finalmente, los clones positivos fueron amplificados y congelados en nitrógeno líquido para su almacenamiento.

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Día 21

Día 14

Día 1

Días postransfección

PRIMER TANDA

SEGUNDA TANDA

E2T

Detección de clones positivos

CP 1 2

3

4

5

6

7

8 CN

CP 1 2

3

4

5

6

7

8 CN

SCFV-E2T

Línea estable LACZ

Caracterización de la expresión de los transgenes en las líneas estables. Una vez obtenidas las líneas estables se procedió a hacer un estudio de las cinéticas de expresión. La primer pregunta a responder fue en qué etapa del cultivo había una mayor expresión de los transgenes (fase exponencial o fase estacionaria). Esta pregunta surgió debido a que la primera intención para la producción de las proteínas a gran escala fue crecer las células hasta confluencia, renovar el medio de cultivo y cosechar el sobrenadante 7 días después, una vez que la mayoría de las células se hubieron despegado del frasco. Sin embargo, esta metodología no arrojó buenos resultados en nuestro caso. En consecuencia, el problema podría residir en que la expresión de los transgenes, dirigida por el promotor de citomegalovirus, fuera dependiente de la fase del cultivo y del ciclo celular. La respuesta a

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esta pregunta fue que durante la fase exponencial ocurrió acumulación de producto, la cual finalizó luego de que el cultivo alcanzara la confluencia. La máxima concentración de producto en los sobrenadantes se detectó entre los días 7 y 8 de cultivo. La segunda pregunta que nos hicimos fue: habiendo visto que la expresión de los transgenes (detectada por presencia de las proteínas en los sobrenadantes) ocurre esencialmente en fase exponencial, ¿podemos aumentar la acumulación de producto alargando esta fase del cultivo?. Para tal fin, se ensayaron dos compuestos distintos: el butirato de sodio (2 mM), un inhibidor de la deacetilación de histonas que genera un incremento general de la expresión génica y arresto celular; y DMSO (2 %), que produce arresto celular en G1 y alarga la fase exponencial del cultivo. Ambos compuestos lograron incrementar los niveles de expresión unas 4 veces respecto al control. E2T

SCFV-E2T

0.55

0.55

0.5

0.5

0.45

0.45 0.4

Absorbancia (405 nm)

Absorbancia (405 nm)

0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15

0.35 0.3 0.25 0.2 0.15

0.1

0.1

0.05

0.05

0

0 0

1

2

3

4

5

6

Días CONTROL DMSO (2 %) Butirato de sodio (2 mM)

7

8

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Días CONTROL DMSO (2 %) Butirato de sodio (2 mM)

Purificación de E2T y SCFV-E2T por cromatografía de quelatos metálicos (IMAC). Aprovechando los “tags” de histidinas presentes en el C-terminal de las proteínas, las mismas fueron purificadas a partir de los sobrenadantes de los cultivos con resinas de níquel (Ni-NTA, Qiagen). Habiendo visto la factibilidad de purificar las proteínas por este método con distintos volúmenes de sobrenadante (hasta 500 ml) y en distintos formatos (columna y batch), se llevó a cabo la puesta a punto de la purificación. Se adicionó 300 mM de NaCl a los sobrenadantes para aumentar la fuerza iónica y así reducir el pegado inespecífico. Además se agregaron inhibidores de proteasas (PMSF y leupeptina) y todo el proceso se llevó a cabo a 4°C para minimizar la degradación por proteasas. Los dos puntos principales que se ajustaron en la puesta a punto fueron la afinidad de las proteínas recombinantes por la resina y la capacidad máxima de la resina con los sobrenadantes utilizados. La unión de las proteínas a la resina se reducía drásticamente a concentraciones crecientes de imidazol, y a una concentración de 100 mM las proteínas ya no se unían a la

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misma. Se eligió la concentración de 20 mM de imidazol para la etapa de unión y lavado de la resina. Por su parte, la unión de las proteínas a 100 ul de resina saturaba cuando se incubaba con 60 ml de sobrenadante. Por lo tanto, se utilizó aproximadamente 1 ml de resina para la purificación de las proteínas presentes en 500 ml de sobrenadante. Luego de la purificación por IMAC, los eluidos fueron lavados con PBS y concentrados con columnas Centricon (10 KDa cut-off). Este protocolo permitió la obtención de E2T y SCFV-E2T en un alto grado de pureza (80 % aproximadamente), registrándose la aparición de una única banda para E2T y tres bandas para SCFV-E2T, la más pesada correspondiente a la proteína de fusión, la intermedia probablemente trazas de BSA, y la más liviana se trata de un producto de la proteólisis de SCFV-E2T (confirmado por western blot). El rendimiento aproximado de todo el proceso fue del orden del 40 %, pudiéndose obtener aproximadamente 150 ug de proteína purificada cada 1 litro de sobrenadante.

BSA (ng/ul) 100KD

MK E2T SCFV 200 E2T

100

50

25 12.5

6.25

75KD 50KD

SCFV-E2T reconoce el MHC clase II de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de distintas especies. Se purificaron PBMCs a partir de sangre heparinizada de distintos animales (bovino, cerdo, caballo, cabra, oveja, cobayo y ratón) con Ficoll-Hypaque (Amersham). Las células obtenidas de esta manera fueron luego incubadas con PBS (control de isotipo), E2T o SCFV-E2T, y luego marcadas con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-E2 (VDVB, cepa NADL) y un anticuerpo monoclonal anti-IgG de ratón acoplado a ficoeritrina. Las células marcadas fueron analizadas en un citómetro de flujo, y los resultados se informaron como la intensidad de fluorescencia media (MFI). En todas las especies analizadas, la unión de SCFV-E2T fue notoriamente mayor a la obtenida para E2T, salvo en ratón, presumiblemente debido a que el ScFv deriva de un anticuerpo murino.

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450 400 350

MFI

300 250 200 150 100 50 0 Bovino

Cerdo

Caballo

Cabra

Control Isotipo

Oveja E2T

Cobayo

Ratón BALB/C

Ratón C57/B

ScFv-E2T

Detección de bovinos seropositivos para VDVB. En orden de utilizar bovinos para inmunizaciones y ensayos de proliferación in vitro, los bovinos del campo experimental del INTA (N=104) fueron sangrados y analizados sus sueros por ELISA para la detección de anticuerpos anti-VDVB. Sólo cinco de los 104 bovinos mostraron una clara señal de poseer estos anticuerpos y, en consecuencia, de haber sido infectados por el virus durante sus vidas. 8

6 5 4 3 2 1

629

620b

632

604

606

612

588

565

567

577

554

556

533

539

519

521

527

0

501

N-fold Increase

7

Bovino

6

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Ensayo in vitro de proliferación de linfocitos T por células presentadoras de antígenos bovinas. Con el objetivo de investigar si el mejoramiento en el direccionamiento a la superficie de células presentadoras de antígeno (CPAs) mediado por la fusión a moléculas MHC clase II resultaría en un incremento concomitante en el número de complejos MHC-péptido en la superficie de las CPAs y, en última instancia, en una mayor activación de células T, se desarrollaron ensayos de proliferación de células T in vitro. Para ello se purificaron CPAs (células adherentes) y linfocitos (células no adherentes) a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs, en inglés) derivadas de bovinos seropositivos para VDVB, y se incubaron con distintas concentraciones de las proteínas recombinantes. Las CPAs fueron incubadas con las proteínas por 2 hs., lavadas e incubadas luego con los linfocitos por 4 días. ScFv-E2T generó una mayor proliferación de células T, medida por incorporación de 3[H]timidina, que E2T a todas las concentraciones ensayadas. ScFv-E2T requirió aproximadamente una concentración 10 veces menor a E2T para inducir la misma tasa de proliferación T. Asimismo, ScFv-E2T fue capaz de inducir proliferación a concentraciones que E2T no lo hizo. 3,500 3,000

CPM

2,500 2,000 1,500 1,000 500 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Protein (nM) E2T

ScFv-E2T

Inmunización de bovinos con ScFv-E2T y E2T producidas en células de mamíferos. Sabiendo ya que ScFv-E2T se unía en mayor proporción que E2T a la superficie de CPAs, y que además inducía una mayor proliferación de linfocitos in vitro, se procedió a analizar el comportamiento de esta estrategia de direccionamiento in vivo. Para ello, se inmunizaron bovinos seronegativos para VDVB (3 por grupo) del campo experimental del INTA con distintas dosis de proteína recombinante (0, 0.2, 1 y 5 ug). Sobrenadantes de E2T y ScFv-E2T fueron concentrados con columnas Centricon y cuantificados por ELISA empleando las proteínas purificadas como patrón. Las vacunas se prepararon adicionando diluciones

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apropiadas de los sobrenadantes concentrados a un adyuvante oleoso (Biogénesis-Bagó) en una proporción 40:60, respectivamente. El volumen final de cada dosis vacunal fue de 5 ml. El esquema de vacunación consistió en una inmunización y un booster cuatro semanas después. La respuesta de anticuerpos específicos producida por la vacunación con las proteínas recombinantes fue medida por ELISA, usando diluciones de los sueros de 1/40. A una dosis de 5 ug ambas proteínas fueron capaces de inducir una fuerte producción de anticuerpos específicos, según indica el gráfico mostrado abajo (el título de anticuerpos obtenido al final del esquema de inmunización se indica entre paréntesis). Más aún, una sóla inmunización fue suficiente para disparar la producción de anticuerpos, mientras que el booster intensificó y aceleró la respuesta. A una dosis de 1 ug fue necesaria la aplicación del booster para iniciar la producción de anticuerpos, la cual fue menor que en el caso anterior. Finalmente, a una dosis de 0.2 ug sólo ScFv-E2T fue capaz de iniciar una respuesta de anticuerpos. Dosis: 5 ug

Dosis: 1 ug

1,6

1,6 1,4 (4096)

1,2

1 0,8 E2T 0,6

ScFv-E2T

0,4

Absorbancia (405 nm)

Absorbancia (405 nm)

1,4

0,2

1,2

1 0,8 E2T 0,6

(1024)

0,2 0

0 0

1

2

3

4

5

6

0

7

1

2

3

4

5

6

7

Tiempo (semanas)

Tiempo (semanas)

Control negativo

Dosis: 0,2 ug 1,6

1,6

1,4

1,4

1,2

1,2

1 0,8 (1024) 0,6

E2T

ScFv-E2T

0,4

Absorbancia (405 nm)

Absorbancia (405 nm)

ScFv-E2T

0,4

1 0,8 Control negativo

0,6

0,4 (0)

(0) 0,2

0,2

0

0 0

1

2

3

4

Tiempo (semanas)

5

6

7

0

1

2

3

4

5

6

7

Tiempo (semanas)

Seroneutralización. Para verificar si los niveles de anticuerpos producidos en la inmunización anterior tenían relevancia biológica y eran capaces de neutralizar la actividad viral, se procedió a utilizar los sueros bovinos (semana 6) en ensayos de seroneutralización. En la figura se muestran los títulos de seroneutralización obtenidos por los sueros según el método de Reed-Muench. El comportamiento fue muy similar al anterior, demostrando que

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los anticuerpos específicos producidos por la vacunación son, a su vez, neutralizantes. A una dosis de 5 ug, ScFv-E2T y E2T alcanzaron el título máximo detectado por el método utilizado, que es de 3. A una dosis de 1 ug, la neutralización fue menor (aproximadamente 2), mientras que a una dosis de 0.2 ug sólo ScFv-E2T fue capaz de neutralizar la actividad viral. Seroneutralización 3,5 3

Título

2,5 2

E2T

1,5

ScFv-E2T

1 0,5 0 0

0,2

1

5

Dosis vacunal (ug)

PLANTAS

Construcción del vector de expresión de plantas de alfalfa pCAR. Se tomó como punto de partida el vector de expresión pBI 121 (Clontech). El gen reportero –GUS fue extraído con sitios Bam HI y Sac I, y reemplazado por un sitio de clonado múltiple. Por su parte, el promotor 35S CaMV (Cauliflower Mosaic Virus) del vector comercial fue reemplazado por el promotor CsVMV (Cassava Vein Mosaic Virus), empleando los sitios Hind III y Bam HI. pBI 121

pCAR ori V

ori V

ColE1 ori

ColE1 ori

T-DNA right border T-DNA right border

NOS promoter npt II gene

pBI 121

NOS promoter

pCAR

npt II gene

12554 bp

14758 bp

NOS terminator NOS terminator T-DNA

CaMV 35S T-DNA left border NOS terminator

T-DNA gus A

CsVMV promoter T-DNA left border

MCS NOS terminator

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Clonado de los genes en el nuevo vector de expresión de plantas pCAR. Los genes amplificados, clonados y secuenciados fueron luego clonados en el vector pCAR utilizando los sitios de restricción incluidos en los primers mencionados anteriormente, Xma I y Spe I. De esta manera, los genes así clonados contenían toda la información requerida para su correcta expresión: promotor, secuencia codificante con su respectivo codón de inicio de la traducción, péptido señal, codón de terminación de la traducción, y finalmente el terminador de la transcripción (NOS terminator). Los plásmidos obtenidos para la transformación de alfalfa fueron: pCAR-E2, pCAR-E2T, pCAR-SCFV-E2 y pCAR-SCFV-E2T.

Obtención de cepas Agrobacterium tumefaciens recombinantes. Los plásmidos anteriormente descriptos fueron luego incorporados a cepas LBA de A. tumefaciens por electroporación. Las colonias obtenidas fueron chequeadas para la presencia de los respectivos plásmidos.

Obtención de plantas transgénicas de alfalfa. Las A. tumefaciens recombinantes obtenidas fueron utilizadas para la inoculación e infección de pecíolos de alfalfa. Los pecíolos inoculados fueron incubados en medio SHK en presencia del antibiótico de selección (25 ug/ml kanamicina), de manera que sólo podían sobrevivir y crecer aquellas células que fueron infectadas por la bacteria y que en consecuencia contenían el gen de resistencia antibiótica insertas en su genoma. En este mismo medio las células vegetales regeneraron para dar origen a embriones somáticos, los cuales crecieron y se desarrollaron para dar plantas.

Caracterización y cuantificación de las plantas transgénicas de alfalfa. Se prepararon extractos a partir de las hojas de las plantas transgénicas y se analizaron los mismos por ELISA. En todas las plantas transgénicas producidas fue posible detectar el producto del transgen. Los niveles de expresión fueron bastante reproducibles y promediaron el valor de 1 ug proteína recombinante / g hoja fresca (datos no mostrados). Realizando la extracción con el método utilizado (0,2 g hoja / ml buffer de extracción), se obtuvieron niveles de expresión similares a los obtenidos con células de mamíferos. Esto demostraba la viabilidad del uso de estas plantas para la producción de vacunas recombinantes.

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2,0

Absorbancia (405 nm)

1,8 1,6 1,4 1,2 1,0

0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

SCFV-E2T

12

13

1

2 E2T

C23

E2T LACZ (SN)

Inmunización de bovinos con ScFv-E2T y E2T producidas en plantas transgénicas de alfalfa. Habiendo obtenido indicios de la viabilidad del uso de las plantas transgénicas como sistema para la producción de vacunas a subunidad, y de la buena respuesta inmunitaria obtenida en la inmunización de bovinos con ScFv-E2T y E2T producidas en células de mamíferos, se decidió inmunizar bovinos con las mismas proteínas producidas en plantas transgénicas. Las vacunas fueron generadas de la misma manera que en la ocasión anterior, empleando una dosis de 1 ug de proteína recombinante y utilizando 3 bovinos por grupo. En este caso, el esquema de vacunación consistió en una primera inmunización seguida de dos boosters. Luego del primer booster, ScFv-E2T fue la única capaz de generar una respuesta de anticuerpos, obteniendo una pequeña, pero significativa, diferencia respecto del control. Por su parte, luego del segundo booster, E2T fue capaz de iniciar la producción de anticuerpos mientras que ScFv-E2T intensificó y reafirmó la respuesta iniciada anteriormente. Aún así, ScFv-E2T obtuvo una diferencia pequeña, pero significativa, respecto de E2T. Los títulos de anticuerpos obtenidos al final del esquema de vacunación promediaron el valor de 2000 (datos no mostrados).

Figura: ELISA para medir los niveles de anticuerpos en los sueros de los bovinos inmunizados con los extractos de plantas transgénicas de alfalfa (dilución de los sueros: 1/40; *: diferencia significativa respecto del control; ¶: diferencia significativa respecto de E2T).

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1,6 1,4

Absorbancia 405 nm

1,2

¶*

1

*

0,8

E2T ScFv-E2T

*

0,6

Control negativo

0,4

0,2 0 Tiempo 0

4 semanas postprimera inmunización

2 semanas postprimer booster

2 semanas postsegundo booster

Seroneutralización. En orden de evaluar la relevancia biológica de los niveles de anticuerpos producidos en respuesta a la inmunización con los extractos de plantas transgénicas, se llevaron a cabo ensayos de seroneutralización. Los resultados indicaron que los niveles de anticuerpos producidos luego del segundo booster son suficientes para neutralizar la actividad viral, no así los producidos luego del primer booster. No se alcanzan a ver diferencias significativas entre ScFv-E2T y E2T. Seroneutralización

3,5

*

3

*

Título

2,5 2

E2T

1,5

ScFv-E2T

Control negativo

1

0,5 0 2 semanas post-primer booster 2 semanas post-segundo booster

BREVE CONCLUSIÓN FINAL

Los resultados aquí presentados demuestran la validez del uso de la estrategia de direccionamiento a células presentadoras de antígenos a través de las moléculas MHC clase II para la generación de vacunas a subunidad más eficaces e inmunogénicas. Se demuestra además que el uso de plantas transgénicas es una alternativa y una solución más a los sistemas de expresión utilizados para la producción de vacunas a subunidad. A pesar de mostrar algunas evidencias del mejor funcionamiento de ScFv-E2T sobre E2T en este último sistema, restaría definir e investigar un poco más este punto (por ejemplo, verificar la

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integridad física y funcional de la proteína de fusión luego de ser extraída y procesada en una vacuna).

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