Korelasi antara Ekspresi Endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS) terhadap Fibrosis Perivasuler dan Interstisial pada Model Fibrosis Ginjal di Mencit (Mus musculus) dengan Metode Unilateral Ureteral Obstruction (UUO)

KORELASI ANTARA EKSPRESI ENDOTHELIAL NITRIC OXIDE SYNTHASE (eNOS) TERHADAP FIBROSIS PERIVASKULER DAN INTERSTISIAL PADA MODEL FIBROSIS GINJAL DI MENCIT (Mus musculus)DENGAN METODE UNILATERAL URETERAL OBSTRUCTION (UUO) SKRIPSI

Untuk Memenuhi Sebagian Syarat Memperoleh Derajat Sarjana Kedokteran

Universitas Gadjah Mada

Disusun Oleh: VITO CAMBODIAWAN 11/312650/KU/14386

Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada Yogyakarta 2014

KORELASI ANTARA EKSPRESI ENDOTHELIAL NITRIC OXIDE SYNTHASE (eNOS) TERHADAP FIBROSIS PERIVASKULER DAN INTERSTISIAL PADA MODEL FIBROSIS GINJAL DI MENCIT (Mus musculus)DENGAN METODE UNILATERAL URETERAL OBSTRUCTION (UUO) SKRIPSI

Untuk Memenuhi Sebagian Syarat Memperoleh Derajat Sarjana Kedokteran

Universitas Gadjah Mada

Disusun Oleh: VITO CAMBODIAWAN 11/312650/KU/14386

Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada Yogyakarta 2014

ii

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI

KORELASI ANTARA EKSPRESI ENDOTHELIAL NITRIC OXIDE SYNTHASE (eNOS) TERHADAP FIBROSIS PERIVASKULER DAN INTERSTISIAL PADA MODEL FIBROSIS GINJAL DI MENCIT (Mus musculus)DENGAN METODE UNILATERAL URETERAL OBSTRUCTION (UUO) Diajukan oleh: VITO CAMBODIAWAN 11/312650/KU/14386

Telah disetujui untuk diuji pada tanggal 7 November 2014 Pembimbing Materi,

dr. Nur Arfian, Ph. D NIP: 1120110064

Pembimbing Metodologi,

dr. Santosa Budiharjo, M. Kes, PA(K) NIP: 19630309 19803 1 002

Dosen Penguji,

dr. Dyah Samti Mayasari, Ph. D NIU: 1120120156

iii

HALAMAN PERNYATAAN SKRIPSI

KORELASI ANTARA EKSPRESI eNDOTHELIAL NITRIC OXIDE SYNTHASE (ENOS) TERHADAP FIBROSIS PERIVASKULER DAN INTERSTISIAL PADA MODEL FIBROSIS GINJAL DI MENCIT (Mus musculus)DENGAN METODE UNILATERAL URETERAL OBSTRUCTION (UUO) Oleh: VITO CAMBODIAWAN 11/312650/KU/14386 Adalah

karya

tulis

hasil

pekerjaan

saya

dan

bukan

merupakan jiplakan dari karya orang lain. Segala muatan yang bersumber dari penelitian lain yang saya gunakan sebagai acuan sepanjang pengetahuan saya telah ditulis sesuai tata cara dan etika penulisan karya tulis ilmiah. Apabila di kemudian hari terbukti bahwa pernyataan saya ini tidak benar, maka hal ini menjadi tanggung jawab saya sebagai penulis.

Yogyakarta, 15 Oktober 2014 Penulis

VITO CAMBODIAWAN 11/312650/KU/14386 iv

Kata Pengantar Alhamdulillahirabbil’alamin. Segala bentuk puji dan syukur penulis curahkan kepada Allah Subhanahu Wa Ta’ala karena

berkat

rahmat

dan

ridha-Nya,

penulis

dapat

menyelesaikan tugas akhir ini yang berjudul “Korelasi Ekspresi

eNOS

terhadap

Fibrosis

Perivaskular

dan

Interstisial pada Model Gagal Ginjal di Mencit (Mus musculus) dengan Metode Unilateral Ureteral Obstruction (UUO)”

dengan

paripurna

tanpa

adanya

kendala

yang

berarti. Dalam proses penelitian hingga penyusunan tugas akhir

ini,

bantuan

penulis

yang

merasa

berharga

banyak

dari

sekali

berbagai

mendapatkan

pihak

sehingga

proses keseluruhan dapat berlangsung lancar tanpa adanya kendala ingin

yang

bermakna.

mengucapkan

Pada

terima

kesempatan kasih

ini,

dan

penulis

memberikan

penghargaan yang setinggi-tingginya kepada: 1. dr. Nur Arfian, Ph. D selaku dosen pembimbing utama yang telah memberikan pembinaan dengan sabar dan ilmu-ilmu yang bermanfaat, semenjak awal penelitian hingga titik akhir penulisan tugas akhir ini. 2. dr. Santosa Budiharjo, M. Kes, PA(K) selaku dosen pembimbing metodologi penelitian yang telah

v

vi

membimbing penelitian berharga

penulis dan

dalam

memberikan

terkait

masalah masukan

sistematika

metodologi yang

begitu

penulisan

maupun

penelitian yang dilakukan. 3. dr. Dyah Samti Mayasari, Ph. D selaku dosen penguji yang telah memberikan masukan yang begitu berharga dan membuat penulis berpikir lebih kritis tentang permasalahan yang dihadapi pada penelitian yang dilakukan. 4. Ayah dan Ibu, Juwondo dan Emy Kipwati, kedua orang tua penulis yang selalu memberikan dukungan dan bimbingan 5. Teman-teman kelompok tugas akhir: Muhammad Gractya Nurfiantoro, Fahmi Zahwan Khinana, dan Rofiuddin Ali yang telah menjadi sahabat-sahabat yang luar biasa dan telah memberikan dukungan serta kerja sama yang hebat sehingga tugas akhir ini dapat diselesaikan denga paripurna. 6. Bapak Mulyono dari bagian Anatomi, Embriologi, dan Antropologi FK UGM yang telah membantu penulis dan tim peneliti dalam hal teknis-teknis penelitian sehingga

penelitian

lancar dan terkendali.

dapat

dilaksanakan

dengan

vii

7. Ucapan

terima

sampaikan

kasih

kepada

pertama:

secara

khusus

teman-teman

Nurkholis

penulis

tutorial

tahun

Syahru

Agung

Bramantyo,

Setiawan, Felix Gunawan, Githa Rizky, Dwi Astuti Dharma Putri, Agatha Tyas, Amanda Puteri, Stacy Gabriella,

dan

tutorial

Habella

tahun

Carissa;

kedua:

teman-teman

Muhammad

Gractya

Nurfiantoro, Fahmi Zahwan Khinana, Wegig Setiaji, Rachmanita Annisa

Yudelia

Rahmawati,

Sjarif, Dinisa

Diah

Diah

Dinar

Winari,

Utari, Kirantri

Larasati, dan Avie Avievah; teman-teman tutorial tahun ketiga: Zulfikar Ihyauddin, Adi Ariffianto, Muhammad Abror Rizani, Christiana Dita Natalia, Nadhira Nur Ratri, Elvi Aprillia Karamoy, David Tirawati Rengganis

Fadhillah, yang

Nisryna,

telah

banyak

dan

Anggraeni

membentuk

Ayu

penulis

selama proses studi dan telah menjadi sahabatsahabat yang istimewa di hati penulis. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada seluruh pihak yang telah memberikan kontribusi kepada penulis baik pada tahap penelitian maupun penyusunan tugas

akhir

yang

tidak

dapat

penulis

tuliskan

satu

viii

persatu. Biarlah Allah SWT yang memberikan balasan atas kebaikan kepada seluruh pihak yang terkait.

Penulis

DAFTAR ISI

Halaman Judul ..................................... ii Halaman Pengesahan ............................... iii Halaman Pernyataan ................................ iv Kata Pengantar ..................................... v Daftar Isi ........................................ ix Daftar Gambar .................................... xii Daftar Tabel ..................................... xii Daftar Lampiran .................................. xiv Intisari .......................................... xv Abstract ......................................... xvi BAB I PENDAHULUAN I.1. Latar Belakang I.2. Rumusan Masalah

............................. 1 ............................ 3

I.3. Tujuan Penelitian

.......................... 3

I.4. Keaslian Penelitian ......................... 4 I.5 Manfaat Penelitian

.......................... 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA II.1. Tinjauan Pustaka

.......................... 6

II.1.1. Teori Dasar Ginjal ..................... 6 II.1.1.1. Anatomi ginjal .................... 6

ix

x

II.1.1.2. Fisiologi Ginjal .................... 13 II.1.2. Pathogenesis Gagal Ginjal ............... 14 II.1.3. Sistem Nitric Oxide Synthase ............ 25 II.1.3.1. Nitric Oxide Synthase ............... 25 II.1.3.2. Endothelial Nitric Oxide Synthase ... 26 II.2. Kerangka Teori ............................ 30 II.3. Kerangka Konsep II.3. Hipothesis

.......................... 31

............................... 31

BAB III METODE PENELITIAN III.1. Rancangan Penelitian III.2. Materi Penelitian

.................... 32

....................... 32

III.2.1. Subyek Penelitian .................... 32 III.2.2 Jumlah Sampel Minimal ................. 32 III.2.3 Alat dan Bahan ........................ 33 III.3. Metode Penelitian

....................... 35

III.4. Variabel Penelitian ...................... 39 III.4.1. Variabel Bebas ....................... 39 III.4.2. Variabel Terikat ..................... 39 III.5. Metode Analisis Statistik ................ 39 III.6. Jadwal Penelitian ........................ 40 Bab IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN IV.1. Hasil penelitian .......................... 42 IV.1.1. Pengukuran Fraksi/Rasio Area Fibrosis Interstisial dan Perivaskular ......... 44 IV.1.2. Pengukuran Ekspresi eNOS .............. 45 IV.2. Analisis Statistik ........................ 47 IV.2.1. Uji Persebaran Data ................... 49

xi

IV.2.1.1. Uji Persebaran Data pada Kelompok Fibrosis Perivaskuler ........... 49 IV.2.1.2. Uji Persebaran Data pada Kelompok Fibrosis Interstisial ........... 50 IV.2.1.3. Uji Persebaran Data pada Kelompok Ekspresi eNOS/GAPDH ............. 50 IV.2.2. Uji Komparasi Nilai Rerata ............ 51 IV.2.2.1. Uji Komparasi Rasio Fibrosis Perivaskuler di kelompok SO, U7 dan U14 ......................... 51 IV.2.2.2. Uji Komparasi Fraksi Area Fibrosis Interstisial di Kelompok SO, U7, dan U14 ................. 51 IV.2.2.3. Uji Komparasi Ekspresi eNOS/GAPDH di Kelompok SO dan U14 .......... 51 IV.2.3. Uji Korelasi ......................... 52 IV.2.3.1. Uji Korelasi Fibrosis Perivaskuler terhadap Ekspresi eNOS/GAPDH ...................... 52 IV.2.3.2. Uji Korelasi Fibrosis Interstisial terhadap Ekspresi eNOS/GAPDH ...................... 52 IV.2.3.3. Uji Korelasi Fibrosis Interstisial terhadap Fibrosis Perivaskuler .................... 53 IV.3. Diskusi ................................... 54 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN V.1. Kesimpulan V.2. Saran

................................ 62

..................................... 62

Daftar Pustaka .................................... 63 Lampiran .......................................... 66

DAFTAR GAMBAR Gambar 2.1 Vaskularisasi dan Letak Anatomis Ginjal .. 7 Gambar 2.2 Segmen Ginjal ............................ 8 Gambar 2.3 Vaskularisasi Intra Parenkimal ........... 9 Gambar 2.4 Sistem Pelvicocalices .................... 11 Gambar 2.5 Nefron .................................. 12 Gambar 2.6 Proses Pembentukan Urin di Ginjal ....... 14 Gambar 2.7 Proses Biomolekuler Fibrosis Ginjal ..... 19 Gambar 2.8 Skema Efek Peningkatan Kadar Angiotensin II terhadap Akumulasi Komponen Matriks Ekstraseluler ........................... 20 Gambar 2.9 Pembentukan Myofibroblast ............... 22 Gambar 2.10 Transisi Mesenkimal dari Sel Asalnya ... 23 Gambar 2.11 Pembentukan Myofibroblast dari Perisit . 24 Gambar 4.1 Hasil Pengecatan Sirius Red pada Jaringan Ginjal ........................ 43 Gambar 4.2 Proses Pengolahan Gambar pada Pengukuran Fraksi Area Fibrosis Interstisial ....... 44 Gambar 4.3 Proses Pengolahan Gambar pada Pengukuran Rasio Fibrosis Perivaskuler ............ 45 Gambar 4.4 Ekspresi eNOS dan GAPDH ................. 46 Gambar 4.5 Grafik Perbandingan Ekspresi eNOS/GAPDH antara Kelompok SO dengan UUO 14 Hari ... 46 Gambar 4.6 Grafik Perbandingan Mean Rasio Fibrosis Perivaskuler ................................ 48

Gambar 4.7 Grafik Perbandingan Fraksi Area Fibrosis Interstisial ............................ 48 Gambar 4.8 Grafik Perbandingan Ekspresi eNOS/GAPDH ..... 49

xii

DAFTAR TABEL Tabel 3.1 Jadwal Penelitian ........................ 40 Tabel 4.1 Mean dan SE dari Fraksi Area Fibrosis Interstisial, Rasio Fibrosis Perivaskuler dan Rasio Ekspresi eNOS/GAPDH ........... 47 Tabel 4.2 Hasil Tes Statistik Saphiro-Wilk untuk Uji Persebaran Data Kelompok Fibrosis Perivaskuler ............................ 49 Tabel 4.3 Hasil Tes Statistik Saphiro-Wilk untuk Uji Persebaran Data Kelompok Fibrosis Interstisial ............................ 50 Tabel 4.4 Hasil Tes Statistik Saphiro-Wilk untuk Uji Persebaran Data Ekspresi eNOS/GAPDH ..... 50

xiii

DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1

Protokol RT-PCR ....................... 66

Lampiran 2

Protokol Elektroforesis ............... 67

Lampiran 3

Protokol Perhitungan Fraksi Area Fibrosis Interstisial ................. 69

Lampiran 4

Protokol Perhitungan Rasio Fibrosis Perivaskuler .......................... 70

Lampiran 5

Protokol Pewarnaan Sirius Red ......... 71

Lampiran 6

Hasil Analisis Statistik dengan Stata tentang Uji Persebaran Data, Uji Korelasi dan Uji Komparasi Nilai Rerata ........ 72

Lampiran 7

Lembar Ethical Clearance .............. 75

xiv

INTISARI Korelasi Antara Ekspresi Endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS) terhadap Fibrosis Perivaskuler dan Interstisial pada Model Gagal Ginjal di Mencit (Mus musculus)dengan Metode Unilateral Ureter Obstruction (UUO) Vito Cambodiawan1, Nur Arfian2, Santosa Budiharjo2 Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia 1Mahasiswa

Strata 1 Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah

Mada 2Dosen Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada Latar Belakang: insidensi gagal ginjal meningkat seiring waktu, menurut beberapa studi epidemiologi terakhir. Fibrosis ginjal merupakan kondisi akhir dari penyakit ginjal kronis. Kondisi ini memiliki karakteristik adanya aktivasi myofibroblast yang mengakibatkan fibrosis interstisial dan perivaskular. Endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS) merupakan suatu enzim dengan efek utama sebagai vasodilator yang mempunyai fungsi proteksi pada penyakit ginjal kronis. Tujuan: penelitian ini bertujuan memeriksa pola ekspresi eNOS pada model fibrosis dan mencari korelasi antara ekspresinya dengan proses fibrosis ginjal Metode: kami membuat model fibrosis ginjal pada mencit dengan latar belakang Swiss (3 bulan, 30-50 gr, n=16) menggunakan metode Unilateral Ureteral Obstruction (UUO). UUO dilakukan dengan meligasi ureter kiri melalui prosedur operasi baku dan mencit diterminasi pada hari ke-7 dan ke-14 paska ligasi. Kelompok Sham Operation (SO) berfungsi sebagai kontrol (operasi tanpa ligasi). Kami memeriksa ekspresi eNOS menggunakan cDNA dengan RT-PCR Hasil: UUO menginduksi fibrosis interstisial dan perivaskular pada hari ke-7 dan ke-14 secara signifikan (p