GUIA PARA EL DIAGNOSTICO DE LAS INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS POR EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA

November 13, 2017 | Autor: Franz Chambi | Categoría: Physics, Clinical Laboratory
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Descripción

GUIA PARA EL DIAGNOSTICO DE LAS INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS POR EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA

ANGELA PATRICIA FONSECA GUTIERREZ

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS ESPECIALIZACIÓN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA BOGOTÁ, NOVIEMBRE DE 2005

GUIA PARA EL DIAGNOSTICO DE LAS INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS POR EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA

ANGELA PATRICIA FONSECA GUTIERREZ

MONOGRAFIA Presentado como requisito parcial Para optar el título de ESPECIALISTA EN LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA

DIRECTOR Dra. DIANA PATIÑO C. M.Sc CODIRECTOR Dra. MARIA CLAUDIA ORTEGA. MD. Esp.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS ESPECIALIZACIÓN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA BOGOTÁ, NOVIEMBRE DE 2005

“Los criterios expuestos, las opiniones expresadas y conclusiones anotadas, son de responsabilidad del autor y no comprometen en nada a la “Pontificia Universidad Javeriana” (Artículo 9.18 del reglamento de trabajos de grado y de investigación. Agosto de 1989)

GUIA PARA EL DIAGNOSTICO DE LAS INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS POR EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA

ANGELA PATRICIA FONSECA GUTIERREZ

Dra. DIANA PATIÑO C. M.Sc DIRECTORA

DRA. MARIA CLAUDIA ORTEGA. MD. Esp CODIRECTORA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS ESPECIALIZACIÓN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA BOGOTÁ, NOVIEMBRE DE 2005

GUIA PARA EL DIAGNOSTICO DE LAS INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS POR EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA

ANGELA PATRICIA FONSECA GUTIERREZ

Dra. Diana Patiño C. M.Sc. COORDINADORA ESPECIALIZACIÓN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS ESPECIALIZACIÓN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA BOGOTÁ, NOVIEMBRE DE 2005

A Dios que siempre esta a mi lado guiándome. A mis padres al igual que a mis hermanos y a Sofí. A Ricardo porque sin todo su amor y apoyo nunca lo hubiera logrado..

AGRADECIMIENTOS

A la Doctora Diana Patiño por permitirme trabajar con ella y brindarme siempre su apoyo y amistad incondicional y a la Doctora Maria Claudia Ortega por su gran ayuda y paciencia durante el desarrollo de este trabajo. A todas las personas del laboratorio de Inmunológia y Hematología de la facultad de ciencias por toda su colaboración.

7

INDICE DE TABLAS Pág. Tabla 1.

Prevalencia de IDP en Antioquia Colombia 1994-2002.

8

Tabla 2.

Inmunodeficiencias ligadas a X.

9

Tabla 3.

Inmunodeficiencias autosomicas recesivas, Asociadas a inmunodeficiencia combinada severa.

10

Inmunodeficiencias autosomicas recesivas, no asociadas a inmunodeficiencia combinada severa.

11

Alteraciones en el extendido de sangre periférica observadas en las inmunodeficiencias primarias .

24

Tabla 4.

Tabla 5.

Tabla 6.

Deficiencias Inmunitarias que presentan resultados negativos para la prueba de hipersensibilidad retardada. 31

8

INDICE DE FIGURAS

Pág.

Figura 1.

Distribución de inmunodeficiencias primarias en 1428 pacientes reportados por la LAGID

Figura 2. Relación entre el sistema NADPH oxidasa que esta afectado en los pacientes con granulomatosis crónica Figura 3.

Flujograma para el diagnostico de IDP Universidad de Antioquia Colombia

7 13 22

Figura 4.

Patrón de electroforesis para hipogammaglobulinemia 25

Figura 5.

Fundamento de la Citometría de Flujo

29

Figura 6.

Análisis de puntos de LB (CD19+) por Citometría de Flujo

30

Figura 7.

Análisis de subpoblaciones de LT (CD4+/CD8+) por Citometría de Flujo.

32

Figura 8.

Prueba de liberación de cromio

34

Figura 9.

Análisis de células NK (CD16+/CD56+) por Citometría de Flujo.

Figura 10. Quimiotaxis en filtro.

38

9

TABLA DE CONTENIDO Pág 1. Definición del problema

1

2. Justificación

3

3. Objetivos

4

3.1 Objetivo General

4

3.2 Objetivos específicos

4

4. Marco Teórico

5

4.1 Generalidades de las inmunodeficiencias primarias

5

4.1.1 Epidemiología

6

4.2 Clasificación de las inmunodeficiencias primarias

9

4.3 Aspectos Clínicos de las inmunodeficiencias Primarias

12

4.3.1 Ligadas a X

12

4.3.1.1 Enfermedad granulomatosa Crónica (EGC)

12

4.3.1.2 Agamaglobulinemia ligada al sexo (enfermedad de Bruton)

13

4.3.1.3 Síndrome de Hiper IgM

14

4.3.1.4 Síndrome de Wiskott Aldrich

15

4.3.2 Autosomicas recesivas

16

4.3.2.1 Inmunodeficiencia combinada severa

16

4.3.2.2 Deficiencia de Adenosin Deaminasa (ADA)

17

4.3.2.3 Deficiencia de la Fosforilasa de Purina (PNP)

17

4.3.2.4 Deficiencia de Rag1 y Rag2

18

4.3.2.5 Deficiencia de Zap70

18

4.3.2.6 Deficiencia de Jak3

19

4.3.2.7 Deficiencia de Adhesión leucocitaria

19

4.3.2.8 Síndrome de Chediak Higashi

20

4.3.2.9 Síndrome linfoproliferativo autoinmune

20

10

4.3.2.10 Ataxia Telangiectasia

21

4.4 Pruebas diagnosticas

22

4.4.1 Pruebas de primera etapa

23

4.4.2 Pruebas de Segunda Etapa

26

4.4.2.1 Pruebas para medir la producción de anticuerpos

26

4.4.2.1.1 Cuantificación de Inmunoglobulinas

26

4.4.2.1.2 Medición de subclases de inmunoglobulinas

27

4.4.2.1.3 Isohemaglutininas

28

4.4.2.1.4 Producción de anticuerpos IgG específicos

28

4.4.2.1.5 Cuantificación de LB por citometría

28

4.4.2.2 Pruebas para medir la inmunidad mediada por LT

30

4.4.2.2.1 Hipersensibilidad cutánea retardada

30

4.4.2.2.2 Subpoblaciones de LT por citometría

31

4.4.2.2.3 Cuantificación de moléculas de superficie por citometría

32

4.4.2.2.4 Citotoxicidad mediada por LT CD8+ y NK

33

4.4.2.2.5 Cuantificación de células NK

34

4.4.4.3 Pruebas para medir la función de las células fagocíticas

35

4.4.4.3.1 Reducción de NBT

36

4.2.2.3.2 Medición de radicales libres de oxigeno

36

4.2.2.3.4 Quimiotaxis

37

4.2.2.3.5 Fagocitosis y actividad bactericida de los neutrófilos

38

4.2.2.3.6 Adherencia

39

4.2.2.4 Pruebas para medir sistema del complemento

39

4.2.2.4.1 Cuantificación de C3 y C4

39

4.2.2.4.2 Complemento hemolítico 50 (CH50)

40

11

4.2.2.4.3 CD59 en eritrocitos

40

4.2.3 Pruebas de tercera etapa

41

4.2.3.1 Pruebas para medir la producción de anticuerpos

41

4.2.3.1.1 Producción de anticuerpos in Vitro

41

4.2.3.1.2 Western blot para BtK, BLNK, NEMO

41

4.2.3.1.3 Análisis de polimorfismos conformacionales (SSCP)

42

4.2.3.2 Pruebas para medir la inmunidad mediada por LT

42

4.2.3.2.1 Linfoproliferación con mitógenos

42

4.2.3.2.2 Cuantificación de la producción de citocinas In Vitro

43

4.2.3.2.3 Western blot para ZAP-70, JAK3 y STAT-1

43

4.2.3.3 Pruebas para medir la función de células fagocíticas

44

4.2.3.3.1 Western blot para proteínas del sistema NADPH oxidasa

44

5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

45

6. BIBLIOGRAFIA

46

12

1. Definición del problema Las inmunodeficiencias primarias son un grupo heterogéneo de desordenes generalmente hereditarios que afectan la inmunidad celular (Linfocitos T) y humoral (Linfocitos B) especifica o los mecanismos de defensa no específicos del huésped (Células fagocíticas, citocinas, proteínas del complemento, entre otros). En la mayoría de los casos se manifiestan en el primer año de vida, no obstante, pueden presentarse a cualquier edad incluyendo adultos (Lim, 2004). Afectan individuos de ambos sexos. Sin embargo, en los menores de cinco años se presenta más en los varones con una relación 5:1 con respecto a las mujeres, mientras que en los adultos la frecuencia es muy similar (Montoya, 2004). La incidencia de las inmunodeficiencias primarias se ha incrementado de 10 casos reportados en 1969 a 1 en 10.000 nacidos vivos (Lim, 2004) y varia dependiendo del tipo especifico de inmunodeficiencia primaria y de otros factores como la etnia y la endogamia (Montoya, 2004). Las inmunodeficiencias primarias han sido clasificadas de acuerdo al defecto molecular que presentan en: Inmunodeficiencias ligadas a X e inmunodeficiencias autosomicas recesivas (Jones, 2000). Hasta el momento se han definido unas 100 enfermedades por deficiencia inmunológica. Pero, esta cifra puede ser aún mayor, si se tiene en cuenta que de los 40.000 genes estimados en el hombre, entre 1.000 y 10.000 podrían estar involucrados en el desarrollo y la función de las células del sistema inmune (Montoya, 2004). Las manifestaciones clínicas de las inmunodeficiencias primarias pueden ser muy variadas en función del defecto inmunológico, muchos niños inmunodeficientes pueden desarrollar síntomas como erupciones y alteraciones en la pigmentación

13

de la piel, anomalías en el desarrollo de la cara, del sistema esquelético y del corazón, entre otros. Los defectos que implican alguna alteración en la función de la célula de B dan lugar a infecciones pulmonares recurrentes que a menudo y según el compromiso de la respuesta humoral pueden terminar en septicemia bacteriana. La carencia de la producción de anticuerpos puede también aumentar la susceptibilidad a infecciones por enterovirus dando por resultado meningitis viral crónica y giardiasis entre otras. Las células T son esenciales para el control de la enfermedad viral y fúngica, no obstante, también proporcionan la función de colaboración a las células B mediante la liberación de citocinas como activadoras de la respuesta inmune de tipo humoral garantizando así,

una respuesta

adecuada y efectiva. Enfermedades como la inmunodeficiencia combinada severa (IDSC) de LT y LB da como resultado susceptibilidad aumentada a enfermedades por patógenos virales, fúngicos y bacterianos. Los pacientes con desórdenes de granulocitos son susceptibles a las enfermedades por Estaphylococcus y a infecciones por microorganismos Gram negativos (Lim, 2004). Como se puede observar los pacientes con algún tipo de inmunodeficiencia primaria, en especial los niños, son un blanco fácil para el desarrollo de infecciones recurrentes por diferentes tipos de patógenos (bacterias, virus, hongos y parásitos). Dado que el tratamiento de elección para el control de infecciones recurrentes es el uso de antibióticos se ha observado la generación de altas resistencias a los mismos (Lim, 2004).

14

2. Justificación En Colombia actualmente existen muy pocos laboratorios que realicen pruebas inmunológicas

especificas

para

el

diagnostico

de

pacientes

con

inmunodeficiencias primarias. Razón por la cual los pacientes se ven sometidos a estar por largos periodos en instituciones hospitalarias debido a las múltiples infecciones que presentan y que ponen en riesgo su vida. Esto se debe en gran parte a la poca información sobre la presentación clínica de las inmunodeficiencias primarias, al limitado acceso a las pruebas diagnosticas y a los pocos laboratorios especializados que existen actualmente en el país. El acceso a las pruebas especializadas de laboratorio permite al personal medico establecer un diagnostico acertado que podría prevenir o por lo menos disminuir la estancia de los pacientes en las instituciones hospitalarias, evitando así los altos costos con relación a la demora en el diagnostico y manejo adecuado, tanto para las entidades prestadoras de salud al igual que para el paciente y sus familiares Las razones previamente expuestas nos llevan a revisar cuáles son las pruebas de laboratorio que existen actualmente que puedan ser útiles para la confirmación diagnostica temprana por parte del personal medico que acompaña a pacientes con algún tipo de inmunodeficiencia primaria y de esta manera proporcionar una herramienta de consulta para llevar a cabo un diagnostico mas certero.

15

3. Objetivos 3.1 Objetivo General: Realizar una revisión de la literatura científica lo más actualizada posible sobre las pruebas del laboratorio de inmunología clínica útiles en el diagnostico de pacientes con inmunodeficiencias primarias. 3.2 Objetivos específicos 1. Describir los aspectos clínicos más relevantes de las inmunodeficiencias primarias. 2. Revisar y definir cuáles son las pruebas de primera etapa que debe solicitar el medico para aproximarse al diagnostico cuando hay sospecha de inmunodeficiencia primaria. 3. Definir cuales son las pruebas de segunda etapa útiles para llegar a un probable diagnostico de acuerdo al componente inmunológico que se presume se encuentra alterado. 4. Describir las pruebas de tercera etapa para llegar a un diagnostico molecular confirmado de los pacientes con inmunodeficiencia primaria.

16

4. Marco Teórico 4.1 Generalidades de las inmunodeficiencias primarias Las inmunodeficiencias primarias (IDP) son un grupo heterogéneo de desordenes generalmente de origen hereditario que afectan la inmunidad celular (Linfocitos T) y humoral especifica (Linfocitos B) o los mecanismos de defensa no específicos del huésped (células fagocíticas, citocinas, proteínas del complemento, entre otras). Estos desordenes en el sistema inmune causan una incrementada susceptibilidad a las infecciones y posible desarrollo de enfermedades autoimunes (Lim, 2004). En la mayoría de los casos se manifiestan en los cinco primeros años de vida (90%), no obstante, pueden presentarse a cualquier edad incluyendo adultos. Con respecto a su distribución por sexo casi todos los registros demuestran gran predominio masculino (60-80%) (Oleastro, 2001). Se estima que 1 de cada 10.000 niños nacidos vivos presentan a lo largo de su infancia algún tipo de inmunodeficiencia primaria (Lim, 2004). Las inmunodeficiencias primarias han sido clasificadas de acuerdo al defecto molecular que presentan en: Inmunodeficiencias ligadas a X e inmunodeficiencias autosomicas recesivas (Jones, 2000). Hasta el momento se han definido unas 100 enfermedades por deficiencia inmunológica. Sin embargo, esta cifra puede ser aún mayor, si se tiene en cuenta que de los 40.000 genes estimados en el hombre, entre 1.000 y 10.000 podrían estar involucrados en el desarrollo y la función de las células del sistema inmune (Montoya, 2004). Las manifestaciones clínicas de las inmunodeficiencias primarias pueden ser muy variadas en función del defecto inmunológico, en algunos niños se presenta desmedro en el crecimiento y en el desarrollo como consecuencia de las

17

infecciones que presentan a repetición. Otros síntomas que podrían estar asociados a las inmunodeficiencias primarias son; erupciones y alteraciones en la pigmentación de la piel, anomalías en el desarrollo de la cara, del sistema esquelético y del corazón. Los defectos que implican alguna alteración en la función de los linfocitos B dan lugar a infecciones pulmonares

recurrentes, a

menudo relacionados con septicemia bacteriana. La carencia de la producción de anticuerpos puede también aumentar la susceptibilidad a las infecciones por enterovirus dando como resultado el desarrollo de meningitis viral crónica y giardiasis gastrointestinal. Las células T son esenciales para el control de la enfermedad viral y fúngica ya que colaboran con

las células B mediante la

liberación de citocinas que promueven una respuesta inmune adecuada y efectiva. Así, desórdenes como la inmunodeficiencia combinada severa de LT y LB da como resultado una mayor susceptibilidad a los patógenos virales, fúngicos y bacterianos (Lim, 2004). 4.1.1 Epidemiología: La prevalecía de pacientes con inmunodeficiencias primarias se ha incrementado de un caso reportado en 1969 a 1 por cada 10.000 nacidos vivos, este incremento se puede deber particularmente a que son enfermedades de las cuales se sospecha más en la actualidad y al mejoramiento de las pruebas utilizadas en la detección de anormalidades inmunológicas. Algunas de estas pruebas permiten la identificación de algunas mutaciones en los genes responsables de estos desordenes lo que permite detectar mas fácil y rápidamente a este tipo de pacientes (Lim, 2003). En la mayoría de los casos las inmunodeficiencias primarias se manifiestan en los primeros cinco años de vida (90%), pero pueden presentarse a cualquier edad incluyendo adultos. Con respecto a su distribución por sexo casi todos los registros demuestran gran predominio masculino (60-80%) (Oleastro, 2001).

18

En cuanto a la prevalencia de inmunodeficiencias primarias se encuentran diferentes reportes como el publicado por la asociación latinoamericana de inmunodeficiencias primarias LAGID en 1998 en el que se encontró que las inmunodeficiencias primarias por defectos en los anticuerpos son las más frecuentes (Zelazko, 1998). Desordenes de fagocitos (9%)

Inmunodeficiencia combinada severa (5%)

Deficiencias de Complemento (2%)

Anormalidades asociadas a defectos en los granulocitos (8%)

Síndromes asociados con otras anormalidades (18%)

Deficiencia de anticuerpos (58%)

Figura 1. Distribución de inmunodeficiencias primarias en 1428 pacientes reportados por la LAGID (Zelazko, 1998)

En Colombia actualmente los únicos datos de prevalencia de inmunodeficiencias primarias, son los publicados por el Grupo de Inmunodeficiencias Primarias de la Universidad de Antioquia, en este estudio se tomaron pacientes a los cuales se les hizo seguimiento por varios años, obteniéndose que las deficiencias de anticuerpos son las mas predominantes en nuestro país seguidas por las

19

deficiencias

combinadas,

estos

datos

concuerdan

con

los

encontrados

mundialmente en otros estudios como los de LAGID en 1998. (Tabla 1) Tabla 1. Prevalencia de IDP en Antioquia Colombia 1994-2002 (Montoya, 2002) Fenotipo Predominante

Hombres

Mujeres

Total

Hipoagamaglobulinemia transitoria de la infancia

10

4

14

Inmunodeficiencia común variable

2

9

11

Agamaglobulinemia congénita

8

0

8

Déficit de IgA

2

1

3

Síndrome de hiper IgM

1

1

2

Deficiencia de anticuerpos con Ig normales

0

0

1

Inmunodeficiencia común variable con timoma

1

0

1

Deficiencias predominantes de anticuerpos

Subtotal (%)

40 (40.8)

Deficiencias combinadas Inmunodeficiencia Combinada severa

5

8

13

Inmunodeficiencia combinada no severa

2

0

2

inmunodeficiencia celular con Igs normales

1

5

6

Subtotal (%)

21 (21.5)

Deficiencias celulares y de anticuerpos asociadas con otros defectos mayores Candidiasis mucocutanea crónica

4

2

6

Síndrome de Wiskott Aldrich

4

0

4

Ataxia Telangiectasia

1

1

2

Anomalía de DiGeorge

0

2

2

Enanismo con extremidades cortas

1

0

1

Subtotal (%)

15 (15.3)

Síndromes de inmunodeficiencia asociados con disfunción de los fagocitos Síndrome de hiper IgE con infecciones recurrentes

6

4

10

Síndrome de Chediak Higashi

2

3

5

Subtotal (%)

15 (15.3)

Defectos Primarios de las células fagocíticas Enfermedad Granulomatosa Crónica

4

0

4

Neutropenia Congénita Severa

1

1

2

Subtotal (%)

6 (6.1)

Deficiencias del complemento Edema angioneurotico hereditario

0

1

1

55

43

Subtotal (%)

1 (1.0)

Total

20

98 100%

4.2 Clasificación de las inmunodeficiencias primarias El aumento reciente sobre el conocimiento de los defectos moleculares de muchas de las inmunodeficiencias primarias ha llevado a grandes avances en el diagnóstico y manejo de estas patologías permitiendo clasificarlas de acuerdo al tipo de defecto genético que presentan en: Inmunodeficiencias ligadas a X (Tabla 2) e inmunodeficiencias autosomicas recesivas que a su vez se subclasifican en inmunodeficiencia

combinada

severa

Tabla

3)

y

en

no

asociadas

a

inmunodeficiencia combinada severa (Tabla 4) Tabla 2. Inmunodeficiencias ligadas a X (Jones, 2000) Desorden (año de definición del defecto molecular)

Enfermedad granulomatosa crónica ligada a X (1986)

Agamaglobulinemia ligada a X (1993)

Localización cromosomica

Gen

Defecto

Prueba diagnostica

Componente de fagocitosis NADPH

Nitro azul de tetrazolio (NBT), inmunoblot para gp91phox, análisis de mutaciones

Xp21

gp91phox

Xq22

Tirosin Kinasa de Bruton

Vía de señalización intracelular esencial para la maduración de células pre-B

Inmunoblot para Btk o análisis por citometría de flujo, análisis de mutaciones

Expresión de CD154 sobre LT activados por citometría de flujo, análisis de mutaciones

Expresión de CD145 sobre LT activados por citometría de flujo, análisis de mutaciones

Inmunodeficiencia combinada severa ligada a X (1993)

Xq13

Cadena común γ

Componentes de los receptores para IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, desarrollo de células T y NK, función de células T y B

Síndrome de Hyper-IgM (deficiencia de CD40L) (1993)

Xq26

CD40L (CD154)

Cambio de Isotipo, función de LT

Síndrome de Wistkott-Aldrich (1994)

Xp11

WASP

Síndrome linfoproliferativo ligado a X (Síndrome de Duncan) (1998)

Xq25

SAP

Regulación de la respuesta de LT a EBV y otras infecciones virales

Análisis de mutaciones, Expresión de SAP

Deficiencia de properdina (1992)

Xp21

Properdina

Componente terminal del complemento

Niveles de Properdina

21

Formación del Expresión de WASP por citoesqueleto, movilidad y inmunoblot, análisis de trafico de células inmunes mutaciones

Tabla 3. Inmunodeficiencias autosomicas recesivas, Asociadas a inmunodeficiencia combinada severa (Jones, 2000) Desorden (año de definición del defecto molecular)

Deficiencia de adenosin deaminasa (ADA) (1983)

Deficiencia de la fosforilasa de purina (PNP) (1987)

Localización cromosomica

Gen

20q12-13

Adenosin deaminasa

Enzima en la vía de las purinas, acumulación de metabolitos tóxicos

Niveles de ADA y metabolitos en eritrocitos, análisis de mutaciones

14q11

Fosforilasa de purina

Enzima en la vía de las purinas, acumulación de metabolitos tóxicos

Niveles de PNP y metabolitos en eritrocitos, análisis de mutaciones

Defectos en la recombinación de DNA afectando inmunoglobulinas y el gen del receptor de de LT

Análisis de las mutaciones en RAG1 y RAG2

Función y señalización del receptor de LT

Intensidad de fluorescencia de CD3, análisis de mutaciones

Defecto

Prueba diagnostica

Deficiencia del gen de activación de la recombinasa (RAG 1 y 2) (1996) Síndrome de Omenn

11p13

RAG1 y RAG2

Deficiencia en el receptor de LT (1987)

11q23

CD3γ/CD3ε

Deficiencia de Zap70 (1994)

2q12

Zap70

Función de LT, selección de Expresión y activación de LTCD8+ durante el Zap70, análisis de desarrollo del timocito mutaciones

Deficiencia de JAK3 (T-B+NKSCID) (1995)

19p13

JAK3

Receptor de señalización de Il-2, Il-4, IL-7, IL-9, IL-15, desarrollo de LT y NK, Función de LT y LB

Activación y expresión de JAK3, análisis de mutaciones

Deficiencia en el receptor de IL7 (1998)

5p13

Receptor α de IL-7

Rol esencial en desarrollo y función de LT

Expresión de IL-7α por citometría, análisis de mutaciones

22

Tabla 4. Inmunodeficiencias autosomicas recesivas, no asociadas a inmunodeficiencia combinada severa (Jones, 2000) Desorden (año de definición del defecto molecular)

Localización cromosomica

Gen

Defecto

Prueba diagnostica

CD11/CD18

Análisis de la expresión de Defectos en la adhesión y CD18/CD11 por migración de leucocitos citometría, análisis de mutaciones

p47phox, p67phox, p22phox

Defectos en la bolsa respiratoria y muerte intracelular de fagocitos

1q42

LYST

Anormalidades en los Inclusiones gigantes en microtubulos mediado por los granulocitos, análisis las proteínas lisosomales de mutaciones circulantes

Deficiencia de MHC clase II (1993) (1998) (1995) (1997)

16p13, 19p12, 1q21, 13q13

CIITA (MHC2TA), RFXANK, RFX5, RFXAP

Defecto en la regulación transcripcional de la expresión de la moléculas de MHCII

Expresión de MHCII, análisis de mutaciones

Deficiencia de MHC clase I (1994) (1999)

6p21 6p21

TAP2 TAP1

Defecto en el ensamblaje del péptido y en la presentación de las moléculas de MHCI

Expresión de MHCI

APT1 (Fas)

Defectos en la apoptosis de Linfocitos

expresión de Fas, ensayos de apoptosis, análisis de mutaciones

ATM

Control del ciclo celular y respuesta de daño de DNA

Sensibilidad del DNA a la radiación, análisis de mutaciones

Receptor de Interferón γ, IL-12 p40, Receptor β1 de IL-12

Defecto en la producción de Interferón γ y en la función de señalización

Expresión del receptor de Interferón γ, expresión de IL-12, Expresión del receptor de IL-12, análisis de mutaciones

Deficiencia de adhesión leucocitaria tipo I (1987)

Enfermedad granulomatosa crónica (1990) (1990) (1988)

Síndrome de Chediak Hisgashi (1996)

Síndromes autoinmunes Linfoproliferativos (ALPS) (1995)

21q22

7q11, 1q25, 16p24

10q24

11q22

Expresión de p47phox, p67phox, p22phox por inmunoblot, análisis de mutaciones

Ataxia telangiectasia (1995)

Susceptibilidad inherente a micobacterias (1996) (1998) (1998)

6q23 5q31 19p13

23

4.3 Aspectos Clínicos de las inmunodeficiencias Primarias 4.3.1 Ligadas a X 4.3.1.1 Enfermedad granulomatosa Crónica (EGC) La Enfermedad Granulomatosa Crónica (EGC) es la inmunodeficiencia primaria por deficiencia de fagocitos más comúnmente diagnosticada, con una mayor prevalencía en hombres que en mujeres (Cooper, 2003). La EGC es causada por un defecto funcional en varios componentes de sistema NADPH oxidasa de los fagocitos (Lim, 2004). Existen dos patrones de herencia: el primero ligado al sexo, por mutación en el gen de la phox 91 (Xp21.1), representa la forma más frecuente (65%), de comienzo más temprano y curso más severo y el segundo; autosómico recesivo por mutaciones en los genes de la phox 22 (16q24), phox 47 (7q11.23) y phox 67 (1q25) (Lim, 2004). Las manifestaciones clínicas comprenden infecciones recurrentes severas y supurativas; abscesos del tejido subcutáneo, el hígado y los pulmones, gingivoestomatitis,

periodontitis,

adenitis

piógena

supurativa,

osteomielitis

multifocal y enfermedad diarreica recurrente. La mala regulación en la respuesta inflamatoria lleva a la formación de granulomas en muchos órganos que pueden producir obstrucción de los aparatos digestivo y genitourinario (Rugeles, 2004). El defecto molecular de la EGC es una deficiencia en la bolsa respiratoria. Los componentes estructurales de sistema oxidativo NADPH se requieren para la generación de superoxido y otras especies reactivas importantes en la fagocitosis de microorganismos. El sistema NADPH se compone de cuatro componentes, 2 de ellos (phox 91 y phox 22) ubicados en la membrana plasmática del fagocito formando el citocromo b558 y otros dos (phox 47 y phox 67) ubicados en el citoplasma. La activación del sistema requiere la movilización de los componentes

24

citoplasmáticos hacia la membrana y su acople al citocromo. La ausencia o disfunción de alguno de estos componentes imposibilita el correcto funcionamiento enzimático

Figura 2. Relación entre el sistema NADPH oxidasa que esta afectado en los pacientes con granulomatosis crónica (Mackay, 2000).

4.3.1.2 Agamaglobulinemia ligada al sexo (enfermedad de Bruton) La Agamaglobulinemia ligada a X fue la primera inmunodeficiencia primaria identificada

en

1952

por

Bruton,

por

lo

que

también

es

llamada

agammaglobulinemia de Bruton, en esta enfermedad hay ausencia de células B en sangre periférica y órganos linfoides debido a un defecto molecular que imposibilita la supervivencia de la célula B (Rugeles, 2004). Esta enfermedad afecta exclusivamente a varones, inicia sus manifestaciones clínicas más tempranamente que otras formas de deficiencias de anticuerpos. Las principales

25

manifestaciones clínicas son las infecciones recurrentes, pero además de ellas los pacientes pueden presentar cuadros de artritis crónica o cuadros semejantes a dermatomiocitis. Las infecciones virales son controladas normalmente en su mayoría con excepción de infecciones por enterovirus del sistema nervioso central (meningoencefalitis crónica). El examen físico muestra la ausencia de ganglios linfáticos

superficiales

y

amígdalas.

Las

inmunoglobulinas

séricas

son

indetectables o están francamente disminuidas (por lo general la IgG es menor de 200 mg/dl) y los linfocitos B en sangre periférica están ausentes o muy disminuidos (menor al 2 %). La inmunidad celular no está afectada (Oleastro, 2001). Esta deficiencia está determinada por una alteración en la proteína kinasa Btk (Bruton tirosin kinasa), proteína relacionada con la maduración y proliferación del linfocito B. La falta de actividad de esta proteína como consecuencia de mutaciones en el gen que la codifica genera un bloqueo en la maduración a nivel del estadio de células pre-B (Jones, 2000). 4.3.1.3 Síndrome de Hiper IgM Se caracteriza por presentar tanto niveles normales como muy elevados de IgM con marcada hipogammaglobulinemia IgG e IgA. Además de las infecciones recurrentes por gérmenes extracelulares encapsulados, los pacientes suelen presentar infecciones por Pneumocystis carinii, episodios de neutropenia, manifestaciones de autoinmunidad (citopenias hemáticas, artritis) y mayor predisposición a las neoplasias de estirpe linfoide (linfomas y leucemias). Estos pacientes comúnmente presentan

adenomegalias, hipertrofia amigdalina y

hepatoesplenomegalia. El recuento de linfocitos B circulantes es normal y la inmunidad celular generalmente está conservada (Oleastro, 2001).

26

La falla molecular responsable se ubica en el ligando de CD40, molécula normalmente expresada en linfocitos T activados, imprescindible para el cambio de isotipo de IgM a IgG e IgA. Mutaciones en el gen de esta molécula condicionan la falta de síntesis o la síntesis de una molécula no funcional (Jones, 2004). 4.3.1.4 Síndrome de Wiskott Aldrich El síndrome de Wiskott Aldrich (WAS) es una enfermedad recesiva ligada al sexo con una incidencia mundial de 4 enfermos por cada millón de niños varones nacidos vivos (Chien, 2004). Se manifiesta por eczema, infecciones recurrentes y trombocitopenia (Lim, 2004). Las manifestaciones suelen aparecer durante el primer año de vida. El eczema adquiere las características de una dermatitis atópica

con

gran

tendencia

hemorrágica.

Las

infecciones

se

localizan

principalmente en el tracto respiratorio tanto superior (conjuntivitis, sinusitis, otitis media) como inferior (bronquitis, neumonías). Los gérmenes responsables son especialmente

microorganismos

piógenos

(Streptococcus

pneumoniae,

Haemophilus influenzae). Las infecciones virales por herpes simple o por varicela zoster suelen ser severas y condicionar una alta morbimortalidad. El cuadro clínico puede completarse con manifestaciones de autoinmunidad como vasculitis, glomerulonefritis o anemias (Lim, 2004). Las concentraciones de IgM en suero son reducidas, mientras que las concentraciones de IgA e IgE son elevadas y la IgG se encuentra normal (Lim, 2004). En algunos casos se puede encontrar un déficit de las subclases de IgG2 e IgG4. La formación de anticuerpos, especialmente a polisacáridos capsulares bacterianos se encuentra defectuosa, además los pacientes presentan una pobre respuesta a antígenos de tipo proteico

(Lim, 2004) como isohemaglutininas y

anticuerpos anti-neumococo (Oleastro, 2001).

27

El gen responsable del síndrome del Wiskott Aldrich codifica para la proteína WASP localizada en el cromosoma Xp11.22-p11.23, se han identificado diferentes mutaciones localizadas a través del gen, pero la más común envuelve la sustitución de nucleótidos. La interacción entre la proteína WASP el Cdc42 de la familia GTPasa Rho y el complejo organizador del citoesqueleto Arp2/3 es muy importante en la transducción de señales que cuando presentan algún tipo de alteración se refleja en problemas a nivel de señalización, polarización, movilidad y fagocitosis de las células (Chien, 2004). 4.3.2 Autosomicas recesivas 4.3.2.1 Inmunodeficiencia combinada severa Esta forma se presenta solamente en varones y se debe a la falta total de diferenciación de precursores linfoides pretímicos. Como consecuencia de ello se observa una marcada linfopenia con ausencia de linfocitos T maduros. Los linfocitos B, que se encuentran presentes en número normal o incluso aumentado; son funcionalmente deficientes (agammaglobulinemia). Las células NK están ausentes o francamente disminuidas

con pobre actividad citotóxica (Bonilla,

2003). El defecto molecular responsable se encuentra en la cadena gamma común, cadena que comparten los receptores para varias citocinas (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15). Esta cadena se encuentra asociada a la tirosina kinasa JAK3, unión necesaria para transmitir la señal de activación celular hacia el interior de la célula. Mientras que la disfunción de los receptores para IL-2 e IL-7 genera el bloqueo en el desarrollo de LT, la alteración del receptor para la IL-15 sería la responsable de la deficiencia de células NK. Diferentes tipos de mutaciones en el gen que codifica para la cadena gamma del receptor de IL-2 generan alteraciones en la transcripción necesaria para una síntesis proteica normal (Lim, 2004).

28

4.3.2.2 Deficiencia de Adenosin Deaminasa (ADA) La deficiencia de adenosina deaminasa (ADA), representa aproximadamente el 20 % de todos los casos de Inmunodeficiencia combinada severa (IDCS) y el 40 % de los de transmisión autosómica recesiva. ADA, es una enzima que interviene en el metabolismo de las purinas, transforma reversiblemente la adenosina en inosina y 2' - deoxiadenosina (dAdo) en 2' deoxiinosina. La acumulación de adenina y dAdo tiene efectos tóxicos sobre los linfocitos, especialmente en estadíos inmaduros (timocitos). Además, Ado es fosforilado en dATP, el cual ejerce un efecto inhibitorio sobre la ribonucleótido reductasa, enzima requerida para la síntesis del ADN. La enzima S-adenosil – homocisteína hidrolasa (SAH hidrolasa), enzima necesaria para la normal metilación del ADN, también se ve inactivada por la acumulación de estos sustratos. En el 85 % de los casos de deficiencia de ADA las manifestaciones clínicoinmunológicas corresponden a una IDCS. Se observa una alta incidencia de alteraciones neurológicas y, en el 50 % de los casos, una displasia osteocondral visible radiológicamente. Estos individuos presentan una marcada linfopenia con compromiso variable de las células NK. El diagnóstico se establece documentando una actividad enzimática deficiente en eritrocitos y linfocitos y/o midiendo las altas concentraciones de dATP (Jones, 2004). 4.3.2.3 Deficiencia de la Fosforilasa de Purina (PNP) La fosforilasa de purina (PNP) juega un papel importante en la vía salvaje de purina, la deficiencia de PNP es una enfermedad autosomica recesiva que causa una deficiencia severa de LT con deficiencias variables en la inmunidad humoral, los pacientes con deficiencia de PNP presentan infecciones bacterianas, virales y fúngicas recurrentes usualmente en los primeros años de vida

29

4.3.2.4 Deficiencia de Rag1 y Rag2 Se hereda en forma autosómica recesiva y resulta de un defecto en el proceso de recombinación de los fragmentos VDJ en la recombinación genética de las inmunoglobulinas, a consecuencia de esto se interrumpe totalmente la diferenciación de linfocitos T y B. La diferenciación de células NK no se ve afectada por lo cual el número y la funcionalidad de estas células se encuentra conservado (Jones, 2004). Rag1 y Rag2 (recombinase-activating gene 1 ó 2) forman un complejo con actividad endonucleasa requerido para iniciar el proceso de recombinación de los genes VDJ durante la formación de los receptores para antígenos tanto de los linfocitos T (TCR) como de los B (BCR). Estos receptores son necesarios para transmitir señales de sobrevida en precursores linfoides durante el desarrollo de las células T y B. Distintas mutaciones en los genes Rag1 o Rag2 son responsables del desarrollo de la enfermedad (Jones, 2004). 4.3.2.5 Deficiencia de Zap70 Esta deficiencia se transmite en forma autonómica recesiva. La proteína ZAP 70 (zeta associated protein 70), proteína kinasa expresada exclusivamente en linfocitos T y células NK, juega un papel esencial en el proceso de selección positiva y negativa durante la maduración tímica de los linfocitos T, principalmente para los linfocitos que expresan el marcador CD8. Se encuentra unida a la cadena ζ del complejo CD3 interviniendo en la señalización de estas células. Mutaciones en el gen ZAP 70 (o SRK) generan un cuadro de inmunodeficiencia celular variable en cuanto a su severidad. Es Característico encontrar en los niños valores normales de linfocitos T CD3+ con predominio de CD4+ y ausencia o

30

disminución marcada de los CD8+. A pesar de encontrarse en número total normal o incluso elevado,

estos linfocitos CD4+ son incapaces de responder a la

estimulación in vitro frente a mitógenos específicos o células alogénicas. Los linfocitos B y las células NK son normales tanto en número como en función (Lim, 2001). 4.3.2.6 Deficiencia de Jak3 Esta enfermedad se transmite con un patrón de herencia autosómico recesivo. El defecto molecular se encuentra en la proteína kinasa JAK 3 (Janus associated kinase 3), proteína asociada al dominio intracelular de la cadena gamma común que interviene en la transducción de la señal generada tras la unión de las citocinas a sus respectivos receptores, señal necesaria para que se complete el desarrollo de linfocitos. 4.3.2.7 Deficiencia de Adhesión leucocitaria Esta enfermedad de se debe a la falta de expresión de un grupo de proteínas expresadas en la superficie celular denominadas moléculas de adhesión (LAD-1 y LAD-2). LAD-1, de herencia autosómica recesiva, comprende defectos en las cadenas β (CD18) de las moléculas LFA1 (CD11a-CD18), CR3 (CD11b-CD18) y glucoproteína 150-95 (CR4 o CD11c-CD18). La edad de comienzo de las manifestaciones clínicas y su gravedad dependen del grado de expresión de las moléculas. Las formas severas (menos del 1% de expresión) presentan sus primeras manifestaciones en el período neonatal con retardo en la caída del cordón umbilical y posterior onfalitis, piodermitis necrotizantes, neumonía o sepsis por S. aureus, Pseudomonas aeruginosa o Escherichia coli. Las formas moderadas (expresión entre 10-20%) se presentan en edades más avanzadas con otitis media aguda, fístulas de tejido celular subcutáneo (especialmente perianales) y periodontitis. Es típico encontrar lesiones carentes de pus y a nivel hematológico se encuentra una marcada neutrofilia.

31

El diagnóstico se confirma demostrando por citometría de flujo la ausencia o disminución de la expresión de la molécula CD18 en la superficie celular. Las formas severas tienen un curso fatal en los primeros años de vida por lo cual deben ser sometidas a un transplante de medula ósea alogénico. Para LAD-2 se ha visto un número reducido de pacientes con manifestaciones similares a LAD 1, acompañadas de talla baja y retardo mental, en los que se ha encontrado deficiencia de otra molécula denominada Sialil-Lewis X (CD15s) (Oleastro, 2001). 4.3.2.8 Síndrome de Chediak Higashi Es un desorden autosomico recesivo de todos los gránulos lisosomales contenidos en las células con características clínicas que envuelven los sistemas hematopoyeticos y neurológicos (Mackay, 2000). Esta enfermedad es transmitida como un rasgo autosomico recesivo que se origina por mutaciones del gen chs1 que codifica para la proteína LYST, esta proteína es muy importante para la regulación del transporte lisosomal y la función del citoesqueleto. Este defecto impide la formación normal de los fagolisosomas y de los melanosomas, vesículas importantes en el proceso de fagocitosis (Rugeles, 2004). Las características clínicas de este síndrome son infecciones bacterianas recurrentes especialmente por S. aureus y estreptococos β-Hemolíticos, defectos en los nervios periféricos, retardo mental, albinismo ocular y cutáneo parcial, disfunción plaquetaria y enfermedad periodontal severa (Mackay, 2000). 4.3.2.9 Síndrome linfoproliferativo autoinmune Se origina por mutaciones en el gen que codifica para la proteína adaptadora SH2D1A que acopla moléculas que se encuentran en la superficie de los leucocitos e interviene en las vías de señalización intracelular. La función principal de esta molécula parece ser la regulación negativa de las señales de activación de los linfocitos T, por lo tanto en estos pacientes se describe una proliferación linfocitaria descontrolada.

32

La enfermedad se manifiesta generalmente antes de los 5 años, los niños afectados no presentan sintomatología hasta que desarrollan alguna infección por microorganismos intracelulares como el virus de Epstein Barr el desencadenante mas común de la sintomatología (Rugeles, 2004). 4.3.2.10 Ataxia Telangiectasia La ataxia telangiectasia es una enfermedad de transmisión autosómica recesiva caracterizada por presentar ataxia cerebelosa, telangiectasias oculo- cutáneas e infecciones recurrentes. Estas últimas se presentan por lo general en forma de otitis, bronquitis purulentas o neumonías. La ataxia que suele hacerse evidente cuando el niño empieza a caminar, tiene curso progresivo llevando a una gran incapacidad. Las telangiectasias aparecen a edades variables, por lo general antes de los 5 años de edad en conjuntiva bulbar y/o pabellones auriculares (Oleastro, 2001). Es característico encontrar la α-feto proteína elevada en un 95 % de los casos. La IgG puede encontrarse dentro de los valores normales o incluso estar disminuida, y puede estar asociada o no a deficiencias de IgG2 o IgG4. En la gran mayoría de los casos la IgA esta ausente al igual que la IgE. La IgM puede estar normal o elevada. La inmunidad celular, inicialmente poco afectada, va mostrando con el tiempo una franca linfopenia (Oleastro, 2001). Una característica muy particular de este cuadro es la hipersensibilidad a las radiaciones ionizantes y la falla en los mecanismos normales de reparación del ADN responsables de rupturas cromosómicas que involucran particularmente a los genes que codifican para los receptores para el antígeno en el linfocito T y para las inmunoglobulinas de superficie en los linfocitos B. El pronóstico es desfavorable y actualmente no se cuenta con un tratamiento adecuado. Los

33

pacientes suelen fallecer en la segunda década de sus vidas por secuelas pulmonares o enfermedad linfoproliferativa (Lim, 2001). 4.4 Pruebas diagnosticas La valoración de la inmunocompetencia en un individuo con sospecha de inmunodeficiencia primaria requiere de un análisis cuantitativo, cualitativo o estructural y de estudios funcionales que permitan detectar alteraciones en sus mecanismos de defensa. De acuerdo con el mecanismo de defensa que se quiere evaluar existen diferentes estudios que se pueden organizar por niveles de complejidad (Figura 3) (Rugeles, 2004)

Paciente con sospecha De padecer Inmunodeficiencia

Evaluación clínica + Pruebas de primera etapa

Estudios de segunda etapa

Deficiencias en la producción de anticuerpos

•Dosificación de Igs •Determinación de LB y LT CD19 •Isohemaglutininas •Subclases IgG •Producción de Antcs Específicos

Estudios de tercera etapa

• Producción anticuerpos in Vitro • Westren blot: Btk, etc •SSCP y Secuenciamiento

Deficiencias en la Inmunidad mediada por LT

Deficiencias en las células Fagocíticas

•Reducción NBT en placa •Explosión respiratoria por citometría •Beta 2 integrinas en granulocitos •Quimiotaxis en agarosa

•Descartar Infección por VIH •Hipersensibilidad retardada cutánea •Subpoblaciones de linfocitos: MHC, CD25 •Dosificación de Inmunoglobulinas

Estudios de tercera etapa

Deficiencias del complemento

•C3 y C4 Séricos •CH50 •Inhibidor de C1 estereasa •CD59 en eritrocitos

Estudios de tercera etapa

• Proliferación y citocinas In Vitro •Determinar enzimas: ADA, PNP •Westren blot: ZAP-70, JAK3, etc •SSCP y Secuenciamiento

• Westren blot: Proteínas NADPH oxidasa •SSCP y Secuenciamiento

Figura 3. Flujograma para el diagnostico de IDP Universidad de Antioquia Colombia (Rugeles, 2004)

34

4.4.1 Pruebas de primera etapa Adicional a los datos de la historia clínica y el examen físico, los análisis paraclínicos básicos aportan información valiosa para orientar los estudios posteriores. Los estudios de primera etapa para estudiar inmunocompetencia son: Cuadro hematico con velocidad de sedimentación globular, frotis de sangre periférica (FSP) con recuento plaquetario, electroforesis de proteínas sericas y estudios imagenológicos (Rugeles, 2004). El FSP es el estudio de las células sanguíneas por medio de la observación en un microscopio de preparaciones coloreadas, ha sido uno de los exámenes más antiguos e importantes en el laboratorio clínico y su práctica es de gran utilidad en hematología ya que permite visualizar la morfología celular, estimar el número de células en sangre periférica y determinar la eventual presencia de elementos atípicos. Los resultados obtenidos con este estudio son un reflejo del funcionamiento de la médula ósea y de los factores que influyen en las diferentes poblaciones celulares. Este método permite la evaluación del estado de maduración, las características tintoriales, el contenido de los gránulos, las inclusiones y formas celulares, todo lo cual se correlaciona con la fisiopatología de ciertas enfermedades, y puede proporcionar una adecuada orientación en la evaluación de la respuesta inmune y un manejo inicial simplificado de los pacientes. El FSP es una herramienta de gran valor en la evaluación del paciente con infección recurrente, sus hallazgos cualitativos y cuantitativos son claves para la orientación diagnóstica inicial de una IDP (Tabla 5) (Castaño, 2003)

35

Tabla 5. Alteraciones en el extendido de sangre periférica observadas en las inmunodeficiencias primarias (Castaño, 2003)

Neutropenia

* Enfermedad de Kostman * Síndrome de Schwachman * Neutropenia cíclica * Neutropenia familiar benigna * Mielokatexis * Síndrome Chediak-Higashi * Hipoplasia cartílago-pelo * Agamaglobulinemia ligada al X * ID común variable * Síndrome Hiper-IgM * Deficiencia de adhesión leucocitaria * Tipo III

Linfopenia

* ID combinada severa * Síndrome de DiGeorge completo * Hipoplasia cartílago-pelo * ID común variable * Ataxia telangiectasia * Agamaglobulinemia ligada al X

Trombicitopenia

* Síndrome Wiskott-Aldrich * ID común variable * Síndrome de Schwachman * Síndrome Hiper-IgM ligado al X * Agamaglobulinemia ligada al X * Síndrome Chediak-Higashi

Neutrofilia

* Deficiencias de adhesión leucocitaria tipos 1,2,4 * Infecciones bacterianas recurrentes asociadas a las ID con producción normal de fagocitos

Linfocitosis

* Enfermedad proliferativa ligada al X * Síndrome de Omenn

Monocitosis

* Neutropenia familiar benigna * Enfermedad de Kostmann

Eosinofilia

* Síndrome de Omenn * Síndrome de Job * Síndrome Wiskott-Aldrich * Síndrome Nezelof * ID combinada severa

Trombocitosis

* Infecciones recurrentes asociadas a las diferentes inmunodeficiencias

Aumento

* Anemia megaloblástica y células blásticas asociadas a defectos en la maduración o carencia de cofactores enzimáticos (vitaminas del complejo B)

Disminución

* Anemia microcíticas por infecciones crónicas y recurrentes o pérdidas sanguíneas crónicas (Wiskott-Aldrich) Microtrombocitos: Wiskott-Aldrich

Inclusiones citoplasmáticas

* Granulaciones tóxicas asociadas a infecciones * Síndrome de Chediak-Higashi

DISMINUCIÓN

ALTERACIONES EN EL NÚMERO DE CÉLULAS

AUMENTO

TAMAÑO

36

La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga

eléctrica,

a

través

de

una

matriz

gelatinosa

(www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/electrof oresis.html). Es muy útil en el diagnóstico de trastornos humanos paraproteínicos como mieloma múltiple y algunas inmunodeficiencias primarias. En algunas ocasiones se puede detectar con esta técnica una notable disminución en las concentraciones de gamma globulinas sericas como en el caso de la hipogammaglobulinemia (Figura 4). Por este método no se puede detectar la reducción de IgA o IgM a valores muy bajos, ya que representan una fracción relativamente pequeña del total de inmunoglobulinas sericas (Stites, 1999). .

Albúmina

α1

Alb

α1

α2

α2

β

γ

β

γ

Figura 4. Patrón de electroforesis para hipogammaglobulinemia (Stites, 1999)

37

4.4.2 Pruebas de Segunda Etapa 4.4.2.1 Pruebas para medir la producción de anticuerpos Existe un número de defectos bien definidos en las células que participan en la respuesta inmune humoral, ciertas características como son el desarrollo de infecciones en las primeras etapas de la vida y fallas en la respuesta adecuada a estas, aún después de un tratamiento farmacológico, hacen pensar en algún tipo de deficiencia de linfocitos B. La deficiencia de linfocitos B puede ser relativamente moderada y no presentar síntomas mayores o puede llevar a una deficiencia severa con una completa pérdida en la síntesis y secreción de anticuerpos (Folds, 2003). La evaluación en la producción de anticuerpos incluye varias pruebas de laboratorio, como: cuantificación de los niveles sericos de inmunoglobulinas, medición de subclases en los isotipos que las presentan, producción de anticuerpos específicos y cuantificación de linfocitos B entre otras. 4.4.2.1.1 Cuantificación de Inmunoglobulinas El estudio de las principales clases de inmunoglobulinas A, G y M, es de especial interés

en

el

laboratorio

de

inmunología.

La

determinación

de

estas

inmunoglobulinas contribuye significativamente al diagnóstico de diversas enfermedades

como

inmunodeficiencias,

gammapatías

monoclonales,

enfermedades infecciosas crónicas y agudas entre otras. Sus cifras séricas dependen de diversos factores del desarrollo, genéticos y ambientales. Éstos incluyen: características étnicas, edad, sexo, antecedentes de alergia, o infecciones recidivantes y factores geográficos (Ramos, 2004). Habitualmente en el laboratorio se cuantifican los niveles de IgG, IgM e IgA, los niveles de IgD e IgE no se realizan de rutina.

38

Se han estandarizado varios métodos para la cuantificación serica de las inmunoglobulinas. El clásico es la inmunodifusión radial que fue utilizada en por varios años. Actualmente el método más usado para la cuantificación de inmunoglobulinas es la turbidimetria, esta técnica es la medida de la turbidez de una solución o suspensión en la que la cantidad de luz transmitida se cuantifica con un espectrofotómetro o se estima mediante comparación visual con soluciones de turbidez conocida (www.iqb.es/diccio/t/tu.htm). 4.4.2.1.2 Medición de subclases de inmunoglobulinas Las inmunoglobulinas se han agrupado en diferentes subclases de acuerdo a diferencias que se encuentran en las cadenas pesadas. La IgG se subdivide en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 (Roit, 2000). Una deficiencia en las subclases de IgG puede resultar en la producción alterada de ciertos tipos de anticuerpos. La deficiencia selectiva de anticuerpos más frecuentemente identificada, es una respuesta defectuosa a antígenos de polisacáridos, como los presentes en la cápsula de neumococo, meningococo y Hemophilus influenzae tipo B. Dado que la IgG2 es el isotipo de anticuerpo predominante en respuesta a determinados polisacáridos, niveles disminuidos de esta subclase de IgG es la razón de una pobre respuesta a infecciones por bacterias encapsuladas. Su cuantificación en el laboratorio se hace principalmente por la técnica de nefelometría (Hernandez, 2004). La nefelometría se utiliza principalmente para medir las reacciones antígenoanticuerpo, la determinación nefelométrica de los antígenos se lleva a cabo por la adición de cantidades constantes de antisuero específico a diversas cantidades de antígeno. Los reactantes resultantes de antígeno y anticuerpo se colocan en un recipiente bajo un rayo de luz y el grado de dispersión de la luz se mide en una celda fotoeléctrica como densidad óptica (Stites, 1999).

39

4.4.2.1.3 Isohemaglutininas Dependiendo de la edad del paciente y su grupo sanguíneo es posible medir la presencia de anticuerpos naturales o isohemaglutininas anti-A y anti-B, estos anticuerpos son predominantemente de clase IgM dirigidos contra antígenos del grupo sanguíneo. Es una prueba útil en casos de inmunodeficiencias con falla selectiva para la formación de IgM por ejemplo el síndrome de Wiskott Aldrich. 4.4.2.1.4 Producción de anticuerpos IgG específicos Otra prueba funcional es la medición de anticuerpos post-vacúnales, con vacunas de bacterias encapsuladas como Haemophilus influenzae y Neumococo. La presencia de anticuerpos producidos en respuesta a estas vacunas son indicativos de una buena respuesta inmune de tipo humoral; sin embargo, cuando existe fallas a este nivel no se encuentran anticuerpos, especialmente de tipo IgG, contra estos microorganismos y se asocia a una inmunodeficiencia primaria por deficiencia de anticuerpos específicos (Folds, 2003). Los métodos de cuantificación de anticuerpos específicos circulantes se realizan en su mayoría utilizando análisis inmunoenzimaticos (ELISA) (Zielen, 2000; Neldya, 1998; Wernette, 2003; Kolibab, 2005). En esta técnica el componente de fase sólida es un antígeno, el anticuerpo por detectarse se une al antígeno y luego se agrega un anti-anticuerpo unido a una enzima, posteriormente se agrega el sustrato de la enzima y al reaccionar se forma un producto colorido que se mide espectofotométricamente (Stites, 1999). La técnica de ELISA es una prueba altamente sensible y especifica (Folds, 2003). 4.4.2.1.5 Cuantificación de LB por citometría Los LB expresan diversas moléculas de superficie que se pueden detectar por medio de anticuerpos monoclonales. Las células B maduras expresan CD19, CD20 y HLA-DR. Las células B inmaduras pueden expresar moléculas adicionales

40

como CD10. Los anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos se utilizan para detectar células que tienen los marcadores de LB (Stites, 1999). La cuantificación de los LB se realiza mediante citometría de flujo. La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas por delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estos convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serán digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una misma

célula.

Estos

parámetros

son:

- Parámetros relacionados con características intrínsecas de la célula, como su tamaño

y

la

complejidad

de

su

núcleo

y

citoplasma.

- Parámetros relacionados con características antigénicas de cada célula (inmunofenotipo). Por lo tanto, la CMF es capaz de identificar una célula por medio de sus características antigénicas y/o por sus características morfológicas de tamaño y complejidad (Figura 5) (www.citometriadeflujo.com).

Figura 5. Fundamento de la Citometría de Flujo (www.citometriadeflujo.com)

41

La representación grafica de las poblaciones celulares usualmente se realizan utilizando diagramas de puntos. Estos diagramas son usados habitualmente tanto en la adquisición celular como en su análisis y se presentan sobre un eje de coordenadas X/Y. Las poblaciones celulares, representadas por agrupaciones homogéneas de puntos, se situarán dependiendo de sus características físicas de dispersión (SSC/FSC) y antigénicas (Figura 6) (www.citometriadeflujo.com).

Figura 6. Análisis de puntos de LB (CD19+) por Citometría de Flujo. Cortesía de Angela Fonseca, Universidad Javeriana

4.4.2.2 Pruebas para medir la inmunidad mediada por LT 4.4.2.2.1 Hipersensibilidad cutánea retardada La prueba de hipersensibilidad cutánea retardada es considerada como una correlación In Vivo de la inmunidad mediada por células, puede ser usada como método de monitoreo para defectos en la inmunidad mediada por células. El procedimiento de esta prueba consiste en la inoculación intracutanea de una cantidad definida de un antígeno conocido como PPD (derivado proteico purificado) o Candida Albicans. El sitio de la inyección se observa por

42

aproximadamente 48-72 horas, observando la aparición de una pápula, si esta pápula tiene un diámetro mayor de 2 mm se considera positiva (Folds, 2003). La mayoría de individuos inmunocompetentes presentan una prueba positiva a por lo menos uno de los dos antígenos, mientras que los individuos con algún tipo de inmunodeficiencia presentan resultados negativos (Tabla 6) (Stites, 1999). Tabla 6. Deficiencias Inmunitarias que presentan resultados negativos para la prueba de hipersensibilidad retardada (Stites, 1999)

Deficiencias inmunitarias Congénitas Deficiencias combinadas de inmunidad celular y humoral Ataxia-telangiectasia Síndrome de Nezelof Inmunodeficiencia combinada severa Síndrome de Wiskott-Aldrich Celulares Síndrome de DiGeorge Candidiasis monocutanea Adquirida Síndrome de inmunodeficiencia adquirida Sarcoidoisis Leucemia linfocitica crónica Carcinoma

4.4.2.2.2 Subpoblaciones de LT por citometría Los linfocitos T, poseen dos subgrupos que pueden distinguirse por dos proteínas de superficie especificas para cada uno; los linfocitos T ayudadores expresan en su superficie la molécula CD4 y los linfocitos T citotóxicos expresan CD8. La mayor parte de los LT CD8+ tienen actividad citotóxica es decir, tienen la propiedad de destruir células que expresen moléculas extrañas en su superficie,

43

estos linfocitos son muy importantes en la defensa contra infecciones virales. Los linfocitos CD4+ funcionan como células cooperadoras promotoras de la proliferación, maduración y función inmunitaria de otros tipos celulares mediante la secreción de citocinas (Stites, 1999). Aproximadamente el 70% de los linfocitos T de sangre periférica son CD4+ o CD8+ (Stites, 1999) y su cuantificación se realiza principalmente por la técnica de citometría de flujo (Figura 7).

R1

Figura 7. Análisis de subpoblaciones de LT (CD4+/CD8+) por Citometría de Flujo. Cortesía Dra. Adriana Cuellar. M.Sc, Universidad Javeriana

4.4.2.2.3 Cuantificación de moléculas de superficie por citometría Los LT expresan en su superficie diversas moléculas como moléculas de adhesión entre las que se inmunoglobulinas, las

encuentran las Caherinas, la súper familia de las Integrinas, Selectinas y el Proteoglicano. También se

encuentran receptores como el TCR y los receptores tipo Toll al igual que

44

moléculas coestimuladoras como el CD28. Todas estas moléculas pueden ser identificadas mediante citometría de flujo, siempre que exista el anticuerpo monoclonal específico para cada una. 4.4.2.2.4 Citotoxicidad mediada por LT CD8+ y NK La citotoxicidad celular constituye uno de los mecanismos efectores de algunas poblaciones celulares especializadas del sistema inmune. Consiste en la capacidad para interaccionar con otras células y destruirlas. Este mecanismo de respuesta interviene en la defensa frente a infecciones víricas y células neoplásicas, así como en la destrucción de células alogénicas en transplante de órganos. Se consideran como prototipos de las células especializadas en dicha función a los linfocitos T CD8+ y a las células natural killer (Lozano, http://www.uco.es/grupos/inmunologiamolecula). La prueba de citotoxicidad por liberación de cromio se describió hace más de dos décadas y ha sido la técnica de mayor uso para la determinación de LT CD8+ específicos de antígeno. Sin embargo, presenta una limitada sensibilidad y el uso de un isótopo radiactivo (51 Cr) puede ser complicado. El principio básico de la prueba de citotoxicidad radica en la capacidad de los LT CD8+ de lisar la célula blanco mediante la liberación de perforina. La célula blanco que a su vez presenta el antígeno esta marcada con cromio. Una vez el complejo peptido/CMH es reconocido por la célula efectora en este caso el linfocito T CD8+ se induce la lísis mediada por perforina con la liberación del 51Cr al medio. El sobrenadante es recuperado y leído en un contador gama, el resultado se obtiene en cuentas por minuto (Figura 8) (Herrera, 1999).

45

Figura 8. Prueba de liberación de cromio (Herrera, 1999).

4.4.2.2.5 Cuantificación de células NK Las células NK son un componente importante del sistema inmune innato, son capaces de lisar las células infectadas por virus o células tumorales y son la fuente de una gran variedad de citocinas, cuando se presentan defectos en este tipo de células se incrementa la posibilidad de presentar mayor susceptibilidad a infecciones virales. La cuantificación de las células NK se realiza por citometría de flujo, estas células coexpresan en su superficie las moléculas CD16/CD56 por lo que es bastante sencilla su cuantificación en sangre periférica (Figura 9) (Folds, 2003).

46

Figura 9. Análisis de células NK (CD16+/CD56+) por Citometría de Flujo. Cortesía Dra. Adriana Cuellar.M.Sc, Universidad Javeriana.

4.4.4.3 Pruebas para medir la función de las células fagocíticas Los neutrófilos son leucocitos derivados de la medula ósea con una vida media finita, que tienen una función principal en la defensa contra infecciones ocasionadas por diferentes microorganismos. El neutrófilo desempeña una función principal como célula efectora o asesina. Sin embargo, en el flujo sanguíneo y en los espacios extravasculares, los neutrófilos ejercen efectos antimicrobianos a través de interacciones con anticuerpos, complemento y factores quimiotacticos (Stites, 1999). Los defectos en la función de los neutrófilos se pueden clasificar como cuantitativos o cualitativos. En los trastornos cuantitativos el número total de neutrófilos de función normal se encuentra bastante disminuido. En los trastornos cualitativos el numero total de neutrófilos se encuentra normal pero no pueden ejercer sus funciones microbicidas normales (Stites, 1999).

47

Para poder evaluar el tipo de defecto que presentan estas células existen varias clases de pruebas de laboratorio como la reducción de NBT, la medición de radicales libre de oxigeno y la expresión de beta-2 integrinas, entre otras. 4.4.4.3.1 Reducción de NBT La muerte de un microorganismo después de su fagocitosis se debe a la producción de iones superoxido, que ayudan a la muerte del microorganismo. En algunas enfermedades la fagocitosis no tiene ningún problema pero la producción de sustancias toxicas para el microorganismo no ocurre eficientemente, por lo que la destrucción no se lleva a cabo correctamente. El azul de tetrazolio nitrado (NBT) es un compuesto claro, amarillo y soluble en agua que al reducirse forma el formazan, tinción de color azul oscuro. Los neutrófilos pueden reducir el colorante después de la ingestión de látex u otras partículas, subsecuente a la descarga metabólica abrupta generada por la vía derivada del monofosfato de hexosa. (Stites, 199). La reducción del NBT es una prueba útil para analizar la integridad metabólica de los neutrófilos ya que la falla en la reducción del colorante se asocia con enfermedad granulomatosa crónica por lo tanto los neutrófilos de estos pacientes no pueden dar muerte a ciertos microorganismos intracelulares ni generar radicales superoxido (Stites, 1999). 4.2.2.3.2 Medición de radicales libres de oxigeno El desbalance en la producción de especies reactivas de oxígeno y la defensa antioxidante provoca un daño oxidativo conocido como estrés oxidativo, que lleva a una gran cantidad de cambios fisiológicos y bioquímicos, los cuales provocan el deterioro y muerte celular. Se puede medir este tipo de daño mediante métodos directos e indirectos.

48

Entre los métodos directos está la medición de la concentración de agentes oxidantes, que es muy difícil debido a su corta vida media. El uso de la espectrometría de la resonancia de rotación (espín) de electrones, es la única técnica analítica que mide directamente las especies oxígeno reactivas, pero debido a su costo y complejidad su aplicación en el ser humano es difícil. Los métodos indirectos se realizan mediante la determinación de los productos finales de la acción oxidante sobre algunas moléculas biológicas tales como los lípidos, ácidos nucleicos y proteínas. Los métodos para medir peróxidos lipídicos son el patrón de oro, cuando se trata de probar el papel de los oxidantes en algún tipo de daño celular. Es posible medir los dienos conjugados derivados del ácido araquidónico mediante espectrofotometría UV, los hidroperóxidos lipídicos mediante cromatografía líquida de alta presión (Gastell) 4.2.2.3.4 Quimiotaxis La

locomoción

direccional

de

los

neutrófilos

hacia

diversos

estímulos

quimiotacticos se cuantifican mediante el uso de la cámara de boyden. Las células por analizar se colocan en la parte superior y se separan de la cámara inferior que contiene la sustancia quimiotatica mediante una membrana de filtro de poro pequeño. Los neutrófilos pueden atravesar el filtro, pero se atrapan en el tránsito hacia la membrana y luego de un periodo de incubación, el filtro se tiñe y se observa al microscopio (Figura 10) (Stites, 1999).

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Cámara superior con células fagocíticas

Filtro Cámara inferior con agente quimiotáctico

Figura 10. Quimiotaxis en filtro. Cortesía Dra. Diana Patiño C. M.Sc. Pontificia Universidad Javeriana.

4.2.2.3.5 Fagocitosis y actividad bactericida de los neutrófilos La ingestión de microorganismos por neutrófilos es un proceso que requiere la producción de energía por parte de la célula fagocítica. La internación de microorganismos recubiertos de anticuerpos y complemento se presenta muy rápido después del contacto con neutrófilos ya que los procesos intracelulares subsecuentes dependen del éxito de la fagocitosis. Las pruebas para fagocitosis proporcionan un método rápido y relativamente simple para evaluar el proceso fagocítico en general (Stites, 1999).

50

4.2.2.3.6 Adherencia En el proceso de fagocitosis es importante el mecanismo de adhesión de las células fagocíticas al endotelio vascular, ya que se sabe que el neutrófilo se encuentra en un estado de “patrullaje” permanente y que el mecanismo de adherencia esta mediado por una serie de citocinas y factores químicos que lo inducen a llevar a cabo el proceso de fagocitosis. 4.2.2.4 Pruebas para medir sistema del complemento El sistema del complemento trabaja en asocio con otros componentes del sistema inmune innato y adaptativo, proporcionando vías y mecanismos para la destrucción de microorganismos o células dañadas. Esta conformado por más de 40 glicoproteinas que trabajan en cascada y existen en el plasma en forma de precursores. La mayoría de las proteínas del complemento son codificadas por genes autosomicos. Sin embargo, individuos con defectos heterocigóticos usualmente son asintomáticos, en contraste los pacientes que presentan condición homocigota son sintomáticos y pueden ser detectados mediante la realización de pruebas funcionales. Las pruebas de laboratorio especificas para los componentes del complemento incluyen: CH50, cuantificación de C3 y C4 e inhibidor de C1 estereasa entre otros (Folds, 2003).

4.2.2.4.1 Cuantificación de C3 y C4 Muchas de las proteínas del complemento pueden ser cuantificadas por métodos inmunoquimicos como nefelometría, inmunoprecipitación, turbidimetria, RIA y ELISA (Wen, 2004). Actualmente la técnica más utilizada es la turbidimetria.

51

4.2.2.4.3 Complemento hemolítico 50 (CH50) La prueba de CH50 esta basada en un ensayo hemolítico, en el que un complejo inmune es formado por la adición de anticuerpos que interactúan con antígenos de la superficie de los glóbulos rojos de carnero. Cuando el complemento es activado por los anticuerpos que se encuentran fijados sobre la superficie de los glóbulos rojos, estos son lisados y la hemoglobina es liberada. Los resultados son expresados en base a la última dilución del suero que causa lisis del 50% de las células.

4.2.2.4.4 CD59 en eritrocitos El antígeno CD59 es un regulador fisiológico de la activación del complemento, se encuentra disminuido o ausente en ciertas poblaciones de las células sanguíneas, condicionando una mayor susceptibilidad a hemólisis intravascular, mediada por complemento. La técnica de citometría de flujo es la más utilizada para El empleo de anticuerpos monoclonales fluorescentes específicos y su detección por citometría de flujo permite la demostración de deficiencias, aún cuando las poblaciones celulares afectadas sean escasas. Por ello, es común que en pacientes con esta enfermedad, la citometría de flujo sea diagnóstica, aun cuando las pruebas tradicionales de hemólisis en medio ácido o en presencia de inulina, que requieren de abundancia de células deficientes, arrojen resultados negativos (Argüelles, 2002)

52

4.2.3 Pruebas de tercera etapa 4.2.3.1 Pruebas para medir la producción de anticuerpos 4.2.3.1.1 Producción de anticuerpos in vitro La activación de los LB por antígenos o mitógenos genera cantidades pequeñas, pero detectables de inmunoglobulinas policlonales. Después de 7-10 días de cultivo, estos productos se miden mediante RIA o ELISA (Stites, 1999). El RIA es una técnica de análisis en el que una pequeña cantidad de sustancia marcada radiactivamente, es desplazada de su unión específica por otra similar no marcada que va a competir con la sustancia marcada radiactivamente. Al sistema de fijación elegido se le agrega una cantidad indeterminada de antígeno marcado, posteriormente se le agrega una cantidad de antígeno sin marcar o sea el suero problema, así se establece la competencia por los sitios de unión del anticuerpo, sigue la incubación a 37 grados Celsius, procediendo a los lavados mediante los cuales se realiza la separación del antígeno unido y del libre, de la cantidad de antígeno marcado fijado a diferentes concentraciones se hace una curva que permite encontrar cualquier concentración de antígeno no marcado que sea desconocido (Arano, 2002). Sin embargo, esta prueba ya no se realiza de rutina en el laboratorio. 4.2.3.1.2 Western blot para BtK, BLNK, NEMO

Las Btk, BLNK y NEMO, están relacionadas con la maduración y proliferación del linfocito B, y se pueden determinar por Western Blot. En la prueba de Western blot primero se debe hacer una electroforesis en gel de duodecil sulfato sodico poliacrilamida (SDS-PAGE), luego las proteinas obtenidas se transfieren a una matriz de soporte por ejemplo nitrocelulosa donde se emplea un anticuerpo primario para localizar la proteína de interés en este caso Btk, BLNK o NEMO, un segundo anticuerpo marcado con una enzima y contra la especie en

53

la que se produjo el anticuerpo monoclonal que usualmente es ratón. El anticuerpo secundario se puede marcar de diversas formas con el fin de producir una señal detectable, que va a ser observada como bandas en el papel de nitrocelulosa (Stites, 1999)

4.2.3.1.3 Análisis de polimorfismos conformacionales de cadena sencilla (SSCP)

SSCP es el método más simple y más usado para la detección de mutaciones. El PCR se utiliza para amplificar la región del interés y el DNA resultante es separado como una molécula de cadena sencilla por electroforesis en un gel de poliacrilamida no denaturante. Cada uno de los filamentos de DNA migrara de manera diferencial de los otros si presenta alguna mutación así sea de una sola base, se cree que estos diferentes patrones de migración se deben a cambios en la estructura terciaria del DNA. Estas mutaciones son detectadas como bandas nuevas en los “autoradiogramas” (detección radiactiva) ya sea por tinción de plata o por el uso de primers fluorescentes que posteriormente se analizaran en un secuenciador automatizado (Youil, 1996)

4.2.3.2 Pruebas para medir la inmunidad mediada por LT 4.2.3.2.1 Linfoproliferación con mitógenos En esta prueba se busca medir la habilidad de los linfocitos para proliferar en respuesta a una variedad de estímulos como son los mitógenos. Se han empleado diversas lectinas de plantas y otras sustancias como la fitohemaglutinina y la concavalina A para evaluar la función de linfocitos humanos. En esta técnica se obtienen linfocitos mediante gradiente de densidad Ficoll Hypaque y se establecen cultivos por triplicado en microplacas a una concentración de 1x 106 linfocitos por mililitro, se añaden los mitógenos a diversas concentraciones, los cultivos se incuban a 37°C al 5% de CO2 durante 72 horas. En este tiempo los mitógenos han

54

producido su efecto máximo sobre la síntesis de DNA. La síntesis de DNA se mide mediante el marcaje de los cultivos con intermitencias de timidina tritiada (3H-Tdr), este es un precursor de nucleósido que se incorpora en el DNA que se acaba de sintetizar. La cantidad de 3H-Tdr incorporada es relativa a la velocidad de síntesis del DNA y se determina por la cuenta de centelleos en un espectrofotómetro de líquido de centelleo (Stites, 1999). 4.2.3.2.2 Cuantificación de la producción de citocinas In vitro Esta técnica consiste en el cultivo de células mononucleares de sangre periférica con

un

antígeno

especifico

y

anticuerpos

coestimuladores,

luego

de

aproximadamente 6-8 horas se pueden medir las citoquinas en el sobrenadante del cultivo. La proporción de citoquinas secretadas por las células en el cultivo se puede determinar por ELISA, ELISPOT y mas recientemente por citometría de flujo (Folds, 2003). El ELISPOT o ensayo de inmunospot conjugado a actividad enzimática, esta diseñado para cuantificar células individuales que están secretando una proteína concreta in vitro. Está basado en el protocolo básico de ELISA, originalmente diseñado para el análisis de células secretoras de anticuerpos determinados, se ha adaptado para poder medir frecuencia de células produciendo y secretando moléculas efectoras (citocinas), en estado de reposo, tras estimulación o en estados patológicos. 4.2.3.2.3 Western blot para ZAP-70, JAK3 y STAT-1 La proteína ZAP-70 se encuentra expresada exclusivamente en linfocitos T y células NK y juega un papel esencial en el proceso de selección positiva y negativa durante la maduración tímica de los linfocitos T. la proteína kinasa JAK3 esta asociada al dominio intracelular de la cadena gamma común que interviene en la transducción de la señal generada tras la unión de las citocinas a sus respectivos receptores, señal necesaria para que se complete el desarrollo de

55

linfocitos, estas proteínas se encuentran alteradas principalmente en la inmunodeficiencia combinada severa, por lo que su analisis se hace muy importante en el diagnostico de esta patología. Su cuantificación se puede realizar mediante la prueba de western blot utilizando anticuerpos monoclonales anti- ZAP70, JAK3 y STAT-1.

4.2.3.3 Pruebas para medir la función de células fagocíticas 4.2.3.3.1 Western blot para proteínas del sistema NADPH oxidasa Para realizar la prueba de Western Blot para evaluar el sistema NADPH oxidasa se realiza primero una electroforesis en gel de poliacriamida (SDS-PAGE) de la membrana del neutrófilo y sus fracciones citosolicas. A las bandas obtenidas de esta electroforesis se le agregan anticuerpos monoclonales del ratón contra gp91phox, gp22phox, p47phox o p67phox y se detectan con un anticuerpo anti IgG de ratón conjugada con fosfatasa alcalina (Boer,1998).

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5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS



En Colombia actualmente existen muy pocos laboratorios que realicen pruebas inmunológicas especificas para el diagnostico de pacientes con inmunodeficiencias primarias.



Se halla poca información sobre las pruebas clínicas de laboratorio que existen para un adecuado manejo de pacientes con inmunodeficiencias primarias.



El acceso a las pruebas especializadas de laboratorio permite al personal medico establecer un diagnostico acertado que podría prevenir o disminuir la estancia de los pacientes en las instituciones hospitalarias llevando a que estos presenten una mejor calidad de vida.

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