EXAMEN DE TÉCNICAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR NotI restriction site

December 8, 2017 | Autor: C. Porras Cruz | Categoría: N/A
Share Embed


Descripción

EXAMEN DE TÉCNICAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR

Ustedes son un grupo de investigadores a los que se les a asignado la tarea de clonar una nueva proteína que es fluorescente y expresarla en E. coli para realizarle estudios posteriores. Ya que cuando esta proteína es estimulada con luz U.V. emite una luz púrpura. El gen de esta proteína se llama lightKnis y se encuentra de manera natural en el genoma del raramente visto pero temperamental y feroz perro salvaje del desierto de Chihuahua (Canis nocturnis chihuahuensis). Afortunadamente ustedes no tienen que salir al campo y obtener una muestra de tejido del perro, sino que afortunadamente ya tienen muestra de tejido congelada. Se sabe que la sección del cromosoma en donde se encuentra el gen tiene la siguiente estructura molecular:

lightKnis BamHIBamHI
BamHI
BamHI


2000 bp2000 bp
2000 bp
2000 bp
Desafortunadamente, no hay sitios de restricción convenientes a ambos lados del gen.

El vector en el que ustedes necesitan clonar a lightKnis se muestra abajo y, sólo tiene 2 sitios de restricción, uno para la enzima EcoRI y otro para NotI.
EcoRI restriction site:... N N N G A A T T C N N N ...... N N N C T T A A C N N N ...EcoRI restriction site:... N N N G A A T T C N N N ...... N N N C T T A A C N N N ...
EcoRI restriction site:

... N N N G A A T T C N N N ...

... N N N C T T A A C N N N ...
EcoRI restriction site:

... N N N G A A T T C N N N ...

... N N N C T T A A C N N N ...




NotI restriction site:... N N G C G G C C G C N N ...... N N C G C C G G C G N N ...NotI restriction site:... N N G C G G C C G C N N ...... N N C G C C G G C G N N ...
NotI restriction site:

... N N G C G G C C G C N N ...

... N N C G C C G G C G N N ...
NotI restriction site:

... N N G C G G C C G C N N ...

... N N C G C C G G C G N N ...






NotINotIEcoRIEcoRI
NotI
NotI
EcoRI
EcoRI

-gal gene -gal gene
-gal gene
-gal gene




promoterpromoterpCM999(4000 base pairs)pCM999(4000 base pairs)Kanamycin resistance gene (KanR)Kanamycin resistance gene (KanR)
promoter
promoter



pCM999
(4000 base pairs)



pCM999
(4000 base pairs)
Kanamycin resistance gene (KanR)
Kanamycin resistance gene (KanR)









De manera detallada expliquen como clonaran el gen lightKnis en el vector pCM999, y cómo transfectarán E. coli con pCM999. ¿Cómo seleccionarán aquellas colonias que tienen el gen?

El Canis nocturnis chihuahuensis es obviamente un eucarionte por lo que sus genes tienen intrones que son eliminados durante la maduración del RNAm, pero los procariontes no saben como eliminar los intrones. Además ustedes no saben exactamente dónde empiezan y terminan los intrones y los exones :P.

¿Cómo harían para crear una versión del gen lightKnis sin intrones de tal manera que el RNA sea correctamenta traducido a proteína en E. coli?
No hay sitios de restricción obvios rodeando el gen lightKnis, sin embargo ustedes necesitan clonarlo en pCM999. ¿Cómo lo harían? (pista: el primer o cebador con extremo 5' puede diseñarse ya que en el extremo 3' hay una serie de bases complementarias. Así que cuando diseñen el primer 5' pueden incluir cualquier secuencia de nucleótidos que deseen).
El plásmido pCM99 de manera normal expresa el gen de -gal. La enzima -galactosidasa normalmente rompe el disacárido de la lacotsa en 2 monosacáridos. Si en vez de lactosa agregamos al medio el sustrato X-gal, las células al expresar la versión funcional de la -galactosidasa dan una coloración azul al degradar el X-gal.
Si lightKnis se incorporó en pCM999, pudo de haberlo hecho en la dirección 5'-3' (forward) o bien 3'-5' (reverse). Expliquen ¿una orientación es preferible a la otra? Si es así, ¿cómo pueden indicar que plásmidos tienen lightknis en la orientación correcta? (pista: Se puede hacer una digestión enzimática y correrse un gel. ¿Qué enzima usarían y de que tamaño esperan los fragmentos?
Finalmente, quieren saber la secuencia del gen sin intrones que exitosamente lograron clonar ¿qué hacen? ¿cuáles son los principios de la secuenciación del DNA?

RECUERDEN TIENEN QUE EXPLICAR TODO DE LA MANERA MÁS DETALLADA POSIBLE Y HASTA CON DIBUJITOS.


A TRABAJAR!!!


Lihat lebih banyak...

Comentarios

Copyright © 2017 DATOSPDF Inc.