Evaluacion de la capacidad de cuatro antivenenos comerciales para neutralizar el veneno de la serpiente Bothrops asper (terciopelo) de Costa Rica

Toxicon. Vol. 33, No. 9. pp. 1242 1247. 1995

Pergamon

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0041-0101(95)00063-1

EVALUACION

DE LA CAPACIDAD

ANTIVENENOS NEUTRALIZAR BOTHROPS

ASPER

DE CUATRO

COMERCIALES

EL VENENO

PARA

DE LA SERPIENTE

(TERCIOPELO)

DE COSTA RICA

GUISELLA BOGAR1N, EDUARDO SEGURA, GINA DUR,~N, BRUNO LOMONTE, GUSTAVO ROJAS and JOSI~ MARIA GUTII~RREZ* Instituto C l o d o m i r o Picado, F a c u l t a d de Microbiologia, U n i v e r s i d a d de C o s t a Rica, San Jos6, C o s t a Rica

(Received 1 February 1995: accepted 10 April 1995)

G. Bogarin, E. Segura, G. Durfin, B. Lomonte, G. Rojas and J. M. Gutibrrez. Evaluation of the neutralizing ability of four commercially available antivenoms against the venom of Bothrops asper from Costa Rica. Toxicon 33, 1242 1247.--We studied the ability of four commercially available antivenoms to neutralize several toxic and enzymatic activities of Bothrops asper (terciopelo) venom from Costa Rica. Experiments with preincubation of venom and antivenom were carried out to test the neutralization of lethal, hemorrhagic, coagulant and indirect hemolytic activities. In addition, antibody titers against crude venom and myotoxin II purified from this venom were determined by enzyme immunoassay (ELISA). Results indicate that polyvalent antivenom from |nstituto Clodomiro Picado (Costa Rica) has the highest neutralizing ability against lethal, coagulant and indirect hemolytic activities, whereas MYN polyvalent antivenom (M~xico) has the highest neutralization against hemorrhagic activity. Antivenom from Instituto Clodomiro Picado also has the highest antibody titers against crude B. asper venom and against myotoxin I|. Antivenoms from Universidad Central de Venezuela (Venezuela), Vencofarma (Brazil) and MYN (M6xico) failed to neutralize the lethal effect of this venom. These results stress the need for rigorous quality control systems to evaluate the neutralizing ability of antivenoms in Central America.

La administraci6n parenteral de antivenenos de origen equino constituye el recurso mils aceptado a nivel mundial para el tratamiento de los envenenamientos por mordeduras de serpiente (Bolafios, 1982; Sullivan, 1987; Warrell, 1993). Dada la gran variaci6n interespecifica e intraespecifica en la composicidn quimica y e n las actividades farmaco16gicas de los venenos (Jim6nez-Porras, 1964; Tu, 1977: Guti~rrez et al., 1980), es nece-

* A u t h o r to w h o m c o r r e s p o n d e n c e should be addressed. 1242

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sario evaluar la capacidad neutralizante de los antivenenos que se distribuyen en un determinado pais contra los venenos de mayor relevancia m~dica en dicho pals. B o t h r o p s asper causa la mayoria de los accidentes ofidicos en Centroam~rica (Bolafios, 1982; Guti6rrez, 1995). En el presente trabajo se investig6 la capacidad de cuatro antivenenos comerciales que se distribuyen en Centroam6rica para neutralizar las principales actividades t6xicas del veneno de B. asper de Costa Rica. E1 veneno de B. a s p e r s e obtuvo de mils de 50 ejemplares adultos colectados en Costa Rica, liofilizfindose despu6s de su obtenci6n. La miotoxina II se purific6 de este veneno de acuerdo a Lomonte y Guti6rrez (1989). Los antivenenos utilizados fueron: (1) suero antiofidico polivalente liquido (Instituto Clodomiro Picado, Costa Rica), lote 2490594LQ; (2) suero antiofidico polivalente liofilizado (Vencofarma, Brasil), lote 001/ 94; (3) suero antiofidico polivalente liquido (Universidad Central de Venezuela), lote 062; y (4) suero antiofidico polivalente liofilizado M Y N (M6xico), lote B-3G-09. Todos los antivenenos se utilizaron de acuerdo con las indicaciones de los productores y antes de la fecha de vencimiento de los mismos. Para la neutralizaci6n del efecto letal se utilizaron ratones Swiss-Webster de 16-18 g y se emple6 una dosis de reto de 4 dosis letales 50%. Las mezclas veneno-antiveneno se incubaron durante 30 rain a 37°C y las inoculaciones se efectuaron por la via intraperitoneal. Las muertes se observaron durante 48 hr y se calcul6 la dosis eficaz 50% (DEs0) empleando el m+todo de Spearman-Karber (W.H.O., 1981). La neutralizaci6n del efecto hemorrfigico se estudi6 empleando el procedimiento de Guti6rrez et al. (1985). Para el estudio del efecto coagulante y su neutralizaci6n se sigui6 la metodologia empleada por Gen6 et al. (1989), utilizfindose plasmas humano y equino. E1 m6todo de Guti6rrez et al. (1988) se emple6 para analizar la neutralizaci6n de la actividad hemolitica indirecta. En los efectos hemorr~tgico y hemolitico indirecto, la capacidad neutralizante se expres6 como dosis eficaz 50% (DEs0), definida como la raz6n #1 de antiveneno/mg de veneno en la que se reduce en un 50% el efecto inducido por el veneno solo. En el caso del efecto coagulante, se emple6 la dosis eficaz (DE), definida como la raz6n /~1 de antiveneno/mg de veneno en la que se prolonga tres veces el tiempo de coagulaci6n del plasma incubado con veneno solo (Gen6 et al., 1989). Se titul6 mediante ELISA los anticuerpos contra el veneno crudo de B. asper y contra la miotoxina II de este veneno, empleando el procedimiento descrito por Lomonte et al. (1991), con algunas modificaciones que se especifican en la leyenda de la Fig. 1. La concentraci6n de proteinas se determin6 por el m6todo de Biuret (Schosinsky et al., 1983). La significancia de las diferencias observadas en los valores de las DEs0 se estudiaron mediante anfilisis de variancia. Cuando se encontraron valores significativamente diferentes (P < 0.05), se analizaron los resultados mediante la prueba de comparaciones mfiltiples de Tukey-Kramer. E1 Cuadro 1 muestra los resultados de los experimentos de neutralizacion. El antiveneno del Instituto Clodomiro Picado fue el m'~s eficaz en la neutralizaci6n de los efectos letal, coagulante y hemolitico indirecto, en tanto el producto M Y N fue el mils eficaz en la neutralizacion del efecto hemorrfigico. En el caso del efecto letal, los antivenenos MYN, de la Universidad Central de Venezuela y de Vencofarma no neutralizaron este efecto afin a un nivel de 1.33 mg de veneno/ml de antiveneno (752 /21 de antiveneno/mg de veneno). En relaci6n con los ensayos inmunoenzimfiticos, los antivenenos mostraron diferencias considerables en cuanto a los titulos de anticuerpos contra veneno crudo y miotoxina II de B. asper (Fig. 1). En ambas titulaciones el antiveneno ICP mostr6 los mejores titulos, en tanto el antiveneno M Y N present6 los t~tulos mils bajos. E1 antive-

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Fig. 1. Titulaci6n de anticuerpos contra veneno crudo de B. asper (A) y contra miotoxina 11 purificada del mismo veneno (B), mediante ELISA, en cuatro antivenenos comerciales. Se recubrieron placas Immulon 2 (Dynatech) con veneno crudo (1 /~g/hoyo) o con miotoxina (0.4/~g/hoyo). Se prepararon diluciones seriadas de los antivenenos, a partir de 1:200, y se probaron por triplicado. Como control negativo se utiliz6 suero equino normal tratado de igua[ forma. Las muestras se incubaron por 16 hr a 4°C y , luego de 5 lavados, se detect6 los anticuerpos unidos con un conjugado anti-inmunoglobulina equina/peroxidasa, utilizando o-fenil~ndiamina y per6xido de hidr6geno como sustrato. Las absorbancias se determinaron a 540 nm en uu lector MR-5000 con el programa Biolinx (Dynatech). El titulo se defini6 como el inverso de la diluci6n que corresponde a una absorbancia de 1.0. Los antivenenos corresponden a (1) Instituto Clodomiro Picado; (2) Universidad Central de Venezuela: (3) Vencofarma; (4) MYN.

n e n o del I n s t i t u t o C l o d o m i r o

P i c a d o p r e s e n t 6 la m a y o r

(3.20

los a n t i v e n e n o s

+

0.20 g/dl), e n t a n t o

MYN,

concentraci6n

de p r o t e i n a s

d e la U n i v e r s i d a d C e n t r a l d e

V e n e z u e l a y d e V e n c o f a r m a p r e s e n t a r o n c o n c e n t r a c i o n e s d e 1.30 + 0.23, 2.77 + 0.05 y 1.64 + 0.06 g / d l , r e s p e c t i v a m e n t e . Los resuitados obtenidos indican

que

el

antiveneno

polivalente

del

lnstituto

C l o d o m i r o P i c a d o es el q u e m e j o r n e u t r a l i z a el v e n e n o d e B. asper d e C o s t a R i c a y el q u e p r e s e n t a los m a y o r e s t i t u l o s e n E L I S A c o n t r a el v e n e n o c r u d o y c o n t r a la m i o t o x i n a II. E s t o s r e s u l t a d o s p u e d e n e x p l i c a r s e p o r el h e c h o d e q u e e n

la p r o d u c c i 6 n d e d i c h o

a n t i v e n e n o , los c a b a l l o s s o n i n m u n i z a d o s c o n u n a m e z c l a d e los v e n e n o s d e B. asper,

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Crotalus durissus durissus y Lachesis muta obtenidos de ejemplares colectados en Costa Rica (Bolafios y Cerdas, 1980), lo cual garantiza la obtenci6n de anticuerpos especificos contra las toxinas del veneno de B. asper. Llama la atencion el hecho de que los antivenenos M Y N , de la Universidad Central de Venezuela y Vencofarma no lograron neutralizar la letalidad en el nivel inferior de potencia probado. En el caso del antiveneno M Y N , Theakston et al. (1994) describieron que no neutraliz6 venenos de Bothrops del Ecuador. Pese a que se ha demostrado la existencia de reacciones cruzadas entre venenos y diversos antivenenos (Rosenfeld y Kelen, 1966; Guti+rrez et al., 1985; Kornalik y Taborska, 1989; Dias da Silva et al., 1989), nuestras observaciones permiten plantear la importancia de utilizar, en las mezclas antig6nicas, venenos de serpientes de la regi6n en la cual se va a distribuir un determinado antiveneno, ya que flnicamente de esta manera se garantiza la adecuada cobertura inmunol6gica de las principales toxinas presentes en los venenos. Es necesario que las autoridades de salud responsables de adquirir antivenenos en los palses centroamericanos introduzcan procedimientos rigurosos de control de calidad de los productos que se distribuyen en la regi6n, con el fin de garantizar que se adquieran antivenenos eficaces contra los venenos de las principales serpientes venenosas del/lrea. Agradecimientos--Los autores agradecen la colaboraci6n de Jorge Sanabria, Abel Robles y Javier Nflfiez en esta investigaci6n. Este estudio fue financiado por la Vicerrectoria de Investigaci6n, Universidad de Costa Rica (proyecto 741-87-057), por la International Foundation for Science (proyecto F/0883-4F) y por la Swedish Agency for Research Cooperation with Developing Countries (SAREC). G. Rojas es miembro del Programa Financiero de Apoyo a Investigadores del Consejo Nacional de lnvestigaciones Cientificas y Tecnol6gicas (CONICIT).

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Rosenfeld, G. and Kelen, E. M. A. (1966) Cross neutralization of the coagulant activity of some snake venoms by antivenins. Toxicon 4, 7 15. Schosinsky, K., Vargas, M., Vinocour, E., Gonzfilez, O., Brilla, E. y Guti6rrez, A. (1983) Manual de T~cnicas de Laboratorio. San Jos& Universidad de Costa Rica. Sullivan, J. B. (1987) Past, present, and future immunotherapy of snake venom poisoning. Ann. Emerg. Med. 16, 938 944. Theakston, R. D. G., Laing, G. D., Freire Lascano, A., Vallejo, F., Guderian, R. H., Rumbea Guzmhn, J. and Warrell, D. A. (1994) Efficacy of four antivenoms against venoms of Ecuadorian crotalid snakes: results of W.H.O. laboratory assays. In: Program and Abstracts, l l t h Worm Congress on Animal, Plant and Microbial Toxins, p. 7. Tel Aviv: Tel Aviv University. Tu, A. T. (1977) Venoms: Chemist o, and Molecular Biology, 560 pp. New York: Wiley. Warrell, D. A. (1993) Venomous bites and stings in the tropical world. Med. J. Aust. 159, 773 779. World Health Organization (1981) Progress in the Characterization o f Venoms and Standardization of Antivenoms, 44 pp. Geneva: World Health Organization.