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Diego Mauricio Riaño Pachón, Emilia María Valenzuela de Silva, José Ramón Mantilla Anayá, Carlos Agudelo Diversidad genética y estructura de la población de Vibrio cholerae en Colombia Revista Colombiana de Biotecnología, vol. V, núm. 1, julio, 2003, pp. 36-44, Universidad Nacional de Colombia Colombia Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=77650105
Revista Colombiana de Biotecnología, ISSN (Versión impresa): 0123-3475
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Diversidad genética y estructura de la población de Vibrio cholerae en Colombia Genetic diversity and population structure of Vibrio cholerae in Colombia Diego Mauricio Riaño Pachón*, Emilia María Valenzuela de Silva*, José Ramón Mantilla Anayá***, Carlos Agudelo**** RESUMEN Se realizó la electroforesis en gel por campo pulsado (PFGE) de los macrofragmentos de restricción de 34 aislamientos de Vibrio cholerae pertenecientes a la epidemia de cólera que se presentó en Colombia entre 1991 y 1996, adicionalmente se analizaron 3 aislamientos de V. cholerae no pertenecientes a esta epidemia y un aislamiento de V fluvialis. La diversidad genética observada para los 38 aislamientos tipificados fue de 0,95 valor muy similar al obtenido por Electroforesis de Enzimas Multilocus (MLEE). No se observó correlación entre las variables que caracterizan a estos aislamientos (serotipo, origen [clínico o ambiental], departamento, tipo electroforético (MLEE) y perfil de macrofragmentos de restricción (PFGE)). No se obtuvo evidencia de desequilibrio de ligamiento al evaluar esta población con los marcadores genéticos PFGE y MLEE. Se sugiere que la población de Vibrio cholerae en Colombia presenta una estructura genética sexual, hipótesis que está soportada por la falta de evidencia de desequilibrio de ligamiento y la ausencia de correlaciones entre las variables epidemiológicas, bioquímicas y moleculares a disposición, y por el alto valor de diversidad genética obtenido, que puede ser el reflejo de la coexistencia de varias líneas de descendencia entre las cuales existe un alto flujo genético. Palabras clave: Vibrio cholerae, Electroforesis en gel por campo pulsado, epidemiología molecular, genética de poblaciones, desequilibrio de ligamiento. ABSTRACT Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) was used to study thirty-four Vibrio cholerae isolates from the Colombian cholera epidemic between 1991 and 1996. Three V cholerae isolates not belonging to the epidemic in Colombia and a V fluvialis isolate were also analysed. The genetic diversity observed for the 38 isolates typified was 0.95, a very similar valué to that obtained by Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE). No cor reía tion was observed between the variables characterising these isolates (serotype, origin [clinical or environmental], state, electrophoretic type (MLEE) and restriction macro-fragment profile or pulsetype (PFGE)). No evidence of linkage disequilibrium was obtained on evaluating this population with PFGE and MLEE genetic markers. It is suggested that the Vibrio cholerae population in Colombia presents a sexual genetic structure. The lack of evidence for linkage disequilibrium and the absence of correlation between the epidemiological, biochemical and molecular variables available sustains such a hypothesis. It is also sustained by the high valué for genetic diversity obtained which could be reflecting the coexistence of several lines of descent having a high genetic flow amongst them. Key words: Vibrio cholerae, Pulsed-Field Gel Electrophoresis, molecular epidemiology, population genetics, linkage disequilibrium.
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Biólogo UN. Investigador Grupo de Epidemiología Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia. e-mail:
[email protected] ** QF, MSc Microbiología. Investigadora Grupo de Epidemiología Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia. *** QF, MSc Bioquímica. Coordinador Grupo de Epidemiología Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia. **** MD, MSc Salud Pública y en Microbiología. Investigador Instituto de Salud e Infecciones en el Trópico, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia
Recibido: julio 26 de 2002. Aceptado: marzo 17 de 2003
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DIVERSIDAD GENÉTICA Y ESTRUCTURA DE LA POBLACIÓN DE Vibrio cholerae EN COLOMBIA
INTRODUCCIÓN Anualmente, los brotes de cólera causan la muerte de aproximadamente 120.000 personas alrededor del mundo y el número de enfermos es todavía mayor, siendo principalmente niños (Faruque et al. 1998). En Colombia se presentó una onda epidémica de cólera entre 1991 y 1996. Algunos de los aislamientos involucrados en esta epidemia fueron colectados por el Instituto Nacional de Salud y han sido estudiados empleando diferentes enfoques (Bustamante, 1999; Tamayo et al. 1997; Tamayo, 1998). Las estrategias empleadas para estudiar los aislamientos de la epidemia de cólera en Colombia usualmente han dejado de lado el marco conceptual de la genética de poblaciones, a pesar del hecho de que cuando se caracterizan genotipos microbianos para estudiar su diversidad genética, únicamente la genética de poblaciones puede evaluar de forma rigurosa la estabilidad espacial y temporal de esos genotipos (Tibayrenc, 1995a; Tlbayrenc, 1996). La tipificación epidemiológica está basada en la suposición de que los genotipos multilocus usados como marcadores epidemiológicos son estables en el espacio y en el tiempo. Esto es verdad únicamente si el flujo genético es raro o ausente en la especie o población bajo estudio (Tibayrenc, 1999). Si el intercambio genético es muy frecuente, el organismo bajo estudio exhibe una estructura genética sexual1 o panmítica, en la que se pueden recuperar todos o casi todos los genotipos multilocus y sus genotipos pueden ser equiparados con variantes individuales efímeras, siendo su tipificación, por tanto, poco relevante (Tibayrenc, 1995b). Este es el caso de la bacteria Neissería gonorrhoeae (Maynard Smith etal. 1993). Si el intercambio genético es escaso o ausente, las líneas microbianas evolucionan independientemente una de otra y se comportan como clones naturales (Tibayrenc, 1995b). Si esto acontece será difícil recuperar todos los genotipos multilocus, en cambio existirán ciertas combinaciones con una alta frecuencia, que se recuperan con mayor facilidad, en otras palabras, existirá desequilibrio de ligamiento. Este es el caso del microorganismo Salmonella. (Maynard Smith etal. 1993). 1
La palabra "sexual" debe entenderse en un sentido amplio, donde cualquier mecanismo que favorezca el flujo de genes puede actuar. De esta forma, son mecanismos igualmente válidos la recombinación y el flujo horizontal de genes (Tibayrenc, 1995b; 1996; 1999).
En este contexto, el conocimiento sobre la estructura genética de aquellas poblaciones de microorganismos que tienen importancia médica adquiere gran relevancia ya que este conocimiento puede ser usado para saber si los genotipos encontrados en la tipificación son estables espacio-temporalmente, de tal forma que otras características de interés epidemiológico puedan mapearse sobre ellos, o si por el contrario los genotipos son inestables y continuamente se diluyen en el acervo genético de la población. Para determinar la estructura genética de las poblaciones se puede emplear como hipótesis nula (H0) la panmixia, o lo que es lo mismo, suponer que existe un alto flujo genético en la población bajo estudio y que es posible encontrar todas las combinaciones posibles de diferentes características (genotipos multilocus), esta hipótesis también equivale, o por lo menos es indistinguible, a la no existencia de unidades discretas de tipificación, es decir, a un modelo de población no estructurada (Tibayrenc, 1996; Tibayrenc, 1998). Las desviaciones de la panmixia se pueden evaluar con pruebas que consideran la pérdida de segregación o la pérdida de recombinación. (Tibayrenc, 1995a; Tibayrenc, 1995b; Tibayrenc, 1996; Tibayrenc, 1998; Tibayrenc, 1999). La segregación se refiere a los arreglos no aleatorios de diferentes alelos en un locus dado. Las pruebas basadas en la pérdida de segregación yacen sobre los estadísticos derivados de la prueba de equilibrio de Hardy-Weinberg, el uso de los cuales requiere el cumplimiento de ciertos criterios: los alelos tienen que ser identificables, el nivel de ploidía de los organismos debe ser conocido y no debe ser igual a uno. Las pruebas de segregación, por esta última razón, no pueden ser aplicadas en bacterias ni en algunos microorganismos eucarióticos. Además, los marcadores comúnmente utilizados en la genética evolutiva y epidemiología molecular (PFGE, AFLP, RAPO, etc.), no permiten ni la individualización de alelos ni de los loci (Tibayrenc, 1995b; Tibayrenc, 1996; Tibayrenc, 1999). Las pruebas de recombinación son más robustas, ya que pueden llevarse a cabo sin ninguno de los requerimientos obligatorios para las pruebas de segregación. Las pruebas de recombinación no sólo se pueden llevar a cabo para un solo locus sino para grupos de loci, aún si esos grupos de loci no se identifican
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precisamente. El único requerimiento es que el locus o grupos de loci sean independientes unos de otros. (Tibayrenc, 1995b; Tibayrenc, 1996; Tibayrenc, 1999; Tibayrenc, etal. 1990). Todas las pruebas exploran diferentes facetas de un único fenómeno biológico: el desequilibrio de ligamiento; que consiste en la imposibilidad de recuperar todos los genotipos multilocus, debido a la asociación no aleatoria de alelos en diferentes loci. El objetivo de este trabajo fue aproximarse al conocimiento de la estructura genética de la población de Vibrio cholerae que causó la epidemia de cólera en Colombia entre 1991 y 1996.
MATERIALES Y MÉTODOS Población estudiada Se estudiaron 34 aislamientos de Vibrio cholerae O1 obtenidos de pacientes de cólera durante la epidemia que de esta enfermedad se presentó en Colombia entre 1991 y 1996. Los aislamientos fueron facilitados por el Instituto Nacional de Salud. También se estudiaron tres aislamientos de Vibrio cholerae que no estaban relacionados con la epidemia de cólera en Colombia pero que conservaban la característica de ser patógenos. Se incluyó también un aislamiento de Vibrio fluvialis, para usarlo como grupo externo en el análisis de genotipificación (Tabla 1). Los aislamientos estudiados estaban caracterizados de acuerdo con: serotipo, origen (clínico o ambiental), departamento, año (Agudelo et al. 1997) y tipo electroforético (Bustamante, 1999), esta información fue obtenida de estudios previos realizados por investigadores del grupo de Epidemiología Molecular del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia.
PFGE Se siguió el procedimiento descrito por Chang & Chui (1998) con algunas modificaciones. Se inocularon 40 mL de caldo LB con 0,5 mL de un cultivo de 16 horas. Se incubó a 37°C hasta alcanzar una densidad óptica aproximada de 0,6 medida a 610 nm.
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Las células fueron recolectadas por centrifugación a 4000g y suspendidas en buffer de lavado (1M NaCI, 10mM Tris-HCI, pH8.0,10mM EDTA, pH8.0) obteniendo una concentración de 1.9x109UFC/mL. Se mezclaron 500 μL de esta suspensión celular con agarosa de bajo punto de fusión al 1,5% [peso/vol.], en relación 1:1. Se permitió la gelificación de la muestra por 5 minutos a 4°C. Los "plugs" o insertos obtenidos inmediatamente se sometieron a lisis en buffer de lisis (1M NaCI, 6mM Tris-HCI, pH8.0, 100mM EDTA, pH8.0, 0.5% [peso/vol.] N-lauril sarcocinato de sodio, 0.2% [peso/ vol.] deoxicolato, 0.5% [vol./vol.] tritón X-100, 1mg/mL lisozima) procedimiento que se llevó a cabo durante 24 horas a 37°C. Posteriormente fueron desproteinizados con buffer ESP (l% [peso/vol.] N-lauril sarcocinato de sodio, 500mM EDTA, pH8.0, 1 mg/mL Proteinasa K) durante 48 horas a 50°C. Los restos celulares fueron removidos con lavados sucesivos con buffer TE (10mM Tris-HCI, pH8.0, 1mM EDTA, pH8.0). Los insertos fueron equilibrados en buffer de restricción durante una hora antes de la digestión. La digestión fue llevada a cabo con la endonucleasa de restricción Notl (Amersham Life Science), usando 10U de enzima por cada digestión a 37°C durante 16-18 horas y el buffer recomendado por el proveedor. La electroforesis en gel por campo pulsado se realizó en el sistema Gene Navigator® (Pharmacia LKB), empleando geles de azarosa al 1 % [peso/vol.], TBE 0,5X y usando el siguiente programa de pulsos: 2 segundos durante 4 horas, 4s durante 4h, 8s durante 4h, 16s durante 4h, 32s durante 4h y 70s durante 4h. Se aplicó un voltaje constante de 180V y la temperatura se mantuvo a 12°C. Al final de la electroforesis los geles fueron teñidos en una solución de bromuro de etidio 1 mg/mL, el gel fue digitalizado usando el equipo de documentación de geles GelDoc 2000 (Bio-Rad 1999).
Análisis estadístico Se empleó el programa Quantity One / Discovery Series® (Bio-Rad 1999) para normalizar los geles y estimar el peso molecular de cada macrofragmento de restricción. Para asegurar una correcta comparación entre los diferentes patrones electroforéticos, obtenidos en diferentes geles se evaluó el error ínter e intrageles usando el programa Molecular Fingerprint Analyzer (Stanford Center for Tuberculosis Research, 1998).
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La similaridad entre pares de aislamientos fue medida de acuerdo a la siguiente expresión:
donde dxy es la distancia entre las líneas (aislamientos) x y y, nxy es el número de fragmentos compartidos por las líneas x y y, y nx y ny son el número de fragmentos que presenta cada una de las líneas (Lynch, 1990). El cálculo de esta similaridad se llevó a cabo empleando el programa Molecular Fingerprint Analyzer (Stanford Center for Tuberculosis Research, 1998). A partir de las distancias calculadas se generó un dendrograma, siguiendo el procedimiento UPGMA implementado en el programa MEGA (Kumar et al. 1993). La diversidad genética de la población se estimó de acuerdo con:
donde xj es la frecuencia del i-ésimo tipo (pulsotipo), y n es el numero de tipos. La correspondencia entre variables se examinó a través del análisis múltiple de correspondencias y se empleó para determinar las relaciones entre las diferentes variables categóricas que caracterizan los aislamientos estudiados. Se evaluó el desequilibrio de ligamiento en la población de Vibrio cholerae en Colombia llevando a cabo la prueba g propuesta por Tibayrenc (Tibayrenc, 1995; Tibayrenc, 1996; Tibayrenc 1998), que consiste en medir la correlación entre dos grupos de marcadores independientes, en este caso se emplearon como marcadores genéticos independientes los TE (MLEE, Busta-
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mante, 1999) y los pulsotipos (PFGE, obtenidos en este trabajo). El procedimiento consiste en que, partiendo de las matrices de distancia generadas para cada uno de los marcadores, se calcula el coeficiente de correlación entre ellas (R0). Luego se permutan las filas y las columnas dentro de cada una de las matrices y se recalcula el coeficiente de correlación. Este procedimiento se itera por lo menos 1000 veces, si las matrices originales estaban correlacionadas el efecto perturbador causado por las permutaciones reducirá el coeficiente de correlación. La medida de la significancia es la proporción del número de veces que el coeficiente de correlación original (R0) es excedido por los valores de los coeficientes obtenidos luego de la permutación. Por ejemplo, si se realizan 1000 permutaciones y únicamente uno de los coeficientes permutados excede al coeficiente original, se obtiene una significancia de 0.001, por el contrario, si las matrices no estaban correlacionadas no hay razón para asumir que las permutaciones puedan disminuir el valor del coeficiente de correlación, de hecho pueden incrementarlo. Esta prueba se llevó a cabo con los programas Mantel versión 2.0 (Liedloff, 1999) y Mantel Test versión 1.2.1 (Briers, 1999).
RESULTADOS
Análisis de macrofragmentos En la figura 1 se observa un gel típico obtenido mediante electroforesis en gel por campo pulsado utilizado para la caracterización de los 38 aislamientos del genero Vibrio. Para los análisis sólo se registraron los fragmentos superiores a 20 Kpb. En la tabla 2 se presenta un resumen de los resultados obtenidos de la digestión del genoma de los aislamientos de Vibrio choleras y del aislamiento de Vibrio fluvialis con la enzima de restricción A/ofl. Estos resultados primarios concuerdan con el número y tamaño de los fragmentos generados con Notl reportados para V. Cholerae en otros estudios (Arakawa et al 2000, Khetawat et al. 1998). El tamaño promedio estimado para todos los aislamientos de Vibrio cholerae contemplados en este estudio fue de 2'298.545,5 pb ± 185.827,3 pb. El tamaño del genoma de Vibrio cholerae, reportado recientemente es de 4'033.460 pb (Heidelberg et al. 2000). Existe aproximadamente un 42% de discre-
Figura 1. Fotografía de un gel tipo de Electroforesis en gel por campo pulsado. Fragmentos de restricción generados por Non. Electroforesis 24 h. 12 °C. Pulsos: 2 seg. por 4h; 4 seg. por 4h; 8 seg. por 4h; 16 seg. por 4h¡ 32 seg. por 4h; 70 seg. por 4h.
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pancia entre la estimación del tamaño del genoma de V. cholerae, hecha en este trabajo y el tamaño reportado por Heidelberg et al. (2000) Esta discrepancia puede ser atribuida a que algunas bandas pueden estar constituidas por varios fragmentos de tamaño similar aunque provenientes de diferentes regiones del genoma. Como se observa en la figura 1 la intensidad de las bandas es variable y aquellas que presentan mayor intensidad y amplitud pueden comprender ese tipo de bandas. Esto se ha visto en otros estudios (Khetawat et al. 1998; Trucksis et al. 1998), y se ha demostrado aislando estas bandas y digiriéndolas con diferentes enzimas, de modo que se hace evidente la presencia de más de un fragmento de restricción.
Distancias genéticas y análisis de conglomerados El promedio de bandas diferentes entre pares de aislamientos fue de 7, con un máximo de 17 y un mínimo de 0 (aislamientos idénticos), la mayoría de aislamientos diferían en 5 bandas. La máxima distancia genética fue de 0,36 y la mínima de 0, el promedio de distancia genética fue de 0,18. En la figura 2 se presenta el dendrograma generado según lo descrito en la metodología. En el dendrograma se observa que a una distancia de 0,18 se establecen las diferencias a nivel de especie, ya que a esta distancia se desprende la rama que conduce a Vibrio fluvialis. A una distancia de 0,13 se encontraron dos grupos claramente distinguibles, en el grupo I están todos los aislamientos de la epidemia recuperados de pacientes, y en grupo II están los aislamientos de Brasil y el aislamiento colombiano de origen ambiental.
A una distancia de 0,11, en el grupo I se forman los subgrupos A, B y C, y en el grupo II los subgrupos D y E. El grupo A contiene aproximadamente el 74% del los aislamientos estudiados, le sigue el grupo C con el 10%, luego los grupos B y E cada uno con un 5%. La diversidad genética se estimó sobre los grupos formados a una distancia de 0,05 (línea en la figura 2); se escogió esta distancia por ser el nivel mínimo en el que se mantenía la identidad de los aislamientos de acuerdo con el error en la estimación de los tamaños de los macrofragmentos de restricción (ej. Aislamiento ais-480). De acuerdo con esto la diversidad genética (H) de la población fue 0,95; al calcular la diversidad de tipos electroforéticos (el análogo de la diversidad genética para los pulsotipos) para el mismo grupo de aislamientos pero con los datos de MLEE obtenidos por Bustamante (1999) se obtuvo un valor de 0,92. Estos valores de diversidad indican que existen varios genotipos multilocus y que muchos de estos se presentan aproximadamente con la misma frecuencia. Ambos valores son muy similares, lo que puede indicar procesos especiales a los que están sometidos estos aislamientos. Esta alta diversidad puede ser producto de una estructura genética sexual de forma que es prácticamente posible recuperar todos los genotipos multilocus. Para asegurar esto es necesario evaluar las estimaciones de desequilibrio de ligamiento y el análisis de correspondencias múltiples entre las variables, que vienen a continuación.
Correspondencias entre variables De acuerdo con este análisis se encontró que existe una fuerte correlación entre las características Departamento: San Andrés; Tipo electroforético: 21 (según Bustamante (1999)); Pulsotipo: ll-E-a y Origen: Ambiental. Es interesante esta relación porque indi-
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Figura 2. Dendrograma obtenido a partir de la matriz de distancia de proporción de bandas diferentes entre aislamientos y generado mediante el algoritmo UPGMA. Frente a cada aislamiento se muestra el perfil de macrofragmentos de restricción obtenido.
ca que el genotipo de este aislamiento ambiental es bastante diferente del genotipo patógeno, ya que puede ser distinguido tanto por TE de MLEE, como por el pulsotipo; a pesar de esto es necesario incluir más aislamientos de origen ambiental, recolectados en diferentes épocas y regiones con el fin de asegurar que esta correlación se debe a genotipos diferentes y no a un defecto en el muestreo. A excepción de esta correlación, no existen correlaciones entre las variables con que están caracterizados los aislamientos de V. Cholerae involucrados en la epidemia de cólera en Colombia.
matrices o marcadores correlacionados) con una confiabilidad superior al 99,99%. A partir de este resultado se puede decir que los marcadores no están correlacionados, se establece que no ocurren asociaciones no aleatorias entre alelos de diferentes loci, es decir, no hay ligamiento. Por lo tanto, se puede asegurar que no existe evidencia de desequilibrio de ligamiento. Este resultado, junto al alto valor de diversidad genética, constituye gran evidencia a favor de un alto flujo genético en la población.
Evaluación del desequilibrio de ligamiento
CONCLUSIONES
Los marcadores genéticos independientes empleados fueron el Tipo Eletroforético de MLEE y el pulsotipo obtenido en este estudio. El valor de significancia en la prueba de Mantel (Prueba g de Tibayrenc (1995b)), haciendo 104 permutaciones, fue 0,2956. Además se calculó el coeficiente de correlación estándar que a pesar de que no es perfectamente riguroso ofrece resultados plausibles (Tibayrenc, 1995b) y el valor de este fue de 0,0463 (se esperaría un número cercano a 1 en el caso de
Se determinaron 17 perfiles de macrofragmentos de restricción o pulsotipos. Dos de estos pulsotipos agrupaban a más del 44% de la muestra de aislamientos, a pesar de esto se detectó una gran variabilidad genética (H = 0,95), este valor es similar a algunas medidas de diversidad que se han estimado sobre esta población y el valor alto puede significar la coexistencia de varias cepas o clones diferentes, ya sea porque la epidemia en Colombia fue originada por más de un clon o, en el caso de que fuera origi-
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nada por un único clon, éste ha variado mucho en el tiempo y ha habido un gran nivel de intercambio genético entre todas las variantes. Esta sugerencia está soportada por la falta de evidencia de correlación entre variables y marcadores genéticos, como se pudo ver gracias al análisis múltiple de correspondencias y la prueba de Mantel entre los dos marcadores genéticos Tipo Electroforético y pulsotipo, que indican que se pueden recuperar todos, o casi todos, los genotipos posibles y que no hay asociación entre características genotípicas ni fenotípicas. Esto puede ser interpretado como evidencia de un gran nivel de intercambio genético entre las cepas de Vibrio cholerae que circulan en nuestro país Este resultado contrasta totalmente con lo obtenido por Tamayo (Tamayo et al. 1997; Tamayo, 1998), en ese trabajo la investigadora llegó a la conclusión de que los aislamientos de la epidemia en Colombia tenían un origen clonal, apoyándose en los resultados obtenidos de la ribotipificación; sin embargo, en ese estudio se obtuvo un resultado diferente al estudiar la población con la técnica de polimorfismos de ADN amplificado al azar, con la cual se observaba mayor variabilidad que la sugerida por ribotipificación. En este momento, a pesar de que el presente estudio no contó con los datos brutos del trabajo de Tamayo (1998), se pueden emplear esos resultados como soporte de la hipótesis presentada, ya que tomándolos en conjunto (PFGE, MLEE, ribotipificación y RAPD) estos marcadores ofrecen la misma visión, no están correlacionados, puesto que con cada uno de ellos se llega a conclusiones diferentes (dendrogramas diferentes). Si la estructura genética de esta población fuera clonal, con todos los marcadores empleados se debería llegar a esa conclusión. Ya que esto no está ocurriendo, se sugiere que la población de Vibrio cholerae en Colombia sufre de un fuerte intercambio genético, o exhibe una estructura genética sexual. Este resultado no está en desacuerdo con la propuesta de que la epidemia en Latinoamérica se originó a partir de un único clon, sino que enseña que los factores a los que están sometidos estos microorganismos en Colombia pueden ser diferentes, y que gracias a la genética molecular evolutiva se puede realizar una aproximación rigurosa al conocimiento de sus particularidades en diferentes habitat.
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