CARTOGRAFÍA DE QTL DE LA RESISTENCIA A LA PUDRICIÓN DE LA MAZORCA (Fusarium moniliforme) EN MAÍZ DE VALLES ALTOS, MÉXICO QTL MAPPING OF Fusarium moniliforme EAR ROT RESISTANCE IN HIGHLAND MAIZE, MÉXICO Daisy Pérez-Brito1 , Daniel Jeffers2 , Diego González-de-León2 , Mireille Khairallah2 , Moisés Cortés-Cruz2, Gustavo Velázquez-Cardelas3 , Susana Azpíroz-Rivero3 y Ganesan Srinivasan2 1
Especialidad de Postgrado en Genética. IREGEP. Colegio de Postgraduados. 56230, Montecillo, Estado de México. 2CIMMYT Internacional. Apartado Postal 6-641. México, D. F. 06600, México. (
[email protected]). 3 INIFAP. Apartado Postal 10. 56230, Chapingo, Estado de México.
RESUMEN
ABSTRACT
La pudrición de la mazorca causada por Fusarium moniliforme ocasiona cuantiosas pérdidas en maíces (Zea mays L.) adaptados a los valles altos de México. Los objetivos de este trabajo fueron identificar loci para un carácter cuantitativo (QTL) asociados con la resistencia genética a F. moniliforme, sus posiciones y efectos en el genoma; investigar la consistencia de los QTL medidos en dos poblaciones y considerar su utilización en programas de selección asistida por marcadores moleculares (SAM). Se usaron 149 y 106 marcadores RFLPs para cartografiar dos poblaciones F2 de 238 y 206 individuos, respectivamente, de las cruzas simples entre dos líneas endogámicas de maíz (resistente x susceptible). En las familias F3 se registraron datos del porcentaje de infección de la mazorca, después de la inoculación artificial, en dos localidades del Edo. de México: El Batán y Santa Lucía, durante 1996 y 1997. El análisis de QTL se efectuó con el programa de cartografía de intervalo compuesto combinado. En la Población 1 se detectaron nueve QTL en los Cromosomas 1, 2, 3, 4, 6, 7 y 10 que explicaron 2 entre 30% y 44% de la varianza fenotípica σ f , y siete QTL en la Población 2, sobre los Cromosomas 1, 3, 4, 5, 6 y 7, que explicaron de 11% a 26% de σ2f . Trece de estos QTL mostraron significancia en la interacción QTL x Ambiente. Los tres QTL de los Cromosomas 3 y 6 coincidieron en ambas poblaciones. Por el número y pequeños efectos de los QTL detectados, y por el hecho de que éstos necesitan estar definidos en cada combinación de genotipos, el uso de la SAM para este carácter podría no ser una opción recomendable para aplicarla rutinariamente.
Ear rot, caused by Fusarium moniliforme causes substantial losses in highland maize (Zea mays L.) in México. The objectives of this study were to identify quantitative trait loci (QTL) associated to genetic resistance to F. moniliforme, their positions and effects in the maize genome; investigate the consistency of QTL across two populations and to consider their utilization in a marker-assisted selection program (MAS). Two populations of 238 and 206 F2 individuals derived from single crosses between resistant x susceptible inbred maize lines, were genotyped using 149 and 106 RFLP (restriction fragment length polymorphism) markers, respectively. The F3 families were rated for percent ear infection after artificial inoculation, at two locations in the State of Mexico: El Batán and Santa Lucía, in 1996 and 1997. QTL analyses were conducted using joint composite interval mapping. In Population 1, nine QTL on Chromosomes 1, 2, 3, 4, 6, 7 and 10 explained between 30-44% of the phenotypic 2 variance σ f ; and in Population 2, seven QTL on Chromosomes 1, 3, 4, 5, 6 and 7 explained 11-26% of σ2f . Thirteen of these QTL displayed significant QTL x environment interactions. The three QTL on Chromosomes 3 and 6 coincided in both populations. Due to the number and small effects of the QTL detected, and the fact that QTL mapping is needed in every combination where resistance is to be transferred, we do not recommend MAS for this trait on a routine basis.
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Key words: Fusarium moniliforme, Zea mays, molecular markers, RFLP.
Palabras clave: Fusarium moniliforme, Zea mays, marcadores moleculares, RFLP.
INTRODUCTION
INTRODUCCIÓN
T
he production of maize (Zea mays L.) for grain is affected by many diseases where, Fusarium moniliforme Sheldon (perfect state Gibberella fujikuroi Sawada) ear rot stands out for its effect on grain yield losses. In addition, the ingestion of infected grain can cause severe adverse effects in both humans and animals due to the diverse, potent mycotoxins produced (fumonisins B1 , and B2 and fusarins) (Miller et al., 1995). A high incidence of ear rot occurs in the highland valleys of Mexico, and the situation is similar in other
L
a producción de grano de maíz (Zea mays L.) es afectada por diversas enfermedades; entre éstas destaca, por las pérdidas que ocasiona en el rendimiento, la pudrición de la mazorca causada por Fusarium moniliforme Sheldon (estado perfecto Recibido: Septiembre, 1999. Aprobado: Noviembre, 2000. Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 35: 181-196. 2001. 181
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Gibberella fujikuroi Sawada). Además, la ingestión de granos infectados por este hongo puede provocar afectaciones severas en humanos y animales, causadas por las diversas y potentes micotoxinas que produce (fumonisinas B1 y B 2 y fusarinas) (Miller et al., 1995). En México existe una alta incidencia de la pudrición de la mazorca en maíces de valles altos, y la situación es similar en otros países de América como Bolivia y Perú (Zabalia et al., 1995). Debido a que la resistencia genética es el único método eficaz de combatirla, se necesita buscar fuentes de resistencia a esta enfermedad y transferirla a variedades o líneas de interés. Existen pocos estudios sobre la herencia de la resistencia a F. moniliforme en maíz (Headrick y Pataky, 1989). No se ha encontrado línea inmune alguna y los mecanismos de resistencia no han sido dilucidados, pero se ha observado que la resistencia está influenciada por factores que operan en tejidos de origen materno tales como estilos y pericarpio (Nankam y Pataky, 1996). Para identificar los genes que controlan la resistencia, es preciso conocer el modo de herencia del carácter y encontrar una vía eficiente para incorporar estos genes a genotipos susceptibles. Si la respuesta a los patógenos está bajo el control de muchos loci, es conveniente utilizar marcadores moleculares para minimizar la interferencia ambiental. En CIMMYT se han generado materiales provenientes de los valles altos, que han mostrado resistencia significativa a F. moniliforme, con los que se inició un programa para incrementar el grado de resistencia a este patógeno en líneas con buenas características agronómicas, pero susceptibles (Jeffers et al., 1996). En el presente trabajo se cartografiaron los QTL (iniciales en inglés de “quantitative trait loci”) para la resistencia a la pudrición de mazorca en dos poblaciones que contenían estas fuentes de resistencia. Los objetivos fueron medir el número de QTL asociados con la resistencia genética a Fusarium moniliforme, sus posiciones y efectos en el genoma de maíz; investigar la consistencia de los QTL determinados en dos poblaciones con progenitores de origen diferente; y analizar su posible utilización en programas de selección asistida por marcadores moleculares.
MATERIALES
Y
MÉTODOS
Material genético Las poblaciones cartografiadas se derivaron de dos cruzas entre líneas endogámicas de maíz blanco, semidentado, precoz. Los progenitores femeninos fueron las líneas ‘3’ [B.P.R.L. BA90 39-1-2-#23] y ‘5’ [((CH88R 1296x1297) x (BA8785 MH 10-1-1-4))-1-2-B#1-2] con nivel de endogamia S4 , que tienen una reacción de resistencia ante el patógeno. El progenitor masculino en ambos casos fue la línea ‘18’ [Pob. 800 C5 HC37-2-1-1-2-B] (S5 ) susceptible, pero
Latin American countries including Bolivia and Peru (Zabalia et al., 1995). Since host resistance is the only efficient method for combating this disease it is necessary to identify ear rot resistance sources and transfer the resistance to the lines of interest. There are few studies on the inheritance of resistance to Fusarium moniliforme ear rot in maize (Headrick and Pataky, 1989). No immune sources have been identified nor has the mechanisms of resistance been clearly defined. However, maternal effects operating in the silks and pericarp have been observed to influence resistance (Nankam and Pataky, 1996). To identify and efficiently transfer the genes that control ear rot resistance to susceptible maize genotypes, it is necessary to understand the mode of inheritance of resistance. If host resistance is under the control of many loci, it is convenient to utilize molecular markers in transfering these loci in order to minimize environmental effects. In CIMMYT, highland maize sources of resistance to F. moniliforme ear rot have been developed, and a program was initiated to transfer the resistance to agronomically superior, ear rot susceptible maize (Jeffers, et al., 1996). In the present research, QTL (quantitative trait loci) mapping of resistance to ear rot was carried out in two populations that contained these ear rot resistant sources. The objectives were to determine the number of QTL associated with Fusarium moniliforme ear rot resistance and identify their position and effects in the genome; investigate the consistency of the identified QTL between the two populations with different resistant sources; and analyze the possibility of using the QTL in a markerassisted selection program.
MATERIALS
AND
METHODS
Genetic material The mapping populations were derived from crosses of early white semi-dent inbred lines. The female lines used in the crosses were the S4 inbred lines ‘3’ [B.P.R.L. BA90 39-1-2-#2-3] and ‘5’ [((CH88R 1296x1297) x (BA8785 MH 10-1-1-4))-1-2-B-#1-2] which are resistant to the pathogen. The male parent in both populations was the susceptible S5 line ‘18’ [Pob.800C5 HC37-2-1-1-2-B] with good agronomic characteristics. All three lines are resistant to the most important foliar pathogens in the highlands (Puccinia sorghi and Exserohilum turcicum). In each cross, two F1 ears were used to produce the 238 and 206 F2 individuals in Population 1 (Cross 3 x 18) and Population 2 (Cross 5 x 18), respectively. Later, each F2 plant was self-pollinated to generate the F3 families. RFLP analyses Leaf tissue of parental lines and F2 plants of both crosses was harvested, and genomic DNA was extracted according to Hoisington
PÉREZ-BRITO et al.: QTL DE LA RESISTENCIA A PUDRICIÓN DE MAZORCA EN MAÍZ con buenas características agronómicas. Todos los progenitores son resistentes a las dos enfermedades foliares más importantes de valles altos (Puccinia sorghi y Exserohilum turcicum). En cada cruza se tomaron dos mazorcas de cada F1 , para producir las F2 , que constaron de 238 y 206 individuos para la Población 1 (cruza 3 x 18) y Población 2 (cruza 5 x 18). Posteriormente, cada planta F2 se autofecundó para obtener las familias F3. Análisis de RFLPs Se cosechó tejido foliar de los progenitores y de los individuos F2 de ambas cruzas y el ADN se extrajo de acuerdo con lo descrito por Hoisington et al. (1994). El ADN de los progenitores fue digerido con dos endonucleasas de restricción, EcoRI y HindIII, separado en geles de agarosa a 0.7%, transferidos a membranas de nilón e hibridado con sondas marcadas para detectar polimorfismos. Los clones usados para sondas fueron de ADN genómico y ADNc de maíz de diferentes fuentes (Coe et al., 1995). Las sondas fueron marcadas utilizando el método de quimioluminiscencia, con 2.5% de digoxigenina-dUTP (Hoisington et al., 1994). De las 313 sondas probadas, se eligieron 146 y 106 para el análisis genotípico de las poblaciones F2 de las cruzas 3 x 18 y 5 x 18, respectivamente. Los ADN digeridos con EcoRI o HindIII se hibridaron con cada una de las sondas elegidas. Cada membrana se hibridó con cinco sondas consecutivas, y se realizaron lavados de remoción de sonda a 95 o C entre una sonda y otra (Hoisington et al., 1994). Los datos de segregación fueron capturados y verificados usando el programa HYPERMAPDATA desarrollado en CIMMYT. Ensayos de campo Los experimentos se llevaron a cabo en dos localidades del Edo. de México: la Estación Experimental de CIMMYT, en El Batán, y el Campo Experimental del Valle de México (CEVAMEX), en Santa Lucía, durante los veranos de 1996 y 1997. Las familias F3 se sembraron de acuerdo con un diseño Alfa Látice 01, de 16 x 16 parcelas para la Población 1, y de 15 x 15 para la Población 2, con cuatro repeticiones en el primer año y tres en el segundo. Cada familia se sembró en una parcela, constituida por un surco de 2.5 m. La distancia entre surcos fue de 75 cm, y entre plantas dentro del surco, de 25 cm. En 1997 se sembraron como testigos los progenitores utilizados en el estudio. Desafortunadamente, en 1996 no hubo suficiente semilla del progenitor susceptible (P18) para incluirlo en los ensayos. Cada combinación localidad-año fue considerada como un ambiente. Para evaluar la enfermedad en el campo, se hicieron inoculaciones artificiales en las familias F3 de ambas cruzas, en todos los ambientes. Se utilizó la cepa 591 de F. moniliforme, proveniente de un aislamiento del hongo realizado en la Estación Experimental de CIMMYT en Poza Rica, Edo. de Veracruz, que es la más patogénica del cepario del Laboratorio de Fitopatología de CIMMYT. Esta cepa mostró ser la más apropiada para las condiciones de los valles altos de México, en ensayos previos. El organismo patógeno se cultivó en medio de papadextrosa-agar, y el inóculo se preparó por subcultivo del hongo en frascos con glumas de avena estéril. La suspensión de esporas (5 x 105 esporas mL-1) se preparó en el momento de usarse en el campo. Las
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et al. (1994). Parental DNAs were digested with two restriction enzymes, EcoRI and HindIII, separated in 0.7% agarose gels, transferred onto nylon membranes and hybridizations were performed with labeled probes in order to detect polymorphisms. Clones of genomic DNA and cDNA from different sources were used as probes (Coe et al., 1995). These were labeled with 2.5% digoxigenin-dUTP using the chemiluminescence method (Hoisington et al., 1994). Of 313 probes tested, 146 and 106 probes were selected for the genotypic analyses of the F2 populations from crosses 3 x 18 and 5 x 18, respectively. Digested DNAs with EcoRI or HindIII were hybridized with each one of the selected probes. Five consecutive probes were used on each membrane by strip-washing the first probe at 95 o C before using the next one (Hoisington et al., 1994). Segregation data were captured and verified using HYPERMAPDATA software developed at CIMMYT. Field trials The field trials were carried out during the summers of 1996 and 1997 at two locations in the state of Mexico: the CIMMYT El Batán Experiment Station and the Valle de México Experiment Station (CEVAMEX) in Santa Lucía. A 01 alpha lattice design was used for the field evaluation of the F3 families. The design consisted of 16 x 16 entries for Population 1 and 15 x 15 for Population 2, with four repetitions in the first year and three in the second year. The plot size for evaluating a family was 2.5 m long with an in-row spacing of 25 cm and between row spacing of 75 cm. In 1997, the parents used in developing the populations were used as checks, but in 1996 there was not enough seed of the susceptible parent (P18) to include in the trials. Each location x year combination was considered a distinct environment. Artificial inoculations were used for the evaluation of the F3 families of both populations at all environments. The F. moniliforme isolate 591 originally obtained from an infected plant at the Poza Rica Experiment Station, state of Veracruz, was used in the evaluations. This is the most pathogenic isolate used in evaluations including those in highland environments of Mexico. The pathogen was cultured on potato dextrose agar with subsequent sub-culturing on sterilized oat glumes in jars for the production of field inoculum. A spore suspension of 5 x 10 5 spores/ml was prepared at the time of field inoculations. The plants were inoculated using the sponge and nail-punch technique (Drepper and Renfro, 1990) where the husk leaves in the middle of the ear were punctured to introduce the inoculum seven days after female flowering (Jeffers et al., 1996). At harvest, the inoculated ears were evaluated individually based on a severity scale representing the percentage of infection. A 1-6 scale was used with 1=0%, 2=1-10%, 3=11-25%, 4=26-50%, 5=51-75% and 6=76-100% infection of the ear (Jeffers et al., 1996). The number of ears harvested for each F 3 family was recorded (NMT), the number of ears in each division of the classification (i) was noted (Mgi); and then weighted ear rot ratings were calculated (MP) using the following formula:
MP =
dbMG 2× 0.1g+ bMG 3×0.25g+b MG 4×0.5g+ bMG 5×0.75g+b MG 6×1gi ×100 NMT
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inoculaciones se hicieron a través de las brácteas de la mazorca, en la parte media de la misma, siete días después de la floración femenina (Jeffers et al., 1996), mediante la técnica de punzón con esponja (Drepper y Renfro, 1990). A la cosecha, las mazorcas inoculadas se evaluaron individualmente con base en una escala de severidad de la infección basada en el porcentaje del área de la mazorca que estaba infectada. Esta escala consta de 1 a 6 grados, donde: 1=0%, 2=1 a 10%, 3=11 a 25%, 4=26 a 50%, 5=51 a 75% y 6=76 a 100% (Jeffers et al., 1996). En cada unidad experimental se registró el número de mazorcas total por familia F3 (NMT) y de éstas el número de mazorcas clasificadas en cada grado (i) de la escala (MGi); luego se calcularon las medias ponderadas (MP) de la severidad de la enfermedad, mediante la siguiente ecuación:
MP =
dbMG 2× 0.1g+ bMG 3×0.25g+b MG 4×0.5g+ bMG 5×0.75g+b MG 6×1gi ×100 NMT
Para el cálculo de las medias ponderadas, no se consideraron parcelas en las que el número de mazorcas total fuera menor que tres. Análisis de los datos Datos genotípicos La segregación de cada locus marcador en las progenies F2 de ambas cruzas, se analizó mediante pruebas de χ2 para detectar desviaciones en la segregación mendeliana esperada. Los cartogramas de ligamiento RFLPs se hicieron utilizando el programa MAPMAKER (Lander et al., 1987). Para declarar que existía ligamiento significativo entre dos marcadores, se fijaron los umbrales de LOD (log10 de máxima probabilidad de ligamiento entre dos estimaciones) en 3.0, y la frecuencia de recombinación máxima, en 0.4. Las distancias entre marcadores en el cartograma genético se estimaron con las frecuencias de recombinación y se transformaron en centimorgans (cM), usando la función cartográfica de Haldane. Como referencia para localizar los loci, se usaron los cartogramas genómicos de maíz de la Universidad de Missouri y del Brookhaven National Laboratory disponibles en la base electrónica . Datos fenotípicos Se utilizaron los datos fenotípicos de la severidad de la enfermedad (% de infección) de cada familia F3 (medias ponderadas de las repeticiones), tomados en cada ambiente. Se hicieron análisis de varianza mediante SAS (1988) y se estimaron los componentes de la varianza: σ2g (varianza genética), σ2gxa (varianza de la interacción genotipo x ambiente), σ2f (varianza fenotípica). Las heredabilidades en sentido estrecho (h 2 ) se calcularon con la fórmula de Hallauer y Miranda (1988): h 2 =
σ 2g 1 1 σ2g + σ 2gxa + σ2e a ar
, donde σ2e es la varianza
Weighted ear rot ratings were not calculated for plots with less than three ears. Data Analyses Genotypic data Segregation at each marker locus in both F2 populations was checked for deviations from expected Mendelian segregation ratios using standard χ2 test. RFLP linkage maps were constructed using the software package MAPMAKER (Lander et al., 1987). Linkage between two markers was declared significant when the LOD score (log 10 of the likelihood odds ratio) exceeded the threshold of 3.0, and the maximum recombination frequency was 0.4. Distances between markers in the genetic map were estimated by recombination frequencies and transformed into centiMorgans (cM) using Haldane’s mapping function. The genetic maps from the University of Missouri and Brookhaven National Laboratory were used as references for the location of marker loci. These maps are available in . Phenotypic data Disease severity ratings (infection percentage) of each F3 family (adjusted means over replications) in each environment were used. Analyses of variance were performed using SAS (1988) and the components of variance were estimated: σ2g (genetic variance), σ2gxa (genotype x environment interaction variance) σ2f (phenotypic variance). Narrow-sense heritabilities (h 2 ) were calculated based on Hallauer and Miranda (1988): h 2 =
σ 2g 1 1 σ2g + σ 2gxa + σ2e a ar
where σ2e is the residual variance, a: number of environments and r: number of replications within each environment. Spearman’s correlation coefficients were calculated (SAS, 1988) in order to compare the response to the disease in the distinct environments studied. QTL determination Genotypic and phenotypic data from the two populations in the four environments were used to map QTL. Data were analyzed using the method of Composite Interval Mapping (CIM) proposed by Jansen and Stam (1994) and Zeng (1994) and modified by Jiang and Zeng (1995) in order to make a joint analysis of multiple environments. The hypothesis for declaring the presence of a QTL used four variants of the model as described by Bohn et al., (1996): 1) Model I, Simple Interval Mapping (SIM) (Lander and Botstein, 1989; Zeng, 1994) in order to select unlinked cofactors; 2) Model II, Composite Interval Mapping, with unlinked markers as cofactors (Zeng, 1994);
PÉREZ-BRITO et al.: QTL DE LA RESISTENCIA A PUDRICIÓN DE MAZORCA EN MAÍZ residual; a, el número de ambientes; y r, el número de repeticiones dentro del ambiente. Se calcularon los coeficientes de correlación de Spearman (SAS, 1988), para conocer la similitud en la respuesta a la enfermedad en los distintos ambientes estudiados. Determinación de QTL Se usaron los datos genotípicos y fenotípicos obtenidos en las dos poblaciones, en los cuatro ambientes. Los datos se correlacionaron mediante el programa de Cartografía de Intervalos Compuestos (CIM) propuesto por Jansen y Stam (1994) y Zeng (1994), y modificado por Jiang y Zeng (1995), para conformar un análisis combinado de ambientes múltiples. La hipótesis para la presencia de un QTL se evaluó usando cuatro variantes del modelo descrito en Bohn et al. (1996): 1) Modelo I, Cartografía de Intervalo Simple (SIM) (Lander y Botstein, 1989; Zeng, 1994) para la selección de los cofactores no ligados; 2) Modelo II, Cartografía de Intervalo Compuesto, con marcadores no ligados como cofactores (Zeng, 1994); 3) Modelo III, Cartografía de Intervalo Compuesto, con marcadores seleccionados como cofactores y dos marcadores flanqueando el intervalo bajo prueba, en un tamaño de intervalo de 30 cM (Zeng, 1994); y 4) Modelo IV, al Modelo III se le varió el tamaño de intervalo a 20 cM. Se consideró que existía un QTL donde quiera que las proporciones de máxima verosimilitud (LR, iniciales en inglés de “Likelihood Ratio”) fueron significativas, en el análisis separado para un ambiente o en el análisis combinado; pero esta significancia tenía que manifestarse en al menos dos de los modelos (y que uno de ellos fuera el Modelo III). Para detectar los QTL se consideraron tres grados de libertad (por ser una población F2 ), y por lo tanto los valores críticos de α para el cálculo de LR fueron de 0.009 y 0.003 para LOD=2.5 y 3.0, respectivamente (Cuadro 1). Los valores críticos para la prueba de significancia en el cálculo de la interacción QTL x Ambiente para cuatro ambientes fueron: LR=9.48 (χ2 0.05 ) y LR=13.28 (χ2 0.01 ) y para tres: LR=7.81 (χ2 0.05 ) y LR=11.34 (χ20.01 ). También se calcularon los valores de aditividad y dominancia para cada QTL obtenido con el Modelo III. Los valores negativos en los efectos aditivos estimados, significan que el efecto de sustitución de un alelo B del progenitor susceptible por un alelo A del resistente, tiende a reducir la severidad de la infección en ese locus. Por su parte, los valores negativos en los estimados de dominancia indican que el promedio de los heterocigotes (AB) reduce la severidad de la enfermedad en comparación con la media de los dos homocigotes (AA y BB). El tipo de acción génica para los QTL detectados se analizó mediante el cálculo de la proporción de dominancia (DR) propuesta por Stuber et al. (1987), en la cual DR=d/a y se considera aditiva para DR
