Revista Argentina de Microbiología (2003) 35: 69-73 – ISSN 0325-7541
Análisis retrospectivo de casos con diagnóstico de necrosis cerebrocortical y su relación con herpesvirus bovino tipo 5 S. E. PÉREZ1, A. VAGNOZZI2, J. H. SUR3, E. ODRIOZOLA1, C. M. CAMPERO1, A. C. ODEÓN1* 1
. INTA EEA Balcarce, Patología Veterinaria. C.C. 276. Balcarce, (7620), Provincia de Buenos Aires., Argentina. 2 INTA CICVyA Castelar. C.C. 77. Morón (1078), Bs. As., Argentina; 3 Plum Island Animal Disease Center, Agricultural Research Service, US Dept. of Agriculture, Greenport, NY 11944, USA. Correspondencia: Fax 02266 439101 – CE:
[email protected] RESUMEN
A los fines de establecer la asociación entre herpesvirus bovino tipo-5 (HVB-5) y la necrosis cerebrocortical (NCC) se analizaron 89 casos bovinos de tres regiones de Buenos Aires registrados entre 1970-1999. El tejido nervioso fue teñido con hematoxilinaeosina o hibridización in situ para cADN-BHV-5. Las lesiones se clasificaron en una escala subjetiva de 0–3. La mayor prevalencia fue entre 1979-1984, principalmente en primavera, no existiendo diferencias (P >0,05) en las tasas de morbilidad y mortalidad entre grupos etarios, sexo, raza, sistemas de producción y regiones. Amaurosis (48%), ptialismo (42%), torneo (40%), ataxia (36%) y bruxismo (37%) fueron los síntomas más observados. Las lesiones estuvieron distribuidas en corteza anterior y posterior (90,6%) y diencéfalo (36,5%). Meningitis y manguitos perivasculares (94,4%) y gliosis difusa (77,5%) o focal (73%) fueron los hallazgos predominantes en el cerebro. Se observaron focos de necrosis en el 66,6% de los casos. HVB-5 fue aislado en 9/19 casos a partir de 1992 y cADN-HVB-5 fue detectado en 3/9 casos. La identificación viral en casos con lesiones severas resultó negativa. La correspondencia de NCC con aislamiento viral de bovinos con similares características clínico-epidemiológicas permiten concluir entre la asociación del HVB-5 y lesiones de NCC. PALABRAS CLAVE: necrosis cerebrocortical, polioencefalomalacia, herpesvirus bovino tipo 5, hibridización in situ.
SUMMARY A retrospective study of archive cases of cerebrocortical necrosis and their relationship with bovine herpesvirus type 5. In order to demonstrate the association of Bovine Herpesvirus Type 5 (BHV-5) and cerebrocortical necrosis (CCN) 89 cases of cattle from three regions of Buenos Aires Province, Argentina registered between 1970-1999 were examined. H&E staining and BHV-5 in situ hybridization were performed on paraffin-embedded neural tissues. The severity of microscopic lesions was scored according to a 0-3 scale. Morbidity, mortality and lethality rates between groups of age and regions were determined. The highest prevalence of CCN was detected between 1979 and 1984, particularly during the spring. Differences in morbidity and mortality rates between groups of age and regions were not detected (P >0,05). Amaurosis (48%), ptyalism (42%), circling (40%), ataxia (36%) and bruxism (37%) were frequently observed. Lesions were predominantly found on anterior and posterior cortex (90.6%) and diencephalon (36.5%). Meningitis and perivascular cuffing (94.4%) and focal (78%) or diffuse (73%) gliosis were the predominant in cerebrum. Focal necrosis was observed in 66.6% of cases. BHV-5 was isolated from 9/19 cases since 1992 and BHV-5 DNA was detected by in situ hybridization in 3/9 cases. No virus was identified in brain tissues with severe lesions. These findings indicate the association of BHV-5 in neurological disease previously reported as CCN. KEYWORDS: cerebrocortical necrosis, polioencefalomalacia, bovine herpesvirus type 5, in situ hybridization.
INTRODUCCIÓN La necrosis cerebrocortical (NCC), o polioencefalomalacia (PEM), es una entidad patológica de los rumiantes inicialmente descripta en los EE.UU. en 1956 (12, 14). Desde entonces, dicha entidad patológica ha sido atribuida a varios agentes y condiciones que incluyen deficiencia o intoxicación por selenio, micotoxicosis, deficiencia de cobalto, intoxicación hídrica y aumento de tiaminasas ruminales, o deficiencia de tiamina (12). Más recientemente, otras causas tales como altos niveles de sulfatos intraruminales y exceso de consumo de azufre, sin evidencia de deficiencia de tiamina, también han sido relacionados con NCC (15). En 1962 fueron descriptos brotes fatales de encefalitis necrotizante en ganado bovino en Australia debido a causas virales. Primeramente se definió al agente como virus de la encefalitis bovina (10), aunque posteriormente se lo reclasificó como herpesvirus
bovino (2). Brotes fatales de meningoencefalitis necrotizante han sido descriptos en áreas geográficas definidas de América del Sur, con presentación esporádica en otras partes del mundo. En 1982 fue descripto por primera vez en Argentina un brote de encefalitis en terneros (5). La observación de cuerpos de inclusión en neuronas y en células gliales y la identificación por microscopía electrónica de estructuras similares a herpesvirus, confirmó la etiología viral de la enfermedad (6, 7). Estudios posteriores establecieron que las cepas argentinas de herpesvirus con marcado potencial neuropatogénico, representaban una variante del herpesvirus bovino (HVB) tipo 1, inicialmente designadas como HVB-1.3 y luego clasificadas como HVB-5 (22). Previo al aislamiento de HVB-5, en 1982, la mayoría de los casos de NCC registrados en la Provincia de Buenos Aires, Argentina, fueron diagnosticados como un posible desorden nutricional
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o metabólico. Considerando que actualmente HVB-5 está relacionado con numerosos casos de NCC, se propone el presente estudio retrospectivo de casos de encefalitis en bovinos cuyo objetivo es caracterizar las lesiones histopatológicas y demostrar su posible asociación con HVB-5. MATERIALES Y MÉTODOS Muestras Fueron estudiados 89 casos neurológicos en bovinos con diagnóstico de PEM recibidos por el Servicio de Diagnóstico Veterinario Especializado (SDVE), del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) en Balcarce, Argentina. Las muestras provenían de las zonas de la cuenca del río Salado, sudeste y oeste de la Provincia de Buenos Aires y fueron recibidas entre 1970 y 1999. Los sistemas de producción bovina de donde se originaron los casos se caracterizan por engorde semi-intensivo del ganado en pasturas cultivadas (oeste y sudeste) y por cría extensiva en campo natural (cuenca del río Salado). Histopatología Fueron evaluados microscópicamente los tejidos archivados de los 89 casos. Las muestras de tejido nervioso fueron fijadas en formol tamponado al 10%, incluidas en parafina, procesadas y teñidas con hematoxilina-eosina según métodos estándares. Las secciones analizadas fueron corteza anterior y posterior, médula, puente y diencéfalo. Cuando fue factible, el ganglio trigémino también fue evaluado. La severidad de las lesiones microscópicas de cada sección del cerebro fue cuantificada por una escala de 0 a 3 según la severidad de las mismas. Se consideró como grado 0 cuando no se observaron lesiones; grado 1 (mínimo) cuando se detectaron pocas neuronas con necrosis isquémica, satelitosis y gliosis mínima; grado 2 (moderado) cuando se observó necrosis de neuronas, neuronofagia, gliosis focal, manguitos perivasculares y necrosis y edema en el neuropilo y grado 3 (severo) cuando predominaban la necrosis extensiva del tejido nervioso, gliosis difusa o multifocal, presencia de células de Gitter y hemorragias. Prueba de hibridización in situ (ISH) Muestras del sistema nervioso central (SNC) de 9 casos correspondientes a los períodos 1972-1983, 1984-1992 y 1993-1999, representativas de cada uno de los grados de severidad, fueron evaluadas para detección de cADN de HVB-5 mediante una la técnica de ISH previamente descripta (23). Una sonda preparada por digestión con BamHI/AflII de un plásmido pGEM3Z conteniendo el fragmento que codifica gC de HVB-5, 1,7 Kb, fue purificada en gel y marcada con digoxigenina-dUTP (Boehringer Mannheim Corp.) por nick-translation. Secciones del SNC fueron desparafinadas, hidratadas, digeridas con proteinasa K (Gibco BRL Life Technologies, Inc.), fijadas en 4% de paraformaldehido, lavadas e incubadas en una mezcla de prehibridización. Previo a su empleo, la sonda marcada fue diluida en la
mezcla de prehibridización, desnaturalizada a 95 °C y enfriada en hielo. Los portaobjetos con las secciones del SNC fueron incubados con la sonda durante 12 h a 37 °C. EL ADN hibridizado fue detectado con un conjugado DIG-fosfatasa alcalina con sal de nitroblue tetrazolium (Sigma Chemical Co.) como substrato coloreado. El contrateñido fue realizado con verde de metilo. Aislamiento viral El cultivo para aislamiento viral fue factible de realizarse en los 19 casos recibidos por el SDVE a partir de 1992. Alícuotas de muestras de tejido nervioso central fueron cultivadas en células MDBK con medio MEM-Hank’s con suero fetal bovino. La presencia de HVB fue detectada por efecto citopático y confirmada mediante inmunofluorescencia directa (IFD), empleándose un antisuero policlonal conjugado con fluoresceína, siguiendo las instrucciones del fabricante (American BioResearch). En caso de no observarse efecto citopático se efectuaron cuatro pasajes ciegos previo a la IFD. Análisis estadístico La severidad de las lesiones microscópicas fue analizada por la prueba de Kruskal Wallis para datos no-paramétricos (análisis de variancia en un sentido por rango). Las medias fueron comparadas por el método de Tukey Kramer (SAS, Release 6.03. SAS Institute Inc.). La morbilidad, mortalidad y letalidad de acuerdo a la edad del caso y la región del SNC afectado fueron determinadas comparándose las medias mediante el empleo de la prueba de Tukey Kramer. Para todos los análisis se fijó un criterio de significancia de P < 0,05. RESULTADOS Casos de poliencefalomalacia, o necrosis cerebrocortical La mayor ocurrencia de casos (62) con diagnóstico de PEM recibidos por el SDVE fue entre 1970 a 1978, con un máximo de 12 casos en 1972. No se efectuaron diagnósticos de PEM entre 1979 y 1984 y se observó una disminución en el número de casos en el período 1985-1999 (27 casos). Cuarenta y seis casos (51,7%) fueron registrados en la región del sudeste de la provincia de Buenos Aires, 29 casos (32,6%) de la cuenca del río Salado y 14 (15,7%) provenían de la zona oeste. La ocurrencia de la enfermedad fue mayor en primavera (38 casos, 43%), mientras que en el verano sólo se registraron 8 casos (9%). Los casos de NCC fueron más frecuentemente observados en animales de 13-18 meses de vida (40,4%) y de 7-12 meses (33,7%), aunque no se observaron diferencias significativas entre categoría, sexo o raza (P > 0,05). La prevalencia fue más alta (55%) en animales en engorde que en hatos de cría (45%). En la región de la cuenca del río Salado se registraron brotes con mayor morbilidad (10%), mortalidad (6,8%) y
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letalidad (82%); sin embargo, no se detectaron diferencias (P > 0,05) con las otras regiones. Cuadro clínico Los síntomas más frecuentemente observados fueron amaurosis (48%), ptialismo (42%), torneo (40%), ataxia (36%) y bruxismo (37%). La presencia de temblores musculares y opistótonos no fueron manifestaciones clínicas comunes, mientras que anorexia y decúbito fueron observados en los estadios finales de la enfermedad. La temperatura corporal promedio fue 39,5 °C (rango de 37,6 °C a 41,7 °C), registrándose también casos clínicos de la enfermedad afebriles. El curso promedio de la enfermedad hasta la muerte fue de 7 días, con un máximo de 20 días. Patología La lesión macroscópica más comúnmente observada fue el reblandecimiento de la corteza frontal del cerebro. Los lóbulos occipitales estuvieron frecuentemente afectados observándose también lesiones focales en el núcleo basal. Generalmente estas lesiones tuvieron una distribución simétrica del área afectada. Dichas zonas presentaban coloración amarillenta y en la mayoría de los casos, con malacia del tejido nervioso. Las meninges se observaron con áreas focales de congestión y/o hemorragia, que generalmente tenían similar distribución que las lesiones corticales. Ocasionalmente, se observó un exceso de líquido cefaloraquídeo opalescente al diseccionar el SNC. Los principales hallazgos microscópicos fueron meningitis no supurativa (con infiltrado de linfocitos, células plasmáticas y monocitos), presencia de manguitos perivasculares mononucleares, necrosis, gliosis focal y difusa,
neuronofagia, satelitosis, edema y hemorragias. La presencia de células de Gitter fue un hallazgo constante en las áreas de necrosis. Las lesiones estuvieron principalmente distribuidas en la corteza anterior y posterior (90,6%) y diencéfalo (36,5%). Secciones de la médula oblonga, puente y ganglio trigémino estuvieron disponibles en pocos de los casos analizados en el presente trabajo. De dichos tejidos, sólo 17% y 12,5% de los mismos, respectivamente, tenían lesiones microscópicas. Las lesiones observadas en la corteza anterior y posterior fueron más severas (P < 0,05) que las lesiones presentes en otras secciones del SNC. En la médula oblonga y puente, las lesiones no fueron severas y tampoco difirieron (P > 0,05) de las observadas en la zona del ganglio trigémino (Cuadro 1). Los hallazgos microscópicos predominantes del cerebro fueron meningitis y manguitos mononucleares perivasculares (94,4%) (P < 0,05), gliosis difusa o focal (77,5% y 73%, respectivamente). Se observaron focos de necrosis en el 66,6% de los casos. Aunque dicha lesión fue una alteración patológica severa, ésta no difirió (P > 0,05) al compararse la severidad con respecto a la gliosis, neuronofagia y satelitosis. Las hemorragias cerebrales tuvieron el menor grado de severidad (Cuadro 2). Aislamiento viral e hibridización in situ En 9/19 casos (47,4%) procesados por el SDVE desde 1992 y evaluados para aislamiento viral fue posible demostrar la presencia de herpesvirus bovino (Cuadro 3). Mediante la técnica de ISH realizada en cortes previamente incluidos en parafina para la detección de cDNA de BHV-5 de los 9 casos de archivo se detectaron 3 casos positivos (Figura 1).
Cuadro 1. Número y porcentaje de secciones de tejido nervioso con lesiones de necrosis cerebrocortical y promedio de la severidad de las lesiones en cada sección (n=89) Secciones del sistema nervioso Corteza Médula y Diencéfalo Ganglio puente trigémino Número secciones 85 35 85 32 Secciones con lesiones 77 6 31 4 Porcentaje 90,6 17,1 36,5 12,5 Promedio de severidad 1,38 a 0,09 b 0,43 c 0,07 b (±0,91) (±0,36) (±0,64) (±0,37) Promedios con la misma letra indican diferencias no significativas (P > 0,05)
Cuadro 2. Frecuencia de presentación y promedio de severidad de las lesiones microscópicas del tejido nervioso de ganado bovino con lesiones de necrosis cerebrocortical (n=89) Lesiones microscópicas* en el tejido nervioso
Número de casos Porcentaje (%) Promedio de severidad
MNG
MPV
Malacia
GF
GD
NEU/SAT
HEM
84 94,4 1,95a (±0,86)
84 94,4 1,91a (±0,78)
59 66,6 1,38b (±1,23)
65 73 0,94c (±0,73)
69 77,5 1,15 b, c (±0,81)
59 66,3 1,03b, c (±0,91)
8 9 0,12d (±0,42)
*MNG: meningitis, MPV: manguitos perivasculares, GF: gliosis focal, GD: gliosis difusa, NEU/SAT: neuronofagia y satelitosis, HEM: hemorragias. Promedios con la misma letra indican diferencias no significativas (P > 0,05)
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Cuadro 3. Resultados de aislamiento viral y detección de cADN de HVB-5 en tejido nervioso en lesiones con distinta severidad y en diferentes períodos Período Número de Severidad Aislamiento ISH casos de la lesión viral* cADN HVB5 + 1 1 NR 1972-1982 + 1 2 NR 1 3 NR 1 1 NR 1983-1992 + 1 2 NR 1 3 NR 6 1 + (6) - (1) 1993-1999 + (3) - (1) 6 2 - (6) - (1) 6 3 NR: no realizado. * = Aislamiento viral e ISH fueron realizados en casos diferentes. El número entre paréntesis indica la cantidad de casos.
Las muestras con lesiones severas (grado 3) evaluadas para aislamiento viral o ISH resultaron negativas (Cuadro 3).
Figura 1. Detección de herpesvirus bovino tipo 5 mediante hibridización in situ de cADN en una sección de tejido nervioso.
DISCUSIÓN Hasta principios de la década de 1980, la mayoría de los casos de PEM en Argentina estaban relacionados con una causa metabólica por la posible presencia de tiaminasas en la ingesta o en el contenido ruminal. Posteriormente, se identificó HVB-5 en casos de NCC en terneros (5) y se demostró que el virus era capaz de inducir infección primaria aguda (4, 9, 17), e infecciones latentes y reactivación viral (21) con cuadros de encefalitis necrotizante. Por otra parte, recientemente han sido relacionados altos niveles de azufre y/o sulfatos en la dieta con NCC en bovinos (12, 15). Estas observaciones indican la importancia de la apropiada evaluación epidemiológica, clínica y patológica de dichos casos y de la aplicación de métodos de laboratorio adecuados para llegar al diagnóstico etiológico de la PEM. El análisis de los signos clínicos de los casos del presente estudio, revela que apatía, ptialismo, bruxismo (rechinamiento de dientes),
incoordinación y marcha en círculos, son compatibles con los signos más frecuentemente descriptos en la encefalitis causada por HVB-5 (4, 13, 16). También y en coincidencia con datos de algunos casos registrados en este trabajo, se ha observado que la fase clínica de la infección causada por HVB-5 suele ser afebril (2); por lo tanto, la ausencia de fiebre no excluiría la infección viral. Aunque en las reproducciones experimentales con HVB-5 generalmente no se mencionan lesiones macroscópicas relevantes (4, 18), la malacia de la zona frontal suele ser la lesión cerebral predominante asociada con la infección de HVB-5 (11, 16, 21). Los resultados de este estudio concuerdan con dichas observaciones ya que se determinó que la corteza frontal es el sitio donde más frecuentemente y con mayor severidad se hallan lesiones macroscópicas asociadas a HVB-5. Asimismo, las alteraciones histológicas (meningitis no supurativa, manguitos perivasculares mononucleares, neuronofagia, satelitosis y gliosis) de los casos aquí presentados también coinciden con las descripciones de otros autores en casos de encefalitis herpética bovina (3-6, 8, 9, 18-20). Los herpesvirus multiplican rápidamente y producen efecto citopático en cultivos celulares (13); sin embargo, el aislamiento viral cómo método de diagnóstico en casos de encefalitis tendría baja sensibilidad (3, 5, 8, 21). Belknap y col. (4) determinaron títulos bajos (< 2 x 103 DICC50/ml) a moderados (2 x 103 a 2 x 105 DICC50/ml) del virus para distintos sectores del SNC, lo cual sugiere que la concentración viral alcanzada no sería suficiente para lograr el aislamiento. Otros factores, tales como la inadecuada manipulación de las muestras obtenidas para diagnóstico y la autólisis post-mortem conducirían a la degradación viral dificultando el aislamiento (1). Estos factores, presentes en muchos de los casos analizados en este estudio, explicarían la baja sensibilidad del aislamiento viral. Por otra parte, considerando que cuando se detectaron lesiones severas (grado 3) del SNC no fue posible el aislamiento de HVB-5 ni la identificación de su ADN, podría especularse que la causa de dichos casos fue de origen metabólico o nutricional. Esta presunción
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adquiere relevancia cuando la epidemiología de los brotes estudiados (alta incidencia, cambios bruscos en la dieta, elevada tasa de ataque, moderada letalidad, etc.) así lo sugiere. Debido a las dificultades para el aislamiento del HVB, nuevos métodos biomoleculares surgen como una alternativa necesaria para clarificar el diagnóstico. Un ejemplo de ello fue la aplicación de la técnica de ISH de cADN que, aunque limitada por el número de muestras procesadas, permitió establecer la presencia de HVB-5 en el tejido nervioso bovino con lesiones leves y moderadas de NCC de casos registrados previo a la identificación del virus como responsable de tal lesión. El presente estudio, en el que se analizaron casos neurológicos de bovinos de una importante región ganadera de Argentina en un período de 28 años, ha posibilitado caracterizar una entidad cuya etiología generalmente permanecía indeterminada.
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Agradecimientos: Los autores agradecen a los colegas de Servicio de Diagnóstico Veterinario Especializado que contribuyeron con este estudio. 16.
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Recibido: 2/10/02 – Revisado: 18/03/03
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